A vércsoport v rendszereket érintő genetikai variációk, szerepük k a mindennapi transzfúziológiai ziológiai gyakorlatban Tordai Attila OVSZK Molekuláris Diagnosztikai Labor Transzfúzi ziólógiai szinten tartó tanfolyam Bp. 2013. ápr.
Tartalomjegyzék 1. A vércsoport v antigének nek genetikai háttereh 2. Ízelítő a módszerekbm dszerekből 3. A genotipizálás jelentősége a transzfúziol ziológiai gyakorlatban
A vércsoport v antigének nek molekuláris ttörténelme Egy vvs membrán n fehérje (glikoforin( A) aminosavsorrendjének nek első meghatároz rozása, M/N vércsoport v molekuláris háttere: h 1975-1976 1976 (Tomita&Marchesi( Tomita&Marchesi) Egy vércsoport v antigént kódolk doló cdns (glikoforin C, Gerbich) ) szekvencia első leírása: 1986 (Colin) A két k t legfontosabb vércsoport v antigén, n, az ABO és s az Rh molekuláris alapjainak első közlése: 1990 (Yamamoto( Yamamoto; Avent) 2009: : 30 vércsoport v rendszer, 270 antigén, n, jóval j több t allél. l.
A 30 db vércsoport molekuláris háttere 19/30 (66%) TM; 4/30 (14%) GPI (glikozil-foszfatidil-inozitol); 1/30 plazmából adszorb. 6/30 (20%) transzferáz Veldhuisen 2009; Vox Sang és Mollison s
Antigének nek és és allélek lek megoszlása sa csopor- tonként nt Avent 2008; Brit J Haematol 144:3.
A variabilitás s DNS-szintű mechanizmusai Egyetlen bázist b érintő nukleotid-vari variáns: single nucleotid polymorphism (SNP) aminosavcsere: : az antigének nek mintegy 2/3-ánál Storry 2004; Br J Haemat 126:759.
Egyes minor vércsoport v antigének nek molekuláris szerkezete Klein HG & Anstee DJ eds 2005; Mollison s Blood Transfusion
A vércsoport v antigének nek molekuláris szerkezete Reid ME & Lomas-Francis C eds 2004; The Blood Group Antigen Facts Book
Az ABO antigének nek molekuláris háttereh A antigén: csak α-n-acetil-galaktozaminil transzferáz aktivitás (176Arg, 235Gly, 266Leu & 268Gly) B antigén: csak α-galaktozil transzferáz aktivitás (176Gly, 235Ser, 266Met & 268Ala) AB antigén: mindkettő (összetett heterozigóta) O antigén: egyik sem (1 bp deléció, frameshift mutáció, megrövidült fehérje termék)
Az RhD transzmembrán n fehérje Variáns Allo-antitest RhD fehérje variáció Expresszió Parciális D minőségi klinikailag jelentős extracelluláris normál (10 000/sejt) Gyenge D mennyiségi igen ritkán képződik transzmembrán/intra celluláris csökkent (100/sejt)
1. A vércsoport v antigének nek genetikai háttereh 2. Ízelítő a módszerekbm dszerekből 3. A genotipizálás jelentősége a transzfúziol ziológiai gyakorlatban
Bázis komplementaritás Célkeresztben a DNS
DNS-izolálás, pre-analitika Kiindulási anyag: Alvadásg sgátolt vér/csontvelv r/csontvelő (EDTA) (fagyasztható, illetve hűtve h több t napig tárolhatt rolható); Szűrőpap papírra cseppentett és s beszárított vér v r (ujjszúrás); s); Magzati sejtek: chorion boholy mintavétel tel (CVS) vagy amnion folyadék k sejtjei (AC); Szájöbl blítés útján n nyert szájny jnyálkahártya sejtek; Szövetminta. Módszer: saját t (házi) reagensek, illetve gyári kitek. Vörösvérsejt-mentesítést st követk vetően: en: Fehérje mentesítés s + nukleinsav precipitáci ció ( kisózás ); Specifikus nukleinsav adszorpció speciális felületekhez. letekhez.
Amplifikáció -- --PCR 5 3 3 5 5 Duplaszálú DNS minta A) Denaturálás (95 C) 3 5 Egyszálú DNS minta B) Primer kitapadás (50-65 65 C) 5 3 A reakció összetevői: 1.) DNS templát 2.) Taq polimeráz 3.) dntp 4.) Primerek: 18-25 bp oligonukleotid cél-szekvencia specifikus 5.) Megfelelő ph, ionok 3 Primerek kitapadása 5 3 C) Lánchosszabbítás (72 C) Taq DNS polimeráz ISMÉTLÉS: 25-40 x
Amplifikáció -- --PCR Kettős szálú DNS templát 3. CIKLUS 1. CIKLUS 2. CIKLUS n. CIKLUS
Polimeráz z lláncreakció (PCR) kkészülékek kek
Post-PCR PCR munkafolyamatok Termék-kimutatás gél-elektroforézissel: PCR-SSP (sequence specific primers), PCR-SSO (sequence specific oligonucleotides) Emésztés restrikciós endonuklázzal: RFLP (restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus) Fluoreszcens detektálás: Hibridizációs oligonukleotid ( probe ) FRET (fluoreszcencia energia transzfer) Szekvencia-analízis láncterminációs technikával (Sanger) Hidrolízis oligonukleotid ( probe ) TaqMan
Vércsoport tipizálás PCR-SSP-vel Prager 2007; Transfusion 47:54S.
A HFE gén C282Y mutációjának (SNP) kimutatása PCR-RFLP RFLP módszerrel 1. hasítatlan PCR termék 2. normál 3. heterozigóta 4. homozigóta 393 251 1 2 3 4 restrikciós enzim: Rsa I 142 112
SNP-vizsgálat valós s idejű PCR-rel és s fluoreszcens jelölésű oligonukleotidokkal Saját tervezésű, jelölt/jel lt/jelöletlen letlen szintetikus oligonukleotidok Normál genotípus Heterozigóta Homozigóta mutáns Negatív kontroll
Szekvencia-analízis analízis (Sanger) Módszer: lánctermináció fluoreszcensen jelölt didezoxi (módosított) nukleotidokkal (BigDye terminator kit) Lépések: Amplifikáció PCR-rel PCR termék tisztítás Szekvenáló reakció Termék tisztítás Analízis: kapilláris elektroforézis T CG T AACGC T AG T C
Szekvencia-analízis analízis (Sanger) kontroll C>T transzverzió variáns heterozigóta ta
Definició: Array-technológia Array = makromolekulák k térben t rendezett, hordozóhoz hoz (chip) rögzített sorozata. Fajtái: o Macro (10-1000 1000 spot, méret>300m ret>300µm, membrán) o Micro (1000-100 000 spot, méret<300m ret<300µm, szilikon chip) o oligonukleotid; o cdns (komplementer DNS); o DNS; o fehérje; o antitest. Kulcsszó: Hibridizáci ció = specifikus kapcsolódás s a bázisb zis- komplementaritás s elve alapján.
mrns expresszió összehasonlítás array technikával
1. A vércsoport v antigének nek genetikai háttereh 2. Ízelítő a módszerekbm dszerekből 3. A genotipizálás jelentősége a transzfúziol ziológiai gyakorlatban
Csodaszer-e e a genotipizálás??? genotípus = fenotípus a gén g n nem közvetlenk zvetlenül l az antigén n fehérj rjét t kódolja k (transzferáz:: ABO, H, I, P-szintáz: : GLOB) homológ g gének g (RHD & RHCE) antigén n hiány, null-fenot fenotípus: : nem ismert non-sense mutáci ció, inaktiváló mutáci ció,, fehérje expressziót t befolyásol soló mutáci ció miatt ál l pozitív v antigén predikció a recipiens tipizálásn snál l probléma.
A DNS-alapú vércsop.. tipizálás s alkalmazási lehetőségei Beteg oldal: 1. KözelmK zelmúltban ltban (esetleg többszt bbször) transzfundált beteg: elősegítheti az allo- és az autoantitestek elkülönítését, azonosítását, ellentmondó szerológiai eredmény tisztázását; transzplantációnál donor-dns utólagos tesztelése. vvs: pl. AIHA-esetek. 2. Immunglobulinnal fedett vvs 3. Prenatális vizsgálat: ÚHB újszülöttkori hemolitikus betegség (HDFN) kockázata esetén a magzati vércsoport korai előrejelzése (akár anyai plazmából); az apai zigótaság (hetero/homo) megállapítása. Donor oldal: 4.. Donor kivizsgálás: s: A gyakori antigénekre negatív donor-pool növelése automatizálható tömeg-szűrés; Gyenge vagy nem hozzáférhető antitest esetén: pl. anti-do a, -Do b, - Js a, -Js b. -C W, -V, -VS; Ellentmondások (pl. ABO) feloldása -- minőségbiztosítás; Gyenge, minor antigént kódoló variánsok, RhD-variánsok.
Ritka donorok Ha >500 donort kell vizsgálni, hogy 1 megfelelőt találjunk, Antigén-kombináció hiánya, Gyakori antigén hiánya. Ritka donorokra lehet szükség: Örökletes betegségek: sarlósejtes anaemia, thalassemia, Szerzett kórképek: autoimmun hemolitikus anaemia (AIHA), aplasztikus anaemia, myelodysplasia, antineoplasztikus kezelés. Vércsoport-tipizálás: DNS-alapú tesztek (array-, gyöngyös rendszerek) és a hemagglutináció kombinációja: antigén-, reagens-, populáció-függő (antigének populációs gyakoriságának felmérése szükséges).
A jelenlegi rutin transzfúziológiai ziológiai gyakorlatban alkalmazott DNS-technikák 1. Kis mintaszám m (low( throughput): PCR-SSP (allél specifikus primerek) PCR-RFLP (allél-specifikus emésztődés restrikciós enzimmel) Fluoreszcens technikák (hibridizációs, hidrolízis oligonukleotidok) 2. Nagy mintaszám m (high( throughput): Beadchip (Bioarray): 24 antigén, 18 SNP BLOODchip (Progenika): 47 antigén, 116 SNP Luminex xmap (Luminex): 16 antigén, 8 SNP
Jelen Lehetséges algoritmusok (közel)jövő Anstee DJ. 2009; Blood 114:248.