Az asthma genomikai háttere SZALAI Csaba LAM-TUDOMÁNY TOVÁBBKÉPZÉS ÖSSZEFOGLALÓ KÖZLEMÉNY GENOMIC BACKGROUND OF ASTHMA Az asthma genomikai szempontból a multifaktoriális betegségek közé tartozik. Ez azt jelenti, hogy a betegség iránti hajlamot több (feltételezések szerint több száz) gén kölcsönhatása eredményezi, ráadásul a betegség megjelenéséhez nemcsak genetikai, hanem környezeti tényezôk is szükségesek. Az elmúlt években a betegségek genomikai hátterének kutatásában elôtérbe kerültek a prekoncepció vagy hipotézis nélküli vizsgálatok, amelyek nem igénylik a betegség patomechanizmusának elôzetes ismeretét, így lehetôvé teszik új anyagcsereutak felfedezését. Ebben a közleményben a szerzô bemutatja az elmúlt néhány évben két ilyen módszerrel, a pozicionális klónozással és a teljesgenom-aszszociációs vizsgálattal az asthmával kapcsolatba hozott géneket. A gondos tervezés, a vizsgálatokba bevont nagy populációk, a robusztus genomikai és bioinformatikai módszerek valószínûsítik, hogy az így azonosított gének valóban fontos szerepet játszanak a betegségben, és a jövôben terápiás célpontként is szóba jöhetnek. pozicionális klónozás, teljes genomszûrés, teljesgenom-asszociációs vizsgálat, gének From a genomic point of view asthma is a multifactorial disease. It means that the susceptibility to the disease results from interaction of several (possibly several hundred) genes; in addition, the development of the disease requires environmental factors, as well. In the last years the hypothesis-free methods became widespread in the field of genomics investigating the genomic background of diseases. These methods do not need previous knowledge about the pathomechanism of the diseases and make it possible to discover new metabolic pathways. In this review all of the new asthma genes will be presented detected in the last few years by two such methods, by positional cloning and genome wide association study. The careful design of the studies, the large populations, the robust genomic and bioinformatic methods make it likely that these genes are really asthma genes playing important roles in the pathomechanism of the disease and are potential new therapeutic targets. positional cloning, whole genome screening, genome wide association studies (GWAS), genes dr. SZALAI Csaba (levelezési cím/correspondence): Magyar Tudományos Akadémia-Semmelweis Egyetem, Gyulladásbiológiai és Immungenomikai Kutatócsoport/HAS SE Inflammation Biology and Immunogenomics Research Group; 1089 Budapest, Nagyvárad tér 4. és Heim Pál Gyermekkórház Budapest/Heim Pál Pediatric Hospital; 1089 Budapest, Üllôi út 86. E-mail: szalaics@gmail.com Érkezett: 2009. november 25. Elfogadva: 2010. március 31. Az asthma genomikai szempontból a multifaktoriális betegségek közé tartozik. Ez azt jelenti, hogy szemben a monogénes betegségekkel, ahol egyetlen gén meghibásodása okozza a betegséget, a multifaktoriális betegségek iránti hajlamot több gén (feltételezések szerint több száz) kölcsönhatása eredményezi, ráadásul a betegség megjelenéséhez nemcsak genetikai, hanem környezeti tényezôk is szükségesek. A genomika fogalma Bár a genomika tudománya már több évtizedes múltra tekint vissza, tulajdonképpen csak az elmúlt két évtizedben vált még az élô természettudományokkal foglalkozók között is igazán ismertté. Annak ellenére azonban, hogy jelenleg is a leggyorsabban fejlôdô tudományágak közé tartozik, a hétköznapi emberek túlnyomó többsége, sôt, például a régebben végzett orvosok, gyógyszerészek számára is gyakorlatilag ismeretlen fogalmat takar. Éppen ezért a bevezetôben néhány fogalmat definiálok. A genom diploid sejt teljes haploid DNS-tartalma, plusz a mitokondriális DNS. Mivel a férfiak és a nôk genomja különbözik abban, hogy a férfiaknak kétféle nemi kromoszómájuk van (X és Y), a genommeghatározásnál ezt is figyelembe kell venni. A következô fontos kérdés, hogy mivel foglalkozik a genomika. Iga- Szalai: Az asthma genomikai háttere LAM 2010;20(12):835 841. 835
zából erre többféle definíciót is lehet adni, ezek közül talán a legegyszerûbb: A genom mûködésének, szerkezetének, kölcsönhatásainak vizsgálata és az ezekhez tartozó módszerek. A DNS vizsgálatán túl azonban idetartoznak az RNS-ek vizsgálatai (transzkriptomika), a fehérjék vizsgálatai (proteomika), bioinformatika és a rendszerbiológia is. Egyes meghatározásokban a genomikát a molekuláris rendszerbiológia szinonimájának is definiálják, amelyben a genomszintû szervezôdések alapján ismerjük meg a világot. Igazából nem húzható éles határvonal a genetika és a genomika közé, mindenesetre általánosságban elmondható, hogy ha egy gént vagy genetikai variációt vizsgálunk, akkor genetikáról szoktunk beszélni, ha több gént vagy az egész genomot mint rendszert vizsgáljuk, akkor genomikáról beszélünk. Ebbôl következik, hogy a genomika, mivel a rendszerbiológia témakörbe tartozik, általában jóval összetettebb módszereket igényel. Ebben az összefoglaló tanulmányban csak olyan, az asthmával kapcsolatos eredményt fogok ismertetni, amelyeket genomikai módszerekkel kaptak, ezeken belül is azokról, amelyek azt mutatják, hogy az emberek esetében megtalálható genetikai variációk közül melyek befolyásolják az asthma kialakulásának kockázatát. Az asthmával kapcsolatos genetikai kutatások eredményeirôl más közleményekben olvashatunk (1, 2). Genomikai vizsgálati módszerek A SZÖVEGBEN ELÔFORDULÓ NÉHÁNY GENOMIKAI KIFEJEZÉS MAGYARÁZATA Epigenomika: A genom olyan módosulásaival foglalkozik, amelyek nem érintik közvetlenül a DNS-szekvenciát. Ez is információtartalmú, amely a DNS-szekvencia mellett továbböröklôdik sejtosztódáskor. Idetartozik például a nukleotidok metilációja, a DNS mellett található fehérjék (hisztonok) metilációja, acetilációja, foszforizációja stb. Ezek a módosulások fontos szerepet játszanak a genom mûködésének szabályozásában. GWAS: Az angol genome wide association study kifejezés rövidítése. A genom teljes területén nagyjából egyenletes eloszlásban egy nukleotidot érintô variációkat, SNP-ket vizsgálnak 100 ezer és egymillió közötti mennyiségben. Azt vizsgálják, hogy melyik SNP (vagy az általa meghatározott genotípus) gyakorisága különbözik két eltérô fenotípusú populációban (például beteg és egészséges). Haplotípus: Ha több, egymás melletti allél gyakran fordul elô különbözô emberek esetében egyszerre, azaz együtt öröklôdnek, akkor azt mondjuk, hogy ezek az allélok egy haplotípuson vagy egy haplotípusblokkban vannak. LD vagy linkage disequilibrium: Ha a genomban két locus (például két SNP) egymás közelében van ugyanazon a kromoszómán és nem egymástól függetlenül öröklôdnek, akkor kapcsoltság van közöttük. Minél magasabb az LD jellemzésére használt D koefficiens értéke két locus között, annál nagyobb a valószínûsége, hogy együtt öröklôdnek. Mikroszatellita: 1-4 bp ismétlôdések a genomban. Rendkívül heterogének. A genom egy pontján különbözô emberek esetében különbözô darabszámú mikroszatellita fordulhat elô. Jelenleg 30 000 ilyen nagy heterogenitású mikroszatellita ismert. Meghatározásuk viszont nehézkesebb, mint az SNP-ké, könnyebben mutálódnak, ezért egyre kevésbé használják ôket genomszûrésekben. Pozicionális klónozás: Olyan módszer, amellyel bizonyos fenotípusért (például betegségért) felelôs gént azonosítanak. Elôször valamilyen módszerrel (például genomszûréssel) meghatározzák a genomterületet, majd sûrûbb markerekkel, általában SNP-kel leszûkítik azt a génre, illetve a fenotípusért felelôs mutációra. Promóter régió: A gén elôtt elhelyezkedô szekvencia, amely a gén expressziójának a szabályozásáért felel. SNP: Angol kifejezés rövidítése: single nucleotide polymorphism, azaz egy nukleotidot érintô variáció vagy pontmutáció. Amerikai kiejtése: sznip. Jelenleg több mint 18 millió SNP található meg a dbsnp adatbázisban: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez. Szekvenálás: (Itt) DNS-szekvenálás. A DNS-t felépítô nukleotidok sorrendjének meghatározása. A betegségre hajlamosító génvariációk keresésére a humán genomban kéttípusú megközelítésrôl beszélhetünk. Az egyikben korábbi tudásunkra támaszkodva ismert géneket, genetikai variációkat vizsgálunk, míg a prekoncepció vagy hipotézis nélküli vizsgálatokban olyan módszereket használunk, amelyek nem igénylik a betegség patomechanizmusának elôzetes ismeretét. A kétféle megközelítés között vannak persze átfedések, amikor prekoncepció nélküli módszerrel kezdik a vizsgálatokat, de késôbbi lépésekben felhasználják a korábbi ismereteket. A genomikai vizsgálatokban döntôen ez utóbbi módszert használják. A prekoncepció nélküli vizsgálatok óriási fejlôdésen mentek keresztül az elmúlt években. Jelentôségükre jellemzô, hogy az idetartozó teljesgenom-asszociációs vizsgálatot (angol rövidítése GWAS = genome wide association study) a Science nevû tudományos újság 2007-ben az összes tudományágban elért eredmények közül az év tudományos áttörésének választotta (3). Ebben a módszerben a genom teljes területén nagyjából egyenletes eloszlásban egy nukleotidot érintô variációkat, SNP-ket (egyesnukleotid-polimorfizmus, single nucleotide polymorphism) vizsgálnak 100 ezer és egymillió közötti mennyiségben. Itt is azt nézik, hogy melyik SNP (vagy az általa meghatározott genotípus) gyakorisága különbözik a betegek és az egészségesek csoportjában. A GWAS-t megelôzôen genomikai módszerként teljesgenom-szûrést használtak. Ennél a módszernél olyan családokat vizsgálnak, amelyben legalább egy beteg testvérpár van, és genetikai markerként mikroszatellitákat [egy-négy bázispár (bp) hosszúságú ismétlôdéseket] használnak. Mivel lényegesen ritkábbak, mint az SNP-k és meghatározásuk is körülményesebb, egyre kevésbé alkalmazzák ezt a módszert, de a korábban közölt eredmények fontos szerepet kapnak a jelenlegi kutatásokban. Az SNP-kel szemben a teljes genom- 836 LAM 2010;20(12):835 841. Szalai: Az asthma genomikai háttere
1. TÁBLÁZAT Pozicionális klónozással és teljes genomszûréssel azonosított asthmagének és néhány jellemzôjük Jelölt gének Kromoszómarégió Feltételezett funkció Fenotípus Expresszió Pozicionális klónozás DPP10 2q14 kemokinek és citokinek asthma, magas IgE tüdôepithelsejtek szabályozása CYFIP2 5q33 CD4+ sejtek adhéziója asthma differenciálatlan lymphocyták HLA-G 6p21.3 immunválasz asthma epithelsejtek, PBMC szabályozása GPRA 7p ismeretlen asthma, atópia tüdôepithelsejtek és simaizom PHF11 [SETDB2, 13q transzkripciós magas IgE-szint, asthma lymphocyták RCBTB1(?)] szabályozás(?) ADAM33 20p13 proteolízis, jelátvitel, asthma, légúti mesenchymalis sejtek, remodelling hiperreaktivitás fibroblastok, simaizom, bronchialis epithelium Teljes genomszûrés ORMDL3 17q21 nem ismert asthma endoplazmatikus reticulum RAD50 5q31 DNS-javító asthma, magas IgE-szint B-lymphoblastok CHI3L1 1q32.1 gyulladási folyamatok asthma, légúti epithelsejtek, befolyásolása hiperreaktivitás macrophagok PDE4D 5q12 légúti simaizom asthma általános összehúzódásának szabályozása, camp-lebontás TLE4 9q21 transzkripciós regulátor, asthma B-sejtek B-sejtek korai differenciálódása ADAM33: a disintegrin and metalloproteinase domain 33; CHI3L1: chitinase-3-like protein 1; CYFIP2: cytoplasmic fragile X mental retardation proteininteracting protein 2; DPP10: dipeptidyl peptidase 10; GPRA: G protein-coupled receptor for asthma susceptibility; HLA: human leukocyte antigen; ORMDL3: ORM1-like 3 (S. cerevisiae); PDE4D: camp-specific 3,5 -cyclic phosphodiesterase 4D; PHF11: plant homeodomain finger protein-11; SFRS8: splicing factor, arginine/serine-rich 8; TLE4: transducin-like enhancer of split 4. szûréseknél asthmával kapcsolódó genomterületeket határoznak meg, azzal a megjegyzéssel, hogy ezen a területen belül (ami akár több millió bázis hosszúságú is lehet) van olyan ismeretlen génvariáns vagy génvariánsok, amely vagy amelyek az összefüggést okozza vagy okozzák. Az így meghatározott genomterületen azután még különbözô módszerekkel meg kell határozni ezeket a genetikai variációkat. Ez utóbbi eljárást pozicionális klónozásnak nevezik. A továbbiakban a fenti módszerekkel felfedezett és az asthmával kapcsolatba hozott géneket, valamint röviden a felfedezés körülményeit fogom ismertetni. A szövegben elôforduló, egyes genomikai kifejezéseket külön részben röviden megmagyarázom. A genomikai vizsgálatok eredményei Eddig számos genomszûrést publikáltak asthmás vagy asthmához kapcsolódó fenotípusokkal kapcsolatban. Az asthma genetikai komplexitására utal, hogy több mint 20 különbözô genomterületen találtak asthmára/ atópiára hajlamosító géneket. Az elsô asthma-gwas-t 2007-ben publikálták, amelyet azután még követett eddig (2009. október) összesen öt (4 9). Az 1. táblázatban látható az eddig pozicionális klónozással és GWAS-sal kapott, asthmával összefüggésbe hozott gének elnevezése és néhány jellemzôje. Pozicionális klónozással kapott eredmények DPP10 Allen és munkatársai pozicionális klónozással új asthmagént fedeztek fel a 2q kromoszómakaron (10). Kapcsoltsági analízissel összefüggést találtak az asthma és a D2S308-as mikroszatellitamarker között, amely 800 kilobázis (kb) távolságban helyezkedik el a 2q14-es lo- Szalai: Az asthma genomikai háttere LAM 2010;20(12):835 841. 837
kalizációjú IL1 génklasztertôl. Meghatározták a környezô régió bázisszekvenciáját, és nagy sûrûségû SNPkapcsoltsági vagy linkage disequilibrium (LD) térképet készítettek. A legerôsebb összefüggést a D2S308 marker közelében elhelyezkedô WTC122 nevû SNPvel találták. Bioinformatikai módszerekkel az SNP közelében, vele egy LD-blokkban azonosították a DPP10 gént. Ez a gén a dipeptidil-peptidáz génekkel (DPPs) mutatott szoros homológiát, amelyek termékei különbözô fehérjék terminális dipeptidjeit hasítják le. A géncsalád más tagjaival mutatott homológia alapján a szerzôk azt gondolták, hogy a DPP10 különbözô kemokinek és citokinek aktivitását szabályozza úgy, hogy prolinra specifikus módon lehasítja N-terminális dipeptidjeiket. Elképzelésük szerint a DPP10 proinflammatorikus és szabályozó kemokineket és citokineket hasít. Ezek alapján a DPP10 valószínûleg szerepet játszik a légutak gyulladásos folyamataiban. Mivel azonban még nem végezték el a DPP10-expresszió összehasonlítását normális és asthmás szövetben, egyelôre nem ismert, hogy a DPP10-expresszióban mutatkozó különbség összefüggésben áll-e az asthmával. CYFIP2 Az 5q33-as régióban pozicionális klónozással fedezték fel, hogy a cytoplasmic fragile X mental retardation protein-interacting protein 2 (CYFIP2) génben levô SNP-k összefüggenek az asthmával (11). A CYFIP2 nagyon konzervált gén, amely széles körben expreszszálódik, különösen nagy mennyiségben sclerosis multiplexben szenvedô betegek CD4+ sejtjeiben. Ez arra utal, hogy a fehérje túlsúlya növelheti a T-sejtek adhéziós tulajdonságait. HLA-G Ebben a régióban pozicionális klónozással a HLA-G gént azonosították, amelynek 964 G/A, szabályozórégióban található variációja mind az asthmával, mind az atópiával kapcsolatba volt hozható (12). Az eredményeket több populációban is megerôsítették. Családokat vizsgálva a 964A allél akkor adódott át az anyából az asthmás gyermekébe nagyobb valószínûséggel, ha az anya egészséges volt, míg a 964G allél, ha az anya is beteg volt. Érdekes módon az apákkal kapcsolatban semmilyen hasonló összefüggést nem találtak. Ez az eredmény is arra utal, hogy az anya asthmája jobban befolyásolja a gyermekének a betegségét, mint az apáé. Ezt mutatja az is, hogy azok közül a gyerekek közül, akiknek az anyja asthmás volt, a GG genotípusúak 56%-a volt asthmás, míg az egészséges anyák GG-gyermekeinek csak 26%-a. Holland családokban a GGgyermekek kisebb valószínûséggel voltak atópiások, de nagyobb valószínûséggel voltak asthmások, ha az anyjuk is asthmában szenvedett. Több mint 20 különbözô genomterületen találtak asthmára/ atópiára hajlamosító géneket. A HLA-G gén újabb bizonyítéka annak, hogy az atópiás, allergiás betegségek a Th1/Th2 rendszer zavarára vezethetôk vissza. A HLA-G gén terméke ugyanis fontos szerepet játszik például abban, hogy az anya szervezete a terhesség alatt nem löki ki az immunológiai szempontból idegen testnek számító magzatot. A lokálisan expresszálódó HLA-G ugyanis a magzat környékén az immunválaszt Th2 irányba tolja el, megakadályozva így a Th1-sejtek által irányított kilökôdést. GPRA Laitinen és munkatársai genetikai térképezés és pozicionális klónozás stratégiával új asthma- és allergiagént találtak a 7p kromoszómán (13). Hierarchikus genotipizálási módszert használva azonosították azt a 133 kb génszegmenst, amely összefüggésben áll a betegség nagyobb kockázatával és két gént tartalmazott. Az egyik gén G-fehérjéhez kapcsolt receptort kódolt, amelyet GPRA-nak neveztek el (G protein-coupled receptor for asthma susceptibility), és amelynek izoformaeloszlása különbözött egészséges és asthmás emberekbôl származó bronchialis biopsziákban. Finnországból és Kanadából származó három populációban asszociációs vizsgálatot végeztek, és az egyes SNP-kel jelölt haplotípusok összefüggésben álltak az emelkedett IgE-szinttel és az asthmával. A GPRA gén egér ortológjának expressziója felerôsödött ovalbuminnal kiváltott légúti gyulladásban. A GPRA tulajdonságai alapján feltehetôleg szerepet játszik az asthma patomechanizmusában. A receptor feltételezett ligandja, a GPRA izoformái és jelátviteli molekulái az asthmában lényeges szerepet játszó új útvonalat határozhatnak meg. PHF11 Zhang és munkatársai óriási munkával, pozicionális klónozással az itt korábban detektált nagy kiterjedésû hajlamosító régiót leszûkítették és azonosítottak egy gént (14). Elôször megerôsítették a korábbi eredményeket, és standard kapcsoltsági analízissel igazolták a régió és az atópia, valamint az össz-ige-szint összefüggését ausztrál családokban. A legerôsebb összefüggést adó régió középpontjában egy gén található [PHF11 (plant homeodomain PHD finger protein-11)], amely mellett másik két gént is azonosítottak (SETDB2 és RCBTB1). További vizsgálatokkal azonosítottak három SNP-t, amelyeknek egymástól független hatásuk volt. Az 5-ös intronban, illetve a 3 nem átíródó régióban található variánsokról kimutatták, hogy a súlyos asthmával kapcsolódnak. Ezt az eredményt késôbb független brit vizsgálatban is megerôsítették. A PHF11 gén pontos funkcióját egyelôre még nem sikerült tisztázni, de az átíródott fehérjében található két cinkujjmotívum azt sejteti, hogy szerepe lehet a transzkripciós szabályozásban. A gén a legtöbb szövetben expresszálódik, de Zhang és munkatársai sok im- 838 LAM 2010;20(12):835 841. Szalai: Az asthma genomikai háttere
munfunkciójú szövetben megtalálták a gén konzisztens expresszióját. Sôt, a fehérje több transzkripciós izoformáját fedezték fel, többek között olyat is, amelyik kizárólag a tüdôben és a perifériás vér leukocytáiban fejezôdik ki. Mivel a génnek ezek a variációi szorosan összefüggenek a szérum-ige-szinttel és a keringô IgM-mel, és a gén erôsen expresszálódik B- sejtekben, Zhang és munkatársai azt feltételezték, hogy a locus fontos szerepet tölthet be az immunglobulinszintézis szabályozásában. ADAM33 Bár eddig csak egy vizsgálatban találtak kapcsoltságot az asthma, de fôleg a bronchialis hiperreaktivitás és az ADAM33 gén között, a bizonyítékok olyan meggyôzôek voltak, hogy általánosan elfogadott lehetséges fontos szerepe a betegség iránti hajlamban (15). A vizsgálatban 460 testvérpárt vizsgáltak meg, és igen erôs kapcsoltságot találtak a 20p13-as génrégió és az asthma között. Ez után ebben a régióban 135 polimorfizmust vizsgáltak meg, és rátaláltak az ADAM33 génre. Az ADAM33 fehérje metalloproteináz, ami a tüdôben, a simaizmokban és a fibroblastokban expresszálódik. Bár pontos funkciója még nem tisztázott, feltételezik, hogy szerepet játszhat a bronchusok kontraktilitásában és/vagy befolyásolhatja a bronchialis átépülés folyamatát. Teljesgenom-asszociációs vizsgálatokban kapott eredmények ORMDL3 Az elsô publikált teljesgenom-asszociációs vizsgálatban, a 17q21-es régióban azonosították az ORMDL3 gént. A vizsgálatban 317 ezer SNP-t genotipizáltak, és a szigorú statisztikai követelmények az ORMDL3 gén melletti SNP-ket azonosították, mint gyermekkori asthmával összefüggést mutató genetikai variációkat (4). Az SNP-k befolyásolták az ORMDL3 expresszióját is. A gén által kódolt fehérje az endoplazmatikus reticulumban, a transzmembrán régiójában található. A fehérje funkciója egyelôre nem ismert, de az eredményeket azóta több független populációban is megerôsítették. RAD50 Német populációban GWAS-t végeztek 1530 résztvevôvel és több mint 300 ezer SNP-vel annak a vizsgálatára, hogy a magas össz-ige-szintnek mi a genomikai háttere (7). A pozitív SNP-ket ez után négy független populációban értékelték összesen közel 10 ezer résztvevôvel. Összesen három gént azonosítottak, amelyeknek a variációi befolyásolták az össz-ige-szintet: FCER1A (a nagy affinitású IgE-receptor alfa-lánca az 1-es kromoszómán), a RAD50 (egy DNS-javító gén az 5q31-es Th2-citokin-régióban) és a STAT6 (a Th2- citokin jelátvitelben szerepet játszó transzkripciós faktor a 12-es kromoszómán) géneket. Ezek közül a RAD50 SNP-i asthmával is összefüggést mutattak. CHI3L1 Ober és munkatársai korábban megállapították, hogy a kitinázszerû fehérje, az YKL-40 szintje emelkedett asthmások szérumában, sôt, szintje korrelál az asthma súlyosságával, illetve a tüdôfunkcióval (5). Olyan GWAS-t végeztek, amelyben azt vizsgálták, hogy milyen genomikai háttér befolyásolja a szérum-ykl-40-szintet. A vizsgálatokat beltenyésztett populációban, az európai eredetû hutteritákon végezték. Az ilyen populációk azért alkalmasak genetikai vizsgálatokra, mert genomikai hátterük homogén, tehát az adódó genomikai különbségeket könnyebb visszavezetni a fenotípusos különbségekre. Ráadásul általában azonos környezetben élnek, sokszor szigorúan meghatározott szabályok között (például a hutteritáknak nem szabad dohányozni), így az eltérô környezeti hatások sem okoznak nehézségeket. Több mint 300 ezer SNP vizsgálatával egy SNP-t találtak az YKL-40 fehérjét kódoló chitinase 3- like 1 (CHI3L1) gén szabályozórégiójában, amely öszszefüggést mutatott az emelkedett szérumfehérjeszinttel, az asthmával és a bronchialis hiperreaktivitással. Ezt követôen két európai eredetû populációban reprodukálni tudták az eredményeket. Érdekes módon nem találtak semmilyen összefüggést az YKL-40 és az atópia között. PDE4D Az egyes gének nem önmagukban hatnak, hanem folyamatos kölcsönhatásban állnak a többi génnel, bonyolult hálózatokat alkotva. A következô GWAS-t 422 asthmás gyermek és családja, valamint 846 független kontroll bevonásával végezték Illumina Human-Hap550 Genotyping BeadChipen, amely több mint 500 ezer SNP-t képes egy méréssel vizsgálni. Az asthmás gyermekeket és családjaikat a CAMP (Childhood Asthma Management Program) klinikai vizsgálat biobankjából válogatták, a résztvevôk nem spanyol ajkú, fehér bôrûek voltak (6, 16). Tanulva a korábbi évek genetikai vizsgálatainak rengeteg, késôbb nem reprodukált eredményeibôl, az álpozitív eredmények elkerülése érdekében rendkívül alaposan jártak el. Az 500 ezer SNP vizsgálatának az elônye, hogy segítségével ellenôrizni lehet, hogy a tanulmányozott populáció alkalmas-e a vizsgálatra. Például az SNP-k eloszlása alapján ki tudták zárni azokat, akiknek az SNP-mintázata eltért a többiektôl. Ilyenkor valószínûsíthetô, hogy az illetô eltérô származású, és bevonása torzíthatja az eredményeket (ez a populációs rétegzôdésbôl eredô hiba). De ki tudták zárni az egymással közeli rokonságban állókat is, vagy akinek a genetikai és a fenotípusos neme különbözött. Az így megszûrt populációban végezték el ez után a statiszti- Szalai: Az asthma genomikai háttere LAM 2010;20(12):835 841. 839
kai elemzéseket. Elôször az eset-kontroll vizsgálat eredményeit összevetették a CAMP-családokban kapott eredményekkel. A legerôsebb összefüggést mutató SNP-k közül négy egymás közelében helyezkedett el, egymással szoros kapcsoltságban (LD-ben) a PDE4D génben. Ez a gén 5q12 pozícióban a camp-specifikus foszfodiészteráz 4D fehérjét kódolja, amelynek ismert a szerepe a légúti simaizom összehúzódásának szabályozásában, így jó jelölt asthmagénnek tûnik. A kiválasztott SNP-k közül kettôt ez után 10 különbözô etnikai összetételû, asthmásegészséges populációban ellenôrizték. A vizsgálatba bevont összesen hét spanyol ajkú és fehér bôrû populációban sikerült reprodukálni az eredményeket, míg a három afrikai eredetû populációban nem. Ezt követôen a korábban, más populációk esetében publikált GWASeredményeket ellenôrizték a CAMP-kontrollpopuláció segítségével, hiszen a vizsgált 500 ezer SNP között szerepeltek a korábbi vizsgálatokban nézett SNP-k is. Ebben a populációban az ORMDL3 génnel kapcsolatos eredményeket sikerült reprodukálni, míg a CHI3L génnel kapcsolatosakat nem. Asthmában több százezer SNP genotipizálásával vizsgálatonként általában egyetlen gént sikerült azonosítani. GWAS nem európai populációkban A nagy asthma-gwas-okat európai eredetû populációkban végezték, nem európai eredetû populációt csak a korábban kapott eredmények megerôsítésére vontak be. Két, viszonylag kisebb GWAS-t végeztek el nem európai eredetû populációban. Az elsôt Puerto Ricó-i populációban hajtották végre Affymetrix csippel, valamivel kevesebb mint 100 ezer SNP-vel. Valószínûleg a viszonylag kevés SNP és kisszámú résztvevô miatt (a teljes genomszûrésben mindössze 96 beteg vett részt) nem tudtak gént megnevezni, csak kromoszómarégiót. Az 5q23-régióban találtak olyan SNP-ket, amelyek összefüggést mutattak az asthmával ebben az etnikai csoportban (9). Valamivel nagyobb GWAS-t végeztek el mexikói, spanyol ajkú populációban (8). A vizsgálatban 492 asthmás gyermek és családja vett részt, és a 11 legerôsebb összefüggést mutató SNP-t független populációban próbálták megerôsíteni. Végül két SNP a transducin-like enhancer of split 4 (TLE4) gén közelében állt összefüggésben az asthmával ebben a populációban. A talált SNP-k funkcióját nem vizsgálták. Érdekes módon az SNP-k fordított összefüggést mutattak, azaz a ritka allél jelenléte enyhe védelmet mutatott a betegség kialakulásával szemben. A TLE4 valószínûleg transzkripciós regulátor, és a B-sejtek korai differenciálódásában játszik szerepet. A gén feltételezett funkciója alapján befolyásolhatja az immunrendszer kialakulását, és így az asthma iránti hajlamot. A GWAS-ek lehetôséget adnak arra is, hogy megállapítsuk, a vizsgált populációban (akár egyetlen ember esetében is) milyen etnikai csoportok keverednek. Bár a vizsgálat a spanyol ajkúak tanulmányozását tûzte ki célul, valójában ez a csoport erôsen kevert populáció. A GWAS eredményei alapján például a mexikói résztvevôk genomikai háttere átlagosan 69,5%-ban amerikai ôslakos, 27,4%- ban európai és 3,2%-ban afrikai eredetû. Az elemzésekbôl megállapították, hogy a védelmet jelentô SNP-k az amerikai ôslakos ôsöktôl származnak. Miért találtak eddig ilyen kevés asthmagént genomikai módszerekkel? A genomikára is igaz az a gyakran emlegetett tétel, hogy minél jobban megismerünk valamit, annál inkább ráébredünk arra, hogy mennyi mindent nem tudunk. Még a 2000-es évek elsô felében is gyakorlatilag a legtöbb szakember azt jósolta, hogy a genomika forradalmasítani fogja az orvostudományt, és általában a nagyon közeli jövôben megvalósulni látták a személyre szabott gyógyászatot is. Mint tudjuk, ez 2009-ig biztos nem valósult meg, és most úgy néz ki, hogy az elkövetkezendô években sem kerül sor nagy áttörésre. Mi lehet ennek az oka? Leginkább a multifaktoriális betegségek és jellegek (például külsô-belsô tulajdonságok) vizsgálatakor derült ki, hogy az egész élô rendszer olyan sokrétûen szabályozott és befolyásolt, hogy még akkor is nehéz lenne pontos összefüggést találni a genotípus és a fenotípus között, ha minden faktort ismernénk. Gondoljunk csak bele, hogy a környezeti tényezôk már a fogantatás pillanatától hatnak. A kutatások során kiderült, hogy a magzatot ért hatások az egész életre kihatnak, leginkább epigenetikai (DNS-metiláció, hisztonmodifikáció) módosításokon keresztül. Ezek a környezeti hatások azután folyamatosan érnek minket egész életünkben. Ilyenek lehetnek például a fertôzések, táplálkozás, pszichés hatások, dohányzás, gyógyszerek, fizikai aktivitás stb. A szervezet adott állapota mindig függ az ôt korábban ért környezeti hatásoktól, a genetikai adottságoktól és ezek kölcsönhatásától. Ráadásul a genetikai szabályozás is sokszintû, jelenleg nem is teljes mértékben feltárt. Ismert, hogy a genomunk mûködése függ a szekvenciától, epigenomikai módosulásaitól, de a genomon belüli funkcionális egységeket még mindig nem ismerjük teljességükben, és messze nem csak a fehérjéket kódoló régiók a meghatározóak. Az egyes gének pedig nem önmagukban hatnak, hanem folyamatos kölcsönhatásban állnak a többi génnel, bonyolult hálózatokat alkotva, amelyben a kölcsönhatások is többfélék lehetnek. Ezeknek a hálózatoknak a felderítésével, megfejtésével foglalkozik a rendszerbiológia, angol kifejezéssel a systems biology. A multifaktoriális jellegek kutatásainak nehézségét mutatja, hogy GWA-vizsgálatokban, annak minden pozitívumát elismerve, igazából eddig csak nagyon kevés gént sikerült találni. Például asthmában több százezer SNP genotipizálásával vizsgálatonként általában egyetlen gént sikerült azonosítani, pedig ismert, hogy több 840 LAM 2010;20(12):835 841. Szalai: Az asthma genomikai háttere
száz ilyen gén van. De a többi betegségben is kiszámolták, hogy az öröklôdésért felelôs résznek eddig csak néhány százalékát sikerült azonosítani. Ennek egyik oka az, hogy a gyakori betegségeket vagy bármely fenotípust befolyásoló gének hatása nagyon kicsi. Az eddig talált, betegségekre hajlamosító variációk jellemzôen csak 10-20%-kal emelik a betegség iránti hajlamot. Ez azt jelenti például, hogy annak az esélye, hogy a variációt hordozó beteg legyen 1,1-1,2-szer nagyobb, mint azé, aki nem hordozza. Az ilyen gyenge hatású gének detektálása pedig nagyon nehéz. Ráadásul a vizsgált betegek genetikailag heterogének, azaz egyazon betegségre számos (gyakorlatilag szinte végtelen számú) genetikai háttér hajlamosíthat. Statisztikai szempontból például elônyös, ha minél nagyobb populációt vizsgálunk, genomikai szempontból azonban egyre nô a populáció genetikai heterogenitása, így az egyes genetikai variációk hatása felhígul. A hiányzó öröklôdô háttér másik oka lehet, hogy a jelenleg rendelkezésre álló módszerek azon a feltevésen alapulnak, hogy ezeket a betegségeket a populációban elôforduló gyakori, gyenge hatású polimorfizmusok okozzák [ez a gyakori variáció/gyakori betegség (angolul CV/CD = common variants/common disease) hipotézis]. Ezzel szemben arra is vannak bizonyítékok, hogy az öröklôdô hajlam jelentôs részéért erôsebb hatású, de ritka variációk felelnek. Ezeket csak akkor lehet majd detektálni, ha a teljesgenom-szekvenálás jelentôsen olcsóbb lesz. Jelenleg nagy valószínûséggel jelezhetô, hogy egy ember teljes genomja szekvenálásának az ára le fog csökkenni 1000 USD környékére vagy akár az alá is. Ebben az esetben elôbb-utóbb bárki genomját szekvenálni lehet, megismerve ezáltal öszszes genetikai variációit. Egyes várakozások szerint a nem is olyan távoli jövôben a fejlett országokban mindenki genomját szekvenálják az egészségügyi szervek, esetleg biztosítótársaságok támogatásával (Magyarországon például OEP-támogatással). Ez nyilván akkor fog bekövetkezni, ha a szekvenálás árát túlszárnyalja az a nyereség vagy megtakarítás, amelyet a genomok szekvenciájának megismerésével el lehet érni. Az elmúlt néhány évben nagymértékben fejlôdött tudásunk az asthma genomikai hátterének megismerésében. Bár a teljes megértést valószínûleg soha nem érjük el, a rendelkezésre álló információk (emberi és a modellállatok genomiális szekvenciái), az egyre fejlôdô módszerek (microarray, nagy teljesítményû genotipizálás, DNS-szekvenálás, transzgenikus állatok) és az ilyen komplex mechanizmusok megfejtéséhez nélkülözhetetlen bioinformatika gyors fejlôdése valószínûsítik, hogy egyre közelebb kerülünk a probléma megoldásához. Köszönetnyilvánítás A közlemény a következô támogatás segítségével jött létre: NKTH TECH_08-A1/2-2008-0120. IRODALOM 1. Szalai C, Ungvári I, Pelyhe L, Tölgyesi G, Falus A. Asthma from a pharmacogenomic point of view. Brit J Pharmacol 2008;153: 1602-14. 2. Szalai C. Allergiás kórképek genetikai vonatkozásai. In: Gyakorlati allergológia. (Szerk. Temesvári E. és Kárpáti S.) Budapest: Semmelweis Kiadó; 2009. p. 339-54. 3. Pennisi E. Breakthrough of the year: Human genetic variation. Science 2007;318:1842-3. 4. Moffatt MF, Kabesch M, Liang L, Dixon AL, Strachan D, Heath S, et al. Genetic variants regulating ORMDL3 expression contribute to the risk of childhood asthma. Nature 2007;448:470-3. 5. Ober C, Tan Z, Sun Y, Possick JD, Possick JD, Pan L, et al. Effect of variation in the CHI3L1 gene influences serum YKL-40 levels, asthma risk, and lung function. N Engl J Med 2008;358:1682-91. 6. Himes BE, Hunninghake GM, Baurley JW, Baurley JW, Rafaels NM, Sleiman P, et al. Genome-wide association analysis identifies PDE4D as an asthma-susceptibility gene. Am J Hum Genet 2009; 84:581-93. 7. Weidinger S, Gieger C, Rodriguez E, Baurecht H, Mempel M, Klopp N, et al. Genome-wide scan on total serum IgE levels identifies FCER1A as novel susceptibility locus. PLoS Genet 2008; 4(8):e1000166. 8. Hancock DB, Romieu I, Shi M, Sienra-Monge JJ, Wu H, Chiu GY, et al. Genome-wide association study implicates chromosome 9q21.31 as a susceptibility locus for asthma in Mexican children. PLoS Genet 2009;5(8):e1000623. 9. Choudhry S, Taub M, Mei R, Rodriguez-Santana J, Rodriguez- Cintron W, Shriver MD, et al. Genome-wide screen for asthma in Puerto Ricans: evidence for association with 5q23 region. Hum Genet 2008;123:455-68. 10. Allen M, Heinzmann A, Noguchi E Abecasis G, Broxholme J, Ponting CP, et al. Positional cloning of a novel gene influencing asthma from chromosome 2q14. Nat Genet 22003;35:258-63. 11. Noguchi E, Yokouchi Y, Zhang J, Shibuya K, Shibuya A, Bannai M, et al. Positional identification of an asthma susceptibility gene on human chromosome 5q33. Am J Respir Crit Care Med 2005; 172:183-8. 12. Nicolae D, Cox NJ, Lester LA, Schneider D, Tan Z, Billstrand C, et al. Fine mapping and positional candidate studies identify HLA-G as an asthma susceptibility gene on chromosome 6p21. Am J Hum Genet 2005;76:349-57. 13. Laitinen T. Gene mapping in asthma-related traits. Methods Mol Biol 2007;376:213-34. 14. Zhang Y, Leaves NI, Anderson GG és mtsai. Positional cloning of a quantitative trait locus on chromosome 13q14 that influences immunoglobulin E levels and asthma. Nat Genet 2003;34:181-6. 15. Van Eerdewegh P, Little RD, Dupuis J, Del Mastro RG, Falls K, Simon J, et al. Association of the ADAM33 gene with asthma and bronchial hyperresponsiveness. Nature 2002;418(6896):426-30. 16. Childhood Asthma Management Program Research Group. The Childhood Asthma Management Program (CAMP): design, rationale, and methods. Control Clin Trials 1999;20:91-120. Szalai: Az asthma genomikai háttere LAM 2010;20(12):835 841. 841