A rendőrség keresi a tettest Az ügy: Police released surveillance image of the suspect. A rendőrség keresi azt a személyt, aki hétfőn reggel betört az Intézetbe és dulakodás közben több késsel megölt egy orvostanhallgatót. Szúrásnyomok láthatóak a hát, a nyak és a has területén. A gyilkos eszköz nem került elő. A gyanúsítottról fényképet rögzített a biztonsági kamera: a kb. 25 éves feltehetőleg férfi 180-190 cm magas, szürke farmert, sötét kapucnis pulóvert és maszkot viselt Az ilyen kegyetlen gyilkosoknak nem kegyelmeznék mondta a biztonsági őr, aki kora reggel rátalált a vérbefagyott áldozat testére. Az eset, ami azután történt, hogy 1 héttel korábban egy diáklányt erőszakoltak meg, majd megöltek és testét az út mellé dobták, igen felkavarta a város lakóinak kedélyeit. A feladat: A sorozatgyilkost 3 gyanúsított közül keresi a rendőrség. A feladatod, hogy megállapítsd melyik gyanúsítottnak a DNS mintája található a legutóbbi gyilkosság helyszínén!
az emberek hazudnak, de a bizonyítékok nem Bizonyítékok típusai: - indirekt (pl. fotó) - direkt (pl. haj) - hideg nyom (textil) - forró nyom (DNS)
A gyakorlat: 0. mintagyűjtés a helyszínen 1. DNS extrakció 2. DNS amplifikáció (PCR) 3. DNS festés (gél elektroforézis) 4. Minták összevetése
Biológiai minták, mint bizonyítékok Vér ondó nyál vizelet haj fog csont szövet VÉR: 3ul elegendő DNS kivonáshoz
SZERVES DNS-extrakció protokollok SZŰRŐPAPÍR vér SDS, DTT, EDTA proteinase K vér CHELEX víz Vér beszárítása a speciális szűrőpapíron INKUBÁLÁS (56 o C) VORTEX Phenol, chloroform, isoamyl alcohol Vizes fázis új csőbe CENTRIFUGÁLÁS CENTRIFUGÁLÁS TE puffer DNS KONCENTRÁLÁS (ethanol precipitation) CENTRIFUGÁLÁS INKUBÁLÁS CENTRIFUGÁLÁS Felülúszó ELTÁVOLÍTÁSA 5% Chelex INKUBÁLÁS (56 o C) INKUBÁLÁS(100 o C) Centrifuge lyukasztás Mosás extrakciós pufferben Felülúszó ELTÁVOLÍTÁSA PCR Reagensek DNS cc mérés nélkül PCR végrehajtása DNS cc. DNS cc. mérés mérés PCR PCR végrehajtása végrehajtása Figure 3.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
1. feladat: DNS preparálás lymphocytákból minta: vérfoltos textil darab egy vérfoltot steril ollóval elfelezni, csipesszel Eppendorf-csőbe tenni pipettázz 1000 ul steril vizet a mintához vortex pár perc inkubálás szobahőn vortex centrifugálás 1500 rpm-el, 2 perc ig 950 ul leszív, eldob a textilmintához 150 ul 1% Chelex oldat + 50 ul ProtK pipettázása 5 percig inkubálni kézmelegben vortex 65 C o 2 perc, ProtK inaktiválás jégen tárolni
2. PCR 5 ul DNS mintához PCR komponensek: 26,5 ul víz 5 ul puffer mix 2,5 ul primer F 2,5 ul primer R 5 ul dntp Mix 2,5 ul MgCl 2 utoljára: 1 ul ultra Fast DNS Polimeráz enzim (jégen tárolva).
PCR Program: CSI 1. 95 C o 2 min 2. 95 C o 10 sec 3. 55 C o 15 sec 4. 72 C o 20 sec 30x: ciklus 2-4 ismétlése 1 min 72 C o 4 C o (összesen kb. 30 min)
Mik a PCR lépései?
Személyazonosság kérdése (DNS-Ujjlenyomat) Törvényszéki esetek gyanúsított és bizonyíték egyezés bizonyítása Apasági teszt (mater semper certa est pater nunquam) Tömegkatasztrófa esetek Történelmi sírok azonosítása Eltűnt személyek azonosítása Katonai DNS-dögcédula Elkövetők DNS adatbázisának létrehozása Ugyanazok az STR markerek (short tandem repeat) használhatóak
Forensic Sciences 1. Igazságügyi Pszichiátria 2. Igazságügyi Pathológia 3. Igazságügyi Toxikológia 4. Igazságügyi Kriminalisztika 5. Igazságügyi Rovartan 6. Igazságügyi Fogászat 7. Igazságügyi Epidemiológia stb.
Igazságügyi Rovartan: A Magyarországon előforduló légyfajok fejlődésének üteme holttesten: (Schranz Dénes nyomán) lárva növekedési ideje Házilégy petéje kikel: 10-12 óra múlva Kék dongólégy petéje kikel: 12-16 óra múlva Smaragd légy petéje kikel: 12-16 óra múlva Húslégy petéje azonnal mozog (vivipara) Sajtlégy petéje kikel: 10-12 óra múlva 2. nap 2mm 3-4mm 2mm 3-4mm 1mm 3. nap 2-3mm 5-6mm 2-3mm 5-6mm 2-3mm 4. nap 4-5mm 7-8mm 3-4mm 7-9mm 4-5mm 5. nap 6-7mm 10-12mm 5-6mm 10-12mm 5-6mm 6. nap 7-8mm 13-14mm 7-8mm 13-14mm Báboz 7. nap 8mm Báboz 8-9mm 15-16mm Báb (3-4mm) 8. nap Báboz Báb (9-10mm) Báboz 16-18mm Báb 9. nap Báb (5-6mm) Báb Báb (6-7mm) 19-20mm Báb 10. nap Báb Báb Báb Báboz Báb 12. nap Báb Báb Báb Báb Kirepül (10-12mm) (4-5mm) 14. nap Kirepül (7-8mm) Kirepül (12-13mm) Kirepül (7-9mm) Báb 16. nap Báb, majd a 18. napon kirepül (16-18mm)
A DNS ujjlenyomatvizsgálat elméleti alapjai Minden egyes ember egyedi genommal rendelkezik (kivéve az egypetéjű ikrekeket!). A genomunkat a szüleinktől örököljük. Genetikai variációk sorozatát használhatjuk a különbözőség statisztikai valószínűségének megállapítására A DNS minta információtartalmát hatékonyan és reprodukálhatóan kell kinyerni (a bíróság több év után is kérhet új vizsgálatot) A jelenlegi DNS-ujjlenyomat standardok nem géneket vesznek figyelembe, a fenotípus tulajdonságairól (rassz, betegségek, hajszín, stb) kevés/semmilyen információt nem kapnak. De a 3. generációs szekvenátorokkal a jövőben minden ismert lesz?
A DNS, mint bizonyíték
Igazságügyi DNS vizsgálatok rövid története Sir Alec Jeffreys 1900-as évek: Landsteiner felfedezi az AB0 vércsoportokat, a szerológia tudománya forradalmasítja a törvényszéki vizsgálatokat. Az elkülönítési próba ereje: kb. 10 3 1980-as évek: RFLP + Southern blot: Alec Jeffreys kidolgozza az első genetikai marker alapú elkülönítést betegségekre. 6 Southern próbával az elkülönítés ereje: 10 6-10 8, személyazonosításra is alkalmazzák. 1984: A Colin-Pitchfork ügy Angliában: először alkalmaz a bíróság DNS alapú bizonyítékot két meggyilkolt diáklány esetében. 5000 Narborough környéki férfi önkéntes véradása útján megtalálják a gyilkost. Hátrányok: nagy mennyiségű (50-100 ng) tiszta, nagy molekulasúlyú DNS kell hozzá, nem ideális a gyakran degradálódott mintákhoz
Igazságügyi DNS vizsgálatok rövid története 1984: Karry Mullis kidolgozza a PCR technikát Sokkal kevesebb (1-2ng), rossz minőségű minta is elég hozzá A próba ereje egy szekvencia esetén 10 2-10 6,ami kevés az elkülönítéshez 1986: PCR + STR: nem kódoló, 4-7 ismétlődésekből álló, egyénenként változó kromoszóma szakasz vizsgálata. Nagyon kevés DNS-t igényel (<1ng), az elkülönítési próba ereje 10 14-10 23 A Föld lakossága 10 9 nagyságrendű! 1987 az FBI és NIH támogatásával létrehozzák a Combined DNA Index System (CoDIS) adatbázist. Ebbe helyszínelési minták és elkövetők anyagai egyaránt bekerülnek. Jelenleg kb. 9M adatot tartalmaz. 1990-es évek: a DNS vizsgálat megkérdőjelezhetetlen igazságügyi bizonyítéknak van feltüntetve. Olyan esetekben, ahol 1:33 Mrd az esélye annak, hogy nem a tettes DNS-ét találták meg nincs is szükség bíróságokra! - Robert Brower főügyész
az O.J. Simpson ügy Az évszázad pere: Dollárok v. DNS vagy California v OJ Simpson 1995: OJ Simpson-t az esküdtszék Felmentette!
Igazságügyi eljárásban használt genetikai markerek összehasonlítása magas próba ereje (genetikai elkülönítés) RFLP Multi-Locus Próbák RFLP Single Locus Próbák mtdns PCR: HV1, HV2 Multiplex PCR STRs PolyMarker STR próba D1S80 single STR Próba alacsony lassú Technika sebessége ABO vércsoport gyors Figure 1.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Igazságügyi DNS vizsgálat markerei ma: STR: 2-7 bp ismétlődő egységekből álló allélok, a centromer környékén, egyénenként változó méretűek. Az FBI 1996-ban létrehozott CODIS adatbázisa ezen alapul. Y-STR: az Y kromoszómaspecifikus STR allélok az apai leszármazást mutatják. A férfi nem megállapításánál (szexuális bűncselekmények) használt lókuszok. Mitochondriális DNS: a sejtmag nélküli sejtekben is van (haj, fog, csont), de csak az anyai leszármazás egyezésére/kizárására alkalmas. A történelmi sírok ill tömegsírok vizsgálatánál alkalmas lehet a degradált nukleáris DNS vizsgálat helyettesítésére. (Romanov család, vietnámi sírok) Mini-STR: degradált minták esetén a sejtmagi STR-ek alternatív lehetősége: egészen kicsi DNS fragmentek amplifikációjával. (2001 szept.11. maradványok esetén pl. ezt használták.) SNPs: single nt polymorphizmusok: egyetlen bázis amplifikációjával és populációs gyakoriságának összehasonlításával http://www.forensicdnacenter.com
Minisatellite Marker (D1S80) Flanking regions Repeat region GAGGACCACCAGGAAG 16 bp repeat unit STR Marker (TH01) Flanking regions Repeat region TCAT 4 bp repeat unit Figure 5.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Polymorphismusok a homológ kromoszómákon (A) Hossz polymorphismus: VNTR és STR Technika: (VNTR-PCR) ---------(AATG)(AATG)(AATG)---------- ---------(AATG)(AATG)---------- 3 repeats 2 repeats (B) Szekvencia polymorphismus: SNP Technika: (AS-PCR) --------AGACTAGACATT------- --------AGATTAGGCATT------- Figure 2.5, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Y-STR Csak a férfi Y kromoszóma lókuszai amplifikálhatók vele, amikor a PCR hatékonysága nem egyenlő a női és férfi STR-ek esetén, jól használható Problémák: ~99%-át a bűncselekményeknek férfiak követik el Dzsingisz kán érvelés : Az apai rokonok mind tartalmazzák a hasonló Y-STR haplotípusokat (pl.10%-a közép-ázsiaiaknak hordozza Dzsingisz kán haplotípusát)
Hypervariable Region1 Heavy (H) strand cyt b Control region (D-loop) Mitochondriális 1/16,569 DNS (mtdns) Egyetlen sejt tartalmaz E ~1000 mt-ot, 1 sejt szenzitivitás Égett minták esetén, ND6 haj, csontmaradványok esetén ND5 Anyai rokonságot közvetlenül mutatja S2 L2 H 16024 16365 1 73 340 ND4 Hátrányok: A ND2 N Egyetlen sejt tartalmaz strand ~1000 mt-ot, 1 sejt szenzitivitás miatt C a kontamináció lehetősége nagyobb! Y W Heteroplasmia ND4L nem homogén mt populáció a sejtekben R ND3 G HV1 COIII T P O H ATP6 ATP8 K COII HV2 16024 576 Light (L) Előnyök: Mitochondria 16,569 bp F 12S rrna S1 O L D Hypervariable Region2 V Q 16S rrna COI L1 ND1 I M 9-bp deletion 22 trnas 2 rrnas 13 genes Figure 10.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Pontmutációk (bázis szubtitúciók), amelyek gyakorisága 1%-nál nagyobb a populációban 5 Millió kb a humán genomban Minden-Semmi válasz alkalmazható micro-array vizsgálatban ~50 SNPs ugyanakkora erővel jósol jó kizárást, mint a 13 STR locus A magáncégek is alkalmazzák populációgenetikai vizsgálatoknaál
Mi a technikai alapja az STR lókuszok vizsgálatának? Laser Kapilláris Gélelektroforézis Capillary filled with polymer solution - + (cathode) 5-20 kv (anode) Detecti on window Inlet Buffer Outlet Buffer Sample Sample tray moves tray automatically beneath the cathode end of the capillary to deliver each sample in succession Data Acquisition Kapillárisok Fluoreszcensen jelölt primerekkel Elektródák a folyadék injekcióhoz
(RFU) (A) Multiplex PCR: egyszerre 3 allélt tudunk adott lókuszról amplifikálni a homológ kromoszóma párról Locus A Deletion of Locus B Locus C Locus A Locus B Locus C (B) A PCR termékeket méret alapján elkülönítjük kapilláris gélelektroforézissel: A peakek jelentik a termékeket: A B C RFU: relative fluorescence unit t: time 10min small 15 min large (t) 50 bp 70 bp Modified Figure 4.3 J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
CODIS (Combined DNA Index System, developed by FBI and NIH) Kromoszóma szám Nem-specifikus marker
FBI s core STR Lókuszok: 13
D8S1179 (12 alleles) D21S11 (24 alleles) D7S820 (10 alleles) CSF1PO (10 alleles) Blue panel D3S1358 (8 alleles) TH01 (10 alleles) D13S317 (8 alleles) D16S539 (9 alleles) D2S1338 (14 alleles) Green panel D19S433 (15 alleles) VWA (14 alleles) TPOX (8 alleles) D18S51 (23 alleles) Yellow panel AMEL (2 alleles) D5S818 (10 alleles) FGA low (19 alleles) FGA high (9 alleles) Red panel 100 bp 139bp 150 bp 160 bp 200 bp 250 bp* Orange panel 300 bp 340 bp 350 bp LIZ-labeled GS500 DNA sizing standard Figure 5.6, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
Hogyan értelmezzük a CODIS file STR adatokat? GeneScan Genotyper Allél (repeatek száma): az azonos körülmények között Futtatott referencia mintával hasonlítva pontosan megadja a repeatek számát Peak magasság: relativ fluorescencia unit (RFU)
Helyszíni STR Profil összevetése 2 gyanúsítottéval Gyanúsított 1 Exklúzió: Nincs találat Gyanúsított 2 Inklúzió: Van találat Bizonyíték
Mekkora az esély arra, hogy a két független minta az adott populációban azonos STR mintázatot ad? A minta egyezési valószínűsége a valódi tettessel nem mindig egyértelmű. Ez az ügyészi tévedés lehetősége: Ha egy elefántnak négy lába van, kicsi a valószínűsége, hogy ha egy állatnak 4 lába van, az elefánt. Norrgard, K. (2008) Forensics, DNA fingerprinting, and CODIS. Nature Education 1(1)
A gyakorlatban két minta egyezésének valószínűsége: ca.1:100 000 000 Miért?
Magyarázza el az apasági per mintavételét! D1 = biologiai lány 2 = anya gyereke, S1 = a pár biologikai fia S2 = adoptált gyerek
(A) Mendeli Öröklődés anya A,B apa C,D B,C gyerek (B) Pl.: Apasági vizsgálat str-ekkel 8,12 11,14 Mik a lehetséges kombinácók? 12,14 8,14 11,12 12,14 8,11 Csak az apa génjei: 14 14 11 14 11 Figure 23.2, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
(A) STR lókuszok direkt összevetése egy tárgyyal: DNS Profil: tömegkataszrófa esetén D5S818 D7S820 D13S317 CSF1PO D16S539 Penta D DNA profil közvetlen bizonyítékkal (B) Indirekt bizonyítás: rokonvizsgálat: áldozat D5S818 D13S317 D7S820 D16S539 CSF1PO Penta D? feleség 11,13 8,12 8,12 8,9 10,12 8,10 Feleség fiú 11,13 8,14 8,9 9,13 10,10 9,10 fiú Jósolt genotípus 11,? or?,13?,14 9,??,13?,10 9,? apa Aktuális genotípus 12,13 11,14 9,9 11,13 10,10 9,12 Figure 24.1, J.M. Butler (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition 2005 Elsevier Academic Press
3. Gélelektroforézis adj 5 ul PCR mintát az előre elkészített 5 ul kék mintafelvívőhöz. Vidd fel a mintát (10 ul) GelRedes gélre Indítsd el 30 min, 100V
Feladat: VNTR ANALYSIS AZ FBI ÁLTAL IS HASZNÁLT EGYIK VNTR LOKUSZ (FGA) VIZSGÁLATA AZ 5 GYANÚSÍTOTT KÖZÖTT. AZ ISMÉTLŐDŐ EGYSÉG HOSSZA 4 bp, SZEKVENCIÁJA: TTTC. AZ ISMÉTLŐDÉSEK SZÁMA 5-250, TEHÁT 60-1040 bp HOSSZÚSÁGÚ TERMÉKEKET VÁRUNK (természetesen a két primer hosszát is beleszámítva). A PCR primereket az ismétlődések két oldalán levő (konszenzus) szekvenciákra terveztük: 1 2 3 4 5 P1: gctagtaacggcattaccag, P2: catcgcataagaatttcacg
GYAKORLATI FELADAT-VNTR ANALÍZIS FUTTASSA MEG GÉLEN AZ ELŐZŐ CSOPORT REAKCIÓIT, ÉS ÁLLAPÍTSA MEG, HOGY HÁNY ISMÉTLŐDÉST TARTALMAZNAK AZ AMPLIFIKÁLT ALLÉLOK! 1 2 3 4 5 1900 340 760 360 272 152 336 120 340 100 770 620 420 340 270 180 140 90 két primerhosszat (40bp) levonva osszuk el a DNS fragmentumhos szat 4-el, így megkapjuk az ismétlődések számát ismétlődések (tandem repeat)száma: 75 180 58 74 75 75 80 28 25 15
1. FELADAT A felső szekvencia vad típusú (+), az alsó mutáns (-). Keressük meg a mutációt! Milyen típusú mutáció? (+) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT (-) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT
A felső szekvencia vad típusú, az alsó mutáns. Keressük meg a mutációt! Milyen típusú mutáció? pontmutáció, aminósavcserét eredményez, misszensz Milyen módszert ismer a pontmutációk/snp-k kimutatására? ASA-PCR (allélspecifikus Tervezzen primereket a két allél allélspecifikus amplifikációjához! (+) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT (-) CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT
PCR TERMÉKEK 5 ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT 3 5 AGT TAG AAG GGA TGG CGC TAG 3 (+) 5 ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAT... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT 3 3 TAC GGC CCT AGC CAA GAA TTA GAT CGC GGT AGG GAA GAT TGA 5 (-) 5 CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA... CTA GCG CCA TCC CTT CTA ACT 3 3 GGA CTG AAA TCG TAC GGC CCT AGC CAA GAA TTT GAT CGC GGT AGG GAA GAT TGA 5 5 CCT GAC TTT AGC ATG CCG GGA TCG GTT CTT AAA3 5 AGT TAG AAG GGA TGG CGC TAG 3
PCR TERMÉKEK GÉLELEKTROFORÉZISE +/+ -/- +/-
2. FELADAT Ella keresi fel ön rendelőjét, lányával, Lindával. Ella elmondja, hogy Linda apja az Öröm együttes valamelyik tagja. Ön az együttes tagjaitól száramazó DNS minták alapján elvégzi a VNTR analízist. Nos, ki Linda apja? Miért? Miért különleges a B mikroszatellit? VNTR Ella Linda Bálint Kolos Donát Aladár Álmos A 7 & 8 2 & 7 3 & 7 2 & 7 2 & 8 3 & 7 3 & 2 B 4 & 5 6 & 4 4 7 6 4 6 C D 11 & 8 7 & 19 11 & 9 9 & 10 13 & 8 10 9 & 12 9 & 13 21 & 7 21 & 7 7 & 9 21 & 7 15 & 8 21 & 15 E 10 & 6 12 & 6 6 & 9 12 & 9 17 & 10 6 & 12 17 & 12
A jövő/jelen igazságügyi tudománya? A Genome-Wide Association vizsgálat 5 lókuszt azonosított (PRDM16, PAX3, TP63, C5orf50, and COL17A1) Amelyek az arc morfológiáját befolyásolják. Pl. A Pax3 a nasion hosszát. Citation: Liu F, van der Lijn F, Schurmann C, Zhu G, Chakravarty MM, et al. (2012) A Genome-Wide Association Study Identifies Five Loci Influencing Facial Morphology in Europeans. PLoS Genet 8(9): e1002932.
Az ASA alapján határozza meg, hogy milyen szemszínű és hajszínű lehetett a tettes! Gene/SNP SZEM HAJ Blue/green Brown Blond/red Brown HERC2 Rs12913832 GG/CC AA/TT GG/CC AA/TT Oca2 rs1800407 AA/TT GG/CC AA/TT GG/CC Tyr Rs1393350 AA/TT GG/CC AA/TT GG/CC A szekvenálás eredménye: IRF4 rs12203592 TT/AA CC/GG TT/AA CC/GG SLC24A5 rrs16891982 GG/CC CC/GG GG/CC CC/GG ExoC2 rs49592270 AA/TT CC/GG AA/TT CC/GG Rs12913832: AA Rs1800407: GG Rs1393350: GG Rs12203592: CT Rrs16891982: CC Rs49592270: AC The HIrisPlex system for simultaneous prediction of hair and eye colour from DNA Forensic Science International: Genetics Volume 7, Issue 1, January 2013, Pages 98 115 IrisPlex: A Sensitive DNA Tool for Accurate Prediction of Blue and Brown Eye Colour in the Absence of Ancestry Information Journal:
Hasonlítsa össze az amplifikált mintákat a referencia képpel! Határozza meg az ismétlődések száma alapján a gyanúsítottak közül a tettest! Reference Gel 1 gyanúsítottak 2 3 áldozat marker 1900 620 272 152 336 120 340 360 420 340 270 180 140 100 1 2 3 90 Ki a lehetséges tettes?
Fogalmak: PCR lépései Személyazonosítás technikai alapjai: RFLP, VNTR, STR, SNP profil, CODIS, ASA