A vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns rendszer összefüggése újszülöttekben és koraszülöttekben Dr Szabó Miklós Témavezeto: Dr Vásárhelyi Barna Semmelweis Egyetem Budapest I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika 2005 Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola
Tartalomjegyzék Összefoglalás Summary oldalszám 1. Rövidítések jegyzéke 6 2. Bevezetés 7 3. Irodalmi áttekintés 8 3.1. Szabadgyökök képzodése 8 3.1.1. Lipidperoxidáció 8 3.1.2. Oxigéntartalmú szabadgyökök képzodése 9 3.2. A reaktív oxigéngyökök mediálta betegségek 11 újszülöttkorban 3.2.1. Reaktív oxigéngyökök szerepe a BPD kialakulásában 11 3.2.2. Reaktív oxigéngyökök szerepe a HIE kialakulásában 12 3.2.3. ROP és szabadgyökök. Az oxigénkezelés hatása 13 3.2.4. Transzfúziók szerepe a BPD és a ROP kialakulásában 13 3.3. Az antioxidáns védelem 14 3.3.1. A vasháztartásban és az antioxidáns védekezésben egyaránt 16 szerepet játszó plazma faktorok 3.3.1.1. Ceruloplazmin 17 3.3.1.2. A ceruloplazmin antioxidáns hatása 17 3.3.2. Transzferrin 17 3.3.3. Ferritin 18 3.3.3.1. A ferritin szerepe a szabadgyök reakciókban 18 3.4. Vasmetabolizmus és vérképzés újszülöttekben és 19 koraszülöttekben 3.4.1. A szérumvas szint változásai a perinatális idoszakban 19 3.4.2. A vérképzés változásai a méhen belüli idoszakban 19 3.4.3. A vérképzés és a vasháztartás akut változásai a megszületést 19 követoen 3.4.4. Anémia a perinatális idoszakot követoen 20 3.4.4.1. Rekombináns humán eritropoetin alkalmazása kissúlyú 21 koraszülöttekben 3.4.4.2. Rekombináns humán eritropoetin (rhuepo) hatása 23 koraszülöttek vasháztartá-sára, vaspótlás rhuepo kezelés alatt 3.4.4.3. Az EPO és eritroid hatásai 23 3.4.4.4. Az EPO nem-eritroid hatásai 23 1
4. Célkituzések 25 5. Betegek és módszer 26 5.1.1. A szérumvas és extracelluláris (EC) antioxidáns kapacitás akut 26 perinatális változásainak vizsgálata. A szabadvas és a vasháztartásban szerepet játszó antioxidáns faktorok összefüggése érett egészséges újszülöttekben a perinatális idoszakban 5.1.2. Koraszülöttek rhuepo kezelésének hatása a transzfúzió igényre 27 és a vasháztartásra. A vasháztartás változás összefüggése az antioxidáns kapacitással 5.2. Laboratóriumi vizsgálatok 29 5.2.1. Vasanyagcsere és vérkép vizsgálatok 29 5.2.2. Antioxidáns védekezoképesség vizsgálatok 29 5.3. Statisztikai módszerek 32 6. Eredmények 33 6.1 A vasháztartás és az EC antioxidáns kapacitás változásai érett 33 egészséges újszülöttekben a korai posztnatális idoszakban 6.1.1.1. A szérumvas szintjének változásai 33 6.1.1.2 A fehérjéhez nem kötött vas frakció, a szabadvas (NPBI) 34 változásai 6.1.2 Antioxidánsok változása 35 6.1.2.1. Ferroxidáz aktivitás (ceruloplazmin) 35 6.1.2.2. Ferritin változásai 36 6.1.2.3. Szekunder antioxidánsok hatását tükrözo antioxidáns kapacitás 37 változása 6.1.2.4. Vasredukáló képesség (FRAP) posztnatális változása 37 6.1.2.5. Lipidperoxidáció gátló képesség változása 38 6.1.3. Az antioxidáns kapacitás és a vas-metabolizmus összefüggése 39 6.2 A rhuepo kezelés hatásai koraszülöttek vérképzésére, 40 transzfúzió igényére, vasháztartására és az EC antioxidáns kapacitásra 6.2.1. RhuEPO hatása a vérképzésre és transzfúzió igényre 41 6.2.1.1. Relatív retikulocita szám változásai 41 6.2.1.2. A hematokrit értékek változásai 42 6.2.1.3. Transzfúziók száma 42 6.2.1.4. Szövodményállapotok gyakorisága és mellékhatások 44 6.2.2. Vasháztartás paramétereinek változása rhuepo kezelés 45 hatására 6.2.2.1. Szérumvas változása rhuepo kezelés hatására 45 6.2.2.2. A szérum transzferrin szint rhuepo kezelés során 46 6.2.2.3. Számított szabad vasköto kapacitás 47 6.2.2.4. Ferritin változása 48 6.2.3. 1 hetes rhuepo kezelés hatása koraszülöttek EC antioxidáns kapacitására 48 2
7. Megbeszélés 50 7.1. Újszülöttek perinatális vasanyagcsere változásainak összefüggése az antioxidáns védekezoképességgel 7.2. A rhuepo kezelés hatásai koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére és vasháztartására 50 53 8. Tézisek és gyakorlati jelentoség 57 9. Publikációs lista 59 10. Irodalomjegyzék 60 11. Köszönetnyilvánítás 69 3
Összefoglalás Vizsgálataimmal a vasháztartás és az EC antioxidáns kapacitás összefüggéseit tanulmányoztam újszülöttekben és koraszülöttekben. Elsoként egészséges újszülöttek megszületés utáni vérmintáinak vizsgálatával arra a kérdésre kerestem a választ, hogy az EC antioxidáns védekezo képesség hogyan változik a korai neonatális adaptáció idoszakában. Az antioxidáns kapacitás vizsgálatokat a vasháztartás paramétereinek egyideju mérésével végeztem el. Az eredmények alapján arra a következtetésre jutottam, hogy az újszülöttek EC antioxidáns kapacitása röviddel a megszületés után megemelkedik, jelezve, hogy az újszülött szervezete az oxidatív terhelés ellenére, képes fokozni antioxidáns védekezését. A primer és a szekunder antioxidánsok aktivitása egyaránt növekszik posztnatálisan. A szérum vas és ferritin szintjében bekövetkezo hasonló ütemu, gyors változások részben magyarázatul szolgálnak az antioxidáns védekezo képesség posztnatális javulására. Eredményeim arra utalnak, hogy az oxidatív környezet, születés okozta, megváltozásához történo gyors alkalmazkodásban, a vas-metabolizmus szélsoséges változásai lényeges szerepet töltenek be. További vizsgálataimmal igazoltam, hogy a rhuepo kezelés csökkenti a nagy morbiditású koraszülöttek transzfúzió igényét és mérsékeli a kóros szöveti vasraktározást. A rhuepo kezeléssel kapcsolatban a BPD és ROP szövodménybetegségek csökkeno elofordulásának tendenciáját észleltem. A rhuepo kezelés kezdeti szakaszában, a fokozott celluláris vasfelhasználás ellenére, rövidtávon sem a vas-metabolizmus paraméterei, sem az antioxidáns védekezo képesség nem változnak számottevoen. Eredményeim alapján azt a következtetést vontam le, hogy amennyiben a rhuepo kedvezo hatást gyakorol az antioxidáns rendszerre, akkor az csak hosszabb kezelési idoszak után válik kimutathatóvá. A rhuepo BPD-ra és ROP-ra gyakorolt esetleges kedvezo hatását nagy esetszámú, további vizsgálatokkal lehet tisztázni. 4
Summary The aim of our work was to investigate the association between iron metabolism and extracellular antioxidant capacity in human neonates. First, I tested the alteration of antioxidant capacity in blood specimens during the early postnatal adaptation. Simultaneously, I also measured parameters of iron metabolism. Our results indicate that extracellular antioxidant capacity of the neonate is increasing dramatically shortly after birth, indicating that neonates are able improve their antioxidant defence mechanisms in spite of oxidative stress. Both primary and secondary antioxidant activities increase during the early postnatal period. Similar kinetics of serum iron and ferritin may be an explanation for the postnatal improvement of antioxidant capacity. Our results indicate that alterations of iron metabolism may play an important role in early postnatal adaptation to extrauterine oxidative conditions. In clinical studies I demonstrated that treatment with rhuepo decreases the transfusion requirements of preterm infants with high morbidity. Treatment with rhuepo is also protective against abnormal iron deposition in tissues. I observed a decreased tendency for BPD and ROP in preterm infants treated with rhuepo. In spite of accelerated cellular iron consumption I could not, however, demonstrate any short-term impact of rhuepo on the parameters of iron metabolism and antioxidant capacity. These results indicate that any effect of rhuepo on antioxidant capacity may be anticipated after a longer treatment period. Possible impact of rhuepo on the risk of BPD and ROP should be tested with meta-analysis of the results of large clinical trials. 5
1. Rövidítések jegyzéke BPD CRIB EC EPO FRAP Hgb HIE HSAA Htk MDA NPBI NEC PDA PVL Randox TAS rhuepo ROP stfr TVK TcSat Bronchopulmonális diszplázia Clinical risk index for babies Extracelluláris tér Eritropoetin Ferric reducing activity of the plasma Hemoglobin Hypoxiás ischaemiás encephalopathia Hem-specifikus antioxidáns aktivitás Hematokrit Malondialdehyd Non-protein bound iron, ( fehérjéhez nem kötött, szabadvas) Nekrotizáló enterocolitis Perzisztáló ductus arteriosus Periventrikuláris leukomalacia Randox total antioxidant status Rekombináns humán eritropoetin Koraszülött retinopátia Szolubilis transzferrin receptor Teljes vasköto kapacitás Transzkután oxigén-szaturáció 6
2. Bevezetés Fél évszázadra tekint vissza az a megfigyelés, hogy az inadekvát oxigénterápia súlyos megbetegedést okozhat koraszülöttekben. A maradandó szervkárosodással járó neonatológiai szövodménybetegségek, mint a retrolentáris fibroplázia (ROP), bronchopulmonális diszplázia (BPD), a periventrikuláris leukomalacia (PVL) és hypoxiás-ischaemiás encephalopathia (HIE) keletkezésében nagy jelentoséggel bírnak a szabadgyökök közvetítette patológiás folyamatok. Az intenzív kutatás ellenére a mai napig nem sikerült a mindennapi gyógyítás számára hatékony antioxidáns kezelést vagy terápiát kidolgozni. Ennek a hátterében az állhat, hogy az antioxidáns rendszer perinatális fiziológiája is csak részletekben ismert. A sejtmembrán károsodása szempontjából a szabadgyökök közül kitüntetett szereppel bír a legtoxikusabb hatású szabad hidroxilgyök. Keletkezése a Fenton-reakció során a szabad, fehérjéhez nem kötött vas jelenlététol függ. Így a szervezet számos, a szabadgyök képzést meghatározó mechanizmusa közül a vasforgalomban résztvevo proteinek aktivitása, és koncentrációja nagy szerepet játszik abban, hogy a szabadgyök terhelés nyomán létrejön-e szervkárosodás. Az újszülöttek és koraszülöttek vasforgalmának perinatális fiziológiás változásai a vasháztartást jellemzo paraméterek rövidtávú, szélsoséges változásait eredményezik. Korábban nem történt olyan átfogó, klinikai szintu vizsgálat, amely a vasháztartás és a vasfüggo antioxidáns tulajdonságok perinatális, egyideju változásait, és ezek lehetséges kapcsolatát vizsgálta volna újszülötteken. Ezen összefüggések mélyebb megismerése két szempontból is indokolt. Egyre világosabban körvonalazódik, hogy az érett újszülöttek hypoxiás ischaemiás károsodásainak, elsosorban az encephalopathiának egyik lehetséges jövobeni terápiája a reperfúzió során keletkezett extrém mennyiségu szabadvas semlegesítésében rejlik. Másrészt egyre kiterjedtebben kerül alkalmazásra koraszülöttekben a vasháztartás mélyreható változásait okozó eritropoetin kezelés. Kutatómunkám során ezért az újszülöttkori vasháztartás perinatális változásának a leírását tuztem ki célul. Ennek során elemeztem a vasháztartás és az antioxidáns kapacitás változásainak összefüggését, illetve kitértem a vasháztartás és az azt alapvetoen befolyásoló rekombináns humán eritropoetin (rhuepo) kezelés közötti kapcsolatra. 7
3. Irodalmi áttekintés 3.1. Szabadgyökök képzodése A szabadgyökök olyan molekulák, amelyeknek külso elektronhéján egy vagy több párosítatlan elektron található, és ennek köszönhetoen igen reakcióképesek. Fiziológiás körülmények között is keletkeznek szabadgyökök, ezek azonban nem jelentenek veszélyt az organizmus számára, mindaddig, amíg a védekezo mechanizmusok megfelelo egyensúlyt tartanak fenn. Az emberi szervezetben legrészletesebben ismert két szabadgyök keletkezési út a lipidperoxidáció és az oxigén tartalmú szabadgyökök képzodése. 1 3.1.1. Lipidperoxidáció A lipidperoxidáció során a többszörösen telítetlen zsírsavakból reaktív molekulák képzodhetnek, amelyek láncreakció-szeruen további szabadgyökök képzodését eredményezik. A folyamat három szakaszra osztható. 2 1. Iniciáció: valamilyen szabadgyök hatására a lipid (R) hidrogénelvonással lipidszabadgyökké (R. ) alakul X. + R? R. + XH 2. Propagáció : a keletkezett lipid-szabadgyök könnyen reagál molekuláris oxigénnel, és így lipidperoxid (ROO. ) képzodik (a), amely a környezetében lévo molekulákat, többek között újabb többszörösen telített zsírsavakat képes oxidálni. Az oxidált molekuláról elvont hidrogén segítségével átmenetileg lipid-hidroperoxid (ROOH) alakul ki (b). Spontán, de még inkább valamilyen katalizáló fém ion (vas, réz) jelenlétében hidroxil (OH. ) és alkoxid (RO. ) gyökök keletkeznek (c), másrészt lipidperoxidok keletkezhetnek (d). 8
a, R. + O 2? ROO. b, ROO. + RH? ROOH + R. c, ROOH? OH. + RO. d, ROOH + fémion (n)+? ROO. + fémion (n-1)+ H + 3. Termináció: a folyamat befejezo részeként stabil végtermékek jönnek létre (pl. malondialdehid). A korábbi folyamatok során kialakult gyökök egymással reagálva a reakciók a folyamat befejezodését eredményezik. 2 ROO.? ROOR + O 2 ROO. + R.? ROOR 2 R.? RR 3.1.2. Oxigéntartalmú szabadgyökök képzodése Az aerob energiatermelés során az oxigén redukciója vízzé bekövetkezhet egy lépésben, citokróm-oxidáz hatására, de az oxigén kisebb hányada más enzimatikus és nem enzimatikus utakon igen reaktív molekulákká például szabadgyökökké, illetve hidrogénperoxiddá redukálódik. A részlegesen redukált oxigén- metabolitok kialakulásának enzimatikus útjai A részlegesen redukált oxigén- metabolitok képzodésének nem enzimatikus útjai Haber-Weiss reakció O 2.- + H 2 O 2? O 2 + OH - + OH.- Fenton-reakció Fe 2+ + H 2 O 2? Fe 3+ + OH - + OH.- O 2?- + Me n+1 Me n + O 2 Me n + H 2 O 2 Me n+1 +? OH + OH - O 2?- + H 2 O 2 fém O2 +? OH + OH - 1. sz. ábra: A Fenton- és a Haber-Weiss reakció egyenlete 9
Az oxigénmetabolitok közül a legagresszívabb és egyben a legrövidebb élettartamú a hidroxilgyök. Keletkezése in vivo a Haber-Weiss reakció révén termodinamikailag lehetséges, de a szervezetben általában eloforduló alacsony szuperoxid anion és hidrogénperoxid koncentráció mellett nem játszódhat le. Így a hidroxilgyök keletkezése elsosorban vas jelenlétében, a Fenton reakció révén következik be a kevésbé hatékony szuperoxid anionból, s a még gyengébb oxidáns hidrogénperoxidból. A biológiai rendszerekben a vas kitüntetett szerepet játszik a fenti szabadgyök-képzési folyamatokban és így a szabadgyök okozta szövetkárosodásban. A Fenton-reakció során a vas, miközben ferro-ionból ferri- formává alakul, hidroxilgyök képzését teszi lehetové. Ferriferro átalakulás esetén a lipidperoxidáció során kevésbé hatékony lipid-hidroperoxidból agresszívabb alkoxilgyököt, illetve lipidperoxidot alakít ki. 3 Ezen reakciók katalizálására csak a kémiai kötésben nem lévo, úgynevezett szabadvas (non-protein bound iron) képes. Azok a molekulák, ill. rendszerek, amelyek a vasat kötött formában tartják, antioxidáns hatásúak, mert a fenti reakciókhoz nem engedik hozzáférni a vasat. Emiatt a vas- metabolizmusból ismert fehérjék: a transzferrin, ceruloplazmin, ferritin mind antioxidáns hatásúak. 10
3.2. A reaktív oxigéngyökök mediálta betegségek újszülöttkorban A reaktív oxigéngyökök jelentoségét három perinatális betegség - a bronchopulmonális diszplázia (BPD), a koraszülött retinopátia (ROP) és az újszülöttek hypoxiás ischaemiás encephalopathiájának (HIE) - kialakulásában korábban már bizonyították. Kimutatták, hogy az egyéb tényezok mellett a szabadgyök-károsodás hozzájárul a sejt- és szövetkárosodások kialakulásához. Ezért igen nagy a jelentosége a perinatális szabadgyök-terhelés hátterében álló folyamatok és így a potenciális kezelési lehetoségek megismerésének. 4 3.2.1. Reaktív oxigéngyökök szerepe a BPD kialakulásában A szabadgyökök protein denaturációt, DNS károsodást és lipidperoxidációt okoznak, így cytotoxikus hatásúak a tüdo alveoláris-, endothel- és parenchyma-sejtjeire és az alveoláris makrofágokra. A szabadgyökök gátló hatást fejtenek ki a surfactant szintézisre is, gátolják a hypoxiára adott pulmonális vaszkuláris válaszreakciót, csökkentik a tüdo fibroblasztjainak regenerálódását, kóros kollagén depozíciót okoznak, csökkent alveolarizációt és a tüdo csökkent növekedését eredményezik. Fokozzák az alveoláris membrán permeabilitását, az alveoláris térbe történo plazma-beáramlást, amely végül surfactant-degradációt eredményez. 5 Klinikai szintu bizonyíték a szabadgyökök BPD kialakulásában játszott centrális szerepére vonatkozóan az, hogy beteg koraszülöttekben, akiknél késobb BPD alakul ki, korai markerként a kilélegzett gázkeverékben megemelkedik a hidrokarbonok (lipidperoxidációs végtermékek) mennyisége, illetve no a szérum malondialdehid szint. A BPD kialakulásának fontos korai eseménye, hogy gyulladásos sejtek, döntoen neutrofil granulociták migrálnak az alveoláris térbe, amelyek a toxikus oxigénmetabolitok képzodését tovább fokozzák. Állatkísérletben pusztán oxigén belélegeztetéssel a fenti patofiziológiai történések eloidézhetoek. A tüdo alveoláris antioxidáns védekezését a lokális tényezok kifejezettebben befolyásolják, amit tükröz, hogy a glutation koncentrációja az alveoláris folyadékban 100-szorosa a plazmáénak. Az alveoláris mosófolyadékban az 1. életnapon mért glutation koncentrációja és a BPD kockázata között fordított összefüggést igazoltak. 6 A lokális tényezok mellett a vas mediálta szabadgyök-reakcióknak is nagy jelentosége van a korai tüdokárosodás kialakulásában. A korai tüdokárosodás során az alveoláris térbe történo 11
plazma beáramlásnál a plazma surfactant degradáló hatása annál kifejezettebb, minél kisebb annak apotranszferrin tartalma. Minél éretlenebb a koraszülött, annál kevesebb az apotranszferrinje, annál jobban degradálódik a surfactant. Állatkísérletben a vasdepléció csökkenti a kísérletesen kiváltott tüdokárosodás mértékét. 3.2.2. Reaktív oxigéngyökök szerepe a HIE kialakulásában A maradandó idegrendszeri károsodáshoz vezeto szülési asphyxia (HIE) patomechanizmusában, az inzultust követo vazoregulációs zavar, a másodlagos energiaválság, az excitátoros neurotranszmitter-felszabadulás, az aktiválódó gyulladásos- és apoptózis válasz kiváltásában dönto szerepet játszik az oxigén-túlkínálat ill. a reaktív oxigén gyökök felszabadulása. Az elmúlt évek szüloszobai reszuszcitációval kapcsolatos vizsgálatai rávilágítanak arra, hogy a mérsékelt hypoxiás inzultust követo reperfúzió során akár rövid ideig fe nnálló hyperoxiának, és a következményes szabadgyök-túlkínálatnak hosszú távú biokémiai és klinikai következményei vannak. Vento vizsgálatai szerint, ha a szüloszobai reszuszcitáció100 %-os oxigénnel történik, hetekig kimutatható a vörösvérsejteket ért fokozott oxidatív stressz. 7 Állatkísérletek tanúsága szerint a 100 % oxigénnel történt élesztést követoen a kísérleti állatok mortalitása és neurológiai státusza rosszabb, mintha 21 % oxigénnel történik a reszuszcitáció. A HIE kialakulásában a legrégebben felismert szabadgyökös mechanizmus az asphyxia során a hypoxantin felhalmozódás, amely aztán a reperfúzió során uráttá oxidálódik további szabadgyökök felszabadulásának kíséretében. A xantin-oxidáz enzim ill. az aktivált leukociták által termelt szuperoxid gyök hatására ferritinbol vas szabadul fel. A felszabaduló, fehérjéhez nem kötött vas hatására a Fenton-reakció során lipidperoxidációt okozó szabad hidroxilgyök termelodik. A szabadvas szintje mind szülési asphyxiában, mind koraszülötteknél igazoltan no. Az asphyxia után a plazmában ill. a vörösvérsejtekben kimutatható szabadvas mennyisége az egyik legjobb, ma ismert biokémiai indikátora a késobb kialakuló maradandó neurológiai károsodásnak. 8, 9 Az oxigéntartalmú szabadgyökök patofiziológiai szerepét bizonyítja az is, hogy egyes antioxidánsok hatásosnak bizonyultak kísérletesen kiváltott asphyxia neuronkárosító hatásának kivédésében. A szuperoxid dizmutáz kezelés csökkentette kutyakölykök asphyxia okozta agyvérzését.a xantin-oxidázt gátló allopurinol terápia állatkísérletben csökkentette az ischaemiás agykárosodás mértékét. 11 Humán vizsgálatban az allopurinol az újszülöttek szülési asphyxiáját követoen javította az 12
agyi elektromos funkciót és az agyi vérátáramlást. 12 Végül a szabadvasat elimináló kelátor terápiák hatásosnak bizonyultak állatkísérletekben a kísérletesen okozott asphyxia neuronkárosító hatásának kivédésére. 13 3.2.3. ROP és szabadgyökök. Az oxigénkezelés hatása A koraszülöttek kezelésében 1930-as évektol vezették be az oxigén használatát. Az 50-es, 60- as években egyértelmuvé vált az oxigén etio-patológiai szerepe a ROP-ban; az oxigénadás korlátozása a ROP kialakulásának csökkenését eredményezte. A 70-80-as években azonban annak ellenére, hogy a biztonságosnak tekintett oxigén szintek alkalmazásának technikai lehetoségei jelentosen javultak, újra emelkedett a ROP elofordulási gyakorisága. Az ok legvalószínubben az extrém éretlen koraszülöttek túlélésének növekedése volt. 14 Bár a fiziológiásnak hitt transzkután oxigénszaturációs (TcSat) értékeknél alacsonyabb TcSat értékek mellett kisebb a ROP kialakulásának rizikója 15, 16, mára világossá vált, hogy nemcsak az oxigén expozíció, hanem a gyulladás és az éretlenségbol fakadó csökkent antioxidáns védelem egyaránt hozzájárulnak a betegség kialakulásához. 17 3.2.4. Transzfúziók szerepe a BPD és a ROP kialakulásában A terápiásan alkalmazott oxigén egyértelmu patofiziológiai szerepe mellett számos vizsgálat hívta fel a figyelmet a koraszülötteknél alkalmazott transzfúziók mennyisége és a ROP kialakulása közötti pozitív korrelációra. 20 Inder a ROP kialakulása és az elso élethéten kapott transzfúziók mennyisége, továbbá a 7. életnapi magas szérum vas és emelkedett transzferrin szaturáció között talált összefüggést. 21 Cooke és mtsai a transzfúziók és a BPD kialakulásának összefüggését kutatva azt mutatták ki, hogy a BPD-s koraszülöttek kétszer több transzfúzióra szorultak, ferritin szintjük magasabb, transzferrin szintjük alacsonyabb volt azokhoz képest, akiknél nem alakult ki BPD. A BPD-s csoportban a koraszülöttek többségében szabadvas volt kimutatható. 22 Korábban a ROP kockázatának emelkedésében a HgbA-t tartalmazó transzfundált felnott vér oxigén disszociációs sajátosságának, az így elért magasabb szöveti oxigén szinteknek tulajdonítottak kóroki szerepet. Ezzel szemben Sullivan elmélete szerint a transzfúziók adásakor az amúgy is kóros szöveti vasraktározás fokozódik, és növekedik a toxikus szabadvas megjelenésének kockázata, amely tovább súlyosbítja a ROP-ot. 23 13
3.3. Az antioxidáns védelem Az élo szervezet oxidációval szembeni legfobb védekezési mechanizmusa az oxigén alacsony szöveti nyomása (mintegy 29 Hgmm körüli). Ezen kívül az emberi szervezetnek hatékony antioxidánsok állnak rendelkezésére a nemkívánatos oxidáció megakadályozására. Az antioxidáns olyan molekula, amely az oxidálandó szubsztráthoz képest kis koncentrációban van jelen, és szignifikánsan lassítja, vagy teljesen gátolja annak oxidációját. A fiziológiás szabadgyökös reakciók szigorúan kontrollált körülmények között zajlanak. A szabadgyök-fogók jelentos mértékben szelektívek azokra a szabadgyökökre, amelyekkel reagálnak, míg a szukebb értelemben vett antioxidánsok az oxigénbol keletkezo reaktív intermedierek toxikus hatásaival szemben védenek. Ezeket oldékonyságuk szerint csoportosíthatjuk: 1. Lipidoldékony (pl. béta-karotin, E-vitamin, természetes kinonok-ubikinon). 2. Vízoldékony (pl. glutation, C-vitamin, szabad purinok-húgysav, NADPH / NADPrendszer). A nem enzimatikus antioxidánsokhoz tartoznak a zsír-, illetve vízoldékony vitaminok (különösen E és C vitamin, melyeknek szinergista hatása ismert), a táplálkozással felvett antioxidáns jellegu anyagok (flavonoidok, polifenolok, stb.) és az intracelluláris térben a legfontosabb vízoldható rendszer, a redukált / oxidált glutation (GSH/GSSG). Az enzimatikus antioxidánsok közül a legfontosabb a szuperoxid dizmutáz (SOD), amely a szuperoxid aniont, a kataláz, amely a H 2 O 2 -t, és a peroxidázok, melyek más egyéb peroxil-, alkoxilgyököket képesek eliminálni (2. ábra). 24 Ezek a fehérjék olyan fémiont tartalmaznak, melyek oxidációra / redukcióra képesek (SOD Mn ++, Fe ++, Cu ++ /Zn ++, kataláz Fe, peroxidáz, stb.). SOD: 2 O 2?? + 2 H + H 2 O 2 + O 2 kataláz: 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 peroxidáz: H 2 O 2 + RH 2 2 H 2 O + R 2. ábra: Antioxidáns enzimek példái és reakciói a szervezetben 14
A szabadgyökök eliminálására az antioxidánsoknak mindenütt jelen vannak, így beszélhetünk sejten belüli, sejten kívüli és membrán antioxidánsokról (1. táblázat) 1. táblázat. Antioxidánsok példái az emberi szervezetben Inracelluláris antioxidánsok: EC antioxidánsok: Membrán antioxidánsok: Szuperoxid dizmutáz (Cu, Zn, Mn) Kataláz Glutation-peroxidáz Citokróm-oxidáz (Cu) Transzferrin Ceruloplazmin Bilirubin Húgysav Albumin Laktoferrin Hemopexin Haptoglobinok Ferritin Aszkorbinsav Glükóz EC szuperoxid dizmutáz EC glutation-peroxidáz Lipoprotein antioxidánsok (? -tokoferol,? -karotin stb.) Vitamin E (? -tokoferol)?-karotin Coenzim Q Az antioxidáns hatás erossége az indukciós idovel jellemezheto. Minél hatékonyabb egy antioxidáns, annál hosszabb az indukciós periódus, vagyis annál késobb következik be a szubsztrát oxidációja. Az antioxidánsok hatásmechanizmus szerinti csoportosítás alapján primer vagy szekunder antioxidánsok lehetnek. A primer, más néven láncmegszakító antioxidánsok olyan vegyületek, amelyek semlegesíteni képesek a lipid-szabadgyököket, elsosorban azáltal, hogy hidrogén átadásával megszüntetik a gyökállapotukat, s kevésbé reaktív vegyületeket hoznak létre. Ezek a viszonylag stabil vegyületek már nem vesznek részt a lipidperoxidációban, ezért a láncreakció megszakad. Az elsorendu antioxidánsok (foleg fenolos szerkezetu molekulák, tokoferolok, galluszsav és származékai, flavonoidok és egyéb komponensek) az indukciós periódusban hatnak, jelenlétükben az oxidáció késobb kezdodik el. A másodrendu antioxidánsok például azáltal hatnak, hogy a lipidmolekulák helyett önmaguk oxidálódnak, vagy a reakciók során keletkezo átmeneti és végtermékeket alakítják 15
át nem toxikus formává. A szekunder antioxidánsok a tiszta lipidrendszerben általában nem igazán aktívak, de egyéb mikrokomponensek jelenlétében hatásosak: növelik a primer antioxidánsok hatásosságát, vagy gátolják a prooxidáns hatású vegyületek muködését. A természetes antioxidánsoknak ezen csoportjába tartoznak a foszfolipidek, amelyek az elsorendu antioxidánsokkal szinergizálnak, valamint a citromsav, amely komplexbe köti a prooxidáns hatású átmeneti fémionokat, amelyek már igen kis mennyiségben is képesek katalizálni a lipidperoxidációt. Az antioxidánsokra tehát jellemzo, hogy többféle hatásmechanizmus révén képesek gátolni az oxidációt, és sok esetben egymással szinergizálva hatnak. A szabadgyökös reakciókkal szembeni antioxidáns védelmi mechanizmus egy része (vitaminok, flavonoidok) csak a növényekben szintetizálódik, s ezekhez az emberi szervezet csak a táplálékkal jut hozzá, míg másokat elsosorban enzimeket, glukózt és húgysavat az ember szervezete is képes eloállítani. Fontosak azok a molekulák is, amelyek a mérgezo anyagokat eltávolítják, ilyenek például a glutation-s-transzferázok és a kinonreduktáz, valamint a biomolekulák szerkezetében bekövetkezett károsodásokat helyrehozó, úgynevezett javító enzimek. A kis molekulájú antioxidánsok közé tartozik a vitaminok közül a C-, az E- és az A-vitamin, valamint az utóbbi provitaminja, a bétakarotin. 3.3.1. A vasháztartásban és az antioxidáns védekezésben egyaránt szerepet játszó plazmafaktorok Azokat a molekulákat, amelyek gátolják a szabadgyökök kialakulását preventív, vagy primer antioxidánsoknak nevezik. Ezek elsosorban a ceruloplazmin, a transzferrin és a ferritin, amelyek egyben a vas transzportjáért és tárolásáért felelos proteinek. Azzal, hogy oxidálják és / vagy kötésben tartják illetve tárolják a vasat, a legtoxikusabb szabad 25, hidroxilgyök képzodését akadályozzák meg. 26 Mindezzel nagymértékben növelik a lipidperoxidációval szembeni ellenálló képességet. 3.3.1.1. Ceruloplazmin 16
Réztartalmú alfa-2 glikoprotein (1948 Holmberg és Laurell) plazmafehérje, amely ferroxidáz aktivitása révén a vasmetabolizmust szabályozó faktor. A ceruloplazmin döntoen a májban termelodik, a magzatban és megszületéskor plazmaszintje és aktivitása jóval kisebb, mint a felnottkori értékek. A gesztáció elorehaladásával a szintje arányosan no. 27 A ceruloplazmin aktivitását elsosorban a máj érettsége határozza meg 28, s a megszületéskori szintet a méhen belüli stressz állapot vagy a megszületés elott alkalmazott kortikoszteroid adása jelentosen megemeli. 29 A posztnatálisan alkalmazott szintetikus glukokortikoid hormon és / vagy pajzsmirigy-hormon adás egyaránt emeli a ceruloplazmin plazmaszintjét és aktivitását. A megszületést követoen a plazmaszint 3-6 hónapos korig folyamatosan emelkedik, ekkor eléri, majd a késobbiekben meghaladja a felnottkori értékeket. 30 3.3.1.2. A ceruloplazmin antioxidáns hatása A ceruloplazmin ferroxidáz aktivitása révén antioxidáns tulajdonságú. A ferro- ion ferri- vassá történo redukciójával a vas transzferrinbe való beépülését teszi lehetové. Az Fe 3+ / Fe 2+ arány emelése transzferrin jelenléte nélkül is antioxidáns hatású, mert a Fe 3+ kevésbé effektív a lipidperoxidáció elosegítésében. A ceruloplazminnak jelentos szerepe van a vas raktározott formájának a transzportformába való átalakulásában, azaz a ferritin transzferrin vas donációjában. A ceruloplazmin perinatális adaptációjában játszott szerepe azonban kétséges: az elso élethét során sem a ceruloplazmin, sem a transzferrin szint nem változik oly mértékben, hogy azt a megszületést követo lipidperoxidáció gátlás megemelkedéséért felelossé lehetne tenni. 31 3.3.2. Transzferrin A májban termelodo béta-1 globulin típusú fehérje, mely a keringo vas szállításáért felelos (2 mol Fe3+ / 1 mol transzferrin). A vas felhasználási helyén a transzferrin receptormediált endocitózissal kerül a sejtekbe. A lizoszóma savas ph-jának hatására a vas disszociál a transzferrinrol, és a receptor-transzferrin komplex újra a sejtfelszínre jut. Itt a transzferrin és a receptora szétválnak, és a transzferrin újra a keringésbe kerül, ahol újabb vasatom megkötésére és szállítására alkalmas állapotban van. Normális körülmények között a transzferrin vasköto helyeinek mintegy harmada szaturált. A vashiányos állapot a transzferrin- 17
szintet növeli. A fokozott vaskínálat, infekció, protein malnutríció, májbetegség a transzferrin- szintet csökkenti. Hasonlóan a ceruloplazminhoz, a transzferrin szintek megszületéskor alacsonyabbak, mint felnottkorban. A gesztáció elorehaladtával a szérum szint emelkedik. A transzferrin szintek az egészséges újszülöttben az élet elso 3 hónapjában lényegesen nem változnak. Koraszülötteknél a 40. posztkoncepcionális hét eléréséig fokozatosan növekednek, de a szérum szint erosen tápláltság függo. Perinatális változására vonatkozóan irodalmi adatok nem álltak rendelkezésre. 3.3.3. Ferritin A sejtekben a ferritinhez kötve raktározódik a vas. A vastárolás elsodleges helyei a máj és a lép. A ferritin 24 alegységbol épül fel, és micelláris elrendezodésben 3000-4500 vasatomot képes tárolni. A plazmában mért ferritin-szintet általában a raktározott vasmennyiség indikátorának tartják és vashiányos állapot ill. a kóros vasraktározás diagnózisában használják fel. A ferritin koncentráció emelkedik gyulladásos állapotokban. Az újszülöttek szérum ferritin szintje magas a felnott értékekhez képest, tükrözve az elso élethónapok hyporegeneratív vérképzését. Az ismételt transzfúzióra szoruló beteg koraszülöttek ferritin-szintjei extrém magas értékeket mutathatnak 3.3.3.1. A ferritin szerepe a szabadgyök reakciókban Szuperoxid jelenlétében a ferritinbol vas szabadul fel, így a ferritin potenciális vasforrást képez a Fenton-reakció számára patológiás állapotokban. Például súlyos traumát követoen a ferritin-szint megemelkedése arányos a respiratorikus disztressz (ARDS) kialakulásának kockázatával. 32 Ugyanakkor a ferritin két különbözo láncának biokémiai tulajdonságai eltéroek: az L lánc, amely a plazmában eloforduló fo forma, igen sok vas felvételére képes, és nincs ferroxidáz aktivitása, míg a H lánc ferroxidáz aktivitást mutat, így antioxidáns hatása valószínusítheto. Korábban az újszülöttekre vonatkozó szabadgyök kutatások során nem vették figyelembe a ferritin esetleges protektív hatását a vas indukálta oxidatív károsodásban. Jóllehet a plazmában döntoen L- ferritin található, szövetkárosodást követoen a sejtekbol H-ferritin szabadulhat fel, hozzájárulva a plazma preventív antioxidáns kapacitásához. 33 3.4. Vasmetabolizmus és vérképzés újszülöttekben és koraszülöttekben 18
3.4.1. A szérumvas szint változásai a perinatális idoszakban A szérumvas szintjét elsosorban a felhasználás (eritropoezis és sejtproliferáció) valamint a felszívódott vas (placentáris, enterális) mennyisége közötti egyensúly határozza meg. A méhen belüli idoszakban a placenta anyai felszínén nagy suruségben elhelyezkedo transzferrin-receptoroknak köszönhetoen bo a magzat vasellátottsága. A vérképzés igen aktív, ennek ellenére a magzati szérumvas-értékek jellemzoen magasak. A magzati életet, pontosabban az utolsó trimesztert jellemzi a megszületés pillanatában észlelheto polyglobulia, magas szérumvas, normális szérum ferritin, s alacsonyabb teljes vasköto kapacitás (transzferrin-szint). Újszülöttkorban csökkent aktivitású a vérképzés. Ebbol fakadóan a külso vasigény és az enterális felszívódás az elso élethónap során kismértéku. A szérumvas szintek a felnottkori normál tartományon belüliek. 3.4.2. A vérképzés változásai a méhen belüli idoszakban A méhen belüli élet során a vérképzés mindvégig hiperregeneratív jellegu, döntoen a relatív hypoxiás környezet, a folyamatos testtömeg gyarapodás és kisebb részben a magzati vörösvérsejtek rövidebb élettartama miatt. 34 Az eritropoezis mértékét jól tükrözi a keringésben található retikulociták aránya, amely a terhesség idejével fordítottan változik: a 20. gesztációs hét körül 10-20 % közötti, de még a terminusra született újszülöttekben is 3-7 %. 35 A harmadik trimesztertol kezdodoen a magzat illetve az újszülött a felnotthöz képest polyglobuliássá válik. 3.4.3. A vérképzés és a vasháztartás akut változásai a megszületést követoen A megszületés a szöveti oxigénellátottság hirtelen megemelkedését eredményezi. 36 Emiatt, az ekkor még döntoen a májban termelodo eritropoetin szintézise órák alatt bazális szintre csökken. 37 Érett újszülött esetében kb. 3 hónapos korig változatlanul alacsony szinten is marad. 38 Az eritropoetin termelodésének megszunése nyomán a méhen belüli életre jellemzo magas retikulocita szám azonban csak a 4. életnap után csökken Ennek oka, hogy a retikulociták kiérése nagy valószínuséggel érési gátlást szenved, az anya feloli vasellátás 19
hirtelen megszunése miatt. 39 Mindezek együttesen az elso életnapok idejére korlátozódóan vasdepléciót okoznak, amely egyébként nem jellemzo az újszülöttkor egészére. Vahlquist már 1941-ben leírta, hogy a megszületés pillanatában (a köldökzsinórban) detektálható szérumvas szint magasabb a felnottkori értékekhez képest, amely azonban hirtelen és szélsoségesen mély szintre csökken közvetlenül a megszületés után. A szérumvas változásának mélypontja a 6. életóra elotti idoszakban kialakul, 40 majd a továbbiakban a második élethétig folyamatosan emelkedik. 41 Vahlquist mérései alapján arra az azóta is helytálló következtetésre jutott, hogy a méhen belüli életben olyan magas a szérumvas szintje, amilyen fiziológiás körülmények között nem fordul elo többet az élet folyamán. Ugyanakkor pár órával a megszületés után az újszülött szérumában olyan alacsony a vas mennyisége, amely szintén nem tapasztalható a késobbi élet során. 37 Langley 1950-ben kórszövettani módszerekkel, a májban található eritropoetikus gócok surusége alapján mutatta ki, hogy az újszülöttben a megszületést követo elso 12 órában a hemopoezis fokozódik, de a 3. életnapra gyakorlatilag meg is szunik. Ezzel párhuzamosan a 2. és 3. életnapon a hemosziderin mennyisége mind a lépben, mind a májszövetben csökken, szemben a méhen belüli életet és a késobbi újszülöttkort egyaránt jellemzo fokozott szöveti vasraktározással. 42 3.4.4. Anémia a perinatális idoszakot követoen Az egészséges újszülött hosszú idore elegendo vasraktárakkal jön a világra. Jóllehet az elso élethónapokban a testtömeg-gyarapodás nagyarányú, a csecsemok mégsem szorulnak számottevo külso vasbevitelre. Ebben az idoszakban az endogén, elsosorban a lebomló hemoglobinból származó vasraktárak boségesen fedezik a szerény ütemu vérképzés szükségleteit. Az elso élethónapokat hiporegenerativ vérképzés, folyamatosan csökkeno hemoglobin és hematokrit érték, normális szérum vas, alacsonyabb transzferrin és viszonylag magas ferritin-szintek jellemzik. Idovel ez az egyensúly vezet az újszülöttek fiziológiás hiporegeneratív anémiájához a 3. élethónap táján. A koraszülötteknél ugyanezzel a mechanizmussal, de korábban, és súlyosabb formában, gyakran jelentos klinikai tüneteket okozva alakul ki anémia. Az anémiát számos egyéb faktor: a vérvételek, krónikus gyulladásos állapot súlyosbítják és gyakran transzfúziós kezelést tesznek szükségessé. Kóros állapotokban, elsosorban gyakori infekciók és a gyakran alkalmazott transzfúziós kezelés hatására a ferritin szint további jelentos emelkedése következik be, ami vélhetoleg már kóros mértéku szöveti vasraktározást jelent. Ezt az 20
állapotot nevezik a koraszülöttek anémiájának, 43 ami döntoen a 32. gesztációs hétnél éretlenebb koraszülötteket érinti. Az anémia normociter, normokróm, általában 100 g/l alatti hemoglobin értékeket eredményez, alacsony retikulocita számmal jár. Az anémia nem szükségszeruen, de gyakran tüneteket okoz. Ezek a tachycardia, apnoés epizódok gyakoribbá válása, csökkent súlygyarapodás, fokozott oxigénigény. A laktát koncentráció megemelkedik. A koraszülöttek anémiája spontán megszunik 3-6 hónapos kor között. Az anémia mechanizmusa nem teljesen ismert. Az eritroid progenitorok EPO érzékenysége normális, és más eritroid növekedési faktorok, mint az IL-3, GM-CSF koncentrációja is megfelelo. Ugyanakkor az anémia következtében kialakuló vénás oxigén-tenzió csökkenés és a következményes klinikai tünetek ellenére az EPO koncentráció mégis alacsony marad. 3.4.4.1. Rekombináns humán eritropoetin alkalmazása kissúlyú koraszülöttekben A rekombináns technikával eloállított humán eritropoetint (rhuepo) a 90-es évek közepétol kezdve alkalmazzák a kis születési súlyú koraszülöttek hiporegeneratív és iatrogén anémiájának kezelésére. Az alkalmazott hatékony dózis 500 1400 E / kg / hét, heti 2-3 részletre elosztva. Azon koraszülöttek rhuepo kezelése jön szóba, akiknél a transzfúzió iránti igény már a megszületéskor biztosan prognosztizálható. Ezért elsosorban a 30. terhességi hétnél éretlenebb illetve az 1250 g-nál kisebb születési súlyú koraszülöttek esetében jön szóba a kezelés, amit már az elso élethéten érdemes elkezdeni. A rhuepo kezelésnek koraszülöttek körében eddig nincs ismert kontraindikációja. A kezelés hatására pár napon belül retikulocita krízis alakul ki, a fiziológiás Htk, Hgb szintcsökkenés lassul, vagy megáll, esetleg (hosszabb távon) emelkedni kezd. Az anémia akut korrekcióját rhuepo-val nem lehet elérni. A terápia hatékonysága kevésbé a vérképi értékekkel, mintsem a várt transzfúzió igény - standard transzfúziós indikációk melletti - redukciójával mérheto. A kezelés költséghatékonysága attól függ, hogy az egyes országokban a vérkészítmények mennyibe kerülnek, így a költséghatékonysági vizsgálatok eredményei és szakmai értékelések nagyon különböznek. A rhuepo hatása függ a tápláltsági állapottól és a testtömeg gyarapodás mértékétol, a megfelelo vaspótlástól, az interkurrens infekciók számától, súlyosságától. A koraszülötteken alkalmazott rhuepo kezeléssel kapcsolatosan nem jellemzoek a felnotteknél relatíve gyakori mellékhatások, mint a hipertónia, vagy ritkábban görcsrohamok. A rhuepo terápiával összefüggésbe hozható jelentos mellékhatást több száz koraszülött 21
kezelése után sem azonosítottak eddig, leszámítva, hogy a kezeltek súlygyarapodása valamelyest elmarad a kontroll betegekhez képest. A rhuepo terápia kapcsán egyes szerzok klinikai jelentoséggel nem bíró neutropénia elofordulásáról számoltak be. A vérvételek számának redukciója és a laboratóriumi mikrometodikák alkalmazása mellett a rhuepo kezelés, a jelenlegi ismeretek szerint hatékony és biztonságos eszköz a koraszülöttek anémiájának, transzfúzió igényének, így a transzfúzióval asszociált betegségek rizikójának csökkentésére. 44 Az eddig megjelent rhuepo kezeléssel kapcsolatos klinikai tanulmányok többsége a koraszülöttek transzfúzió igény csökkenésérol számolt be, jóllehet a vizsgálatok elrendezése, betegpopulációja, és elsodleges célkituzése jelentos különbségeket mutatott. A rhuepo kezelés hatékonyságát az anémia és a transzfúzió igény csökkentésében számos tényezo befolyásolja. Minél korábban kezdodik a terápia annál nagyobb mértéku transzfúzió igény csökkenés várható. Nem kielégíto fehérje tápláltság, vashiány, fertozések és hypotireózis egyaránt a rhuepo kezelés hatásosságának csökkenéséhez vezetnek. 3.4.4.2. Rekombináns humán eritropoetin hatása koraszülöttek vasháztartására, vaspótlás rhuepo kezelés alatt. Az összes publikált vizsgálatban a rhuepo kezelés mellett, számolva a fokozott vasfelhasználással, többlet vaspótlásról is gondoskodtak. Ennek jogosultságát igazolja, hogy azon klinikai tanulmányokban ahol ezt nyomon követték, a rhuepo indukálta fokozott vérképzés a vas szupplementációval együtt is a szérum vas, és ferritin szint csökkenését eredményezte. 45 RhuEPO kezelés során a szükséges vaspótlást individuálisan kell meghatározni, esetenként annak mértéke akár igen magas is lehet (4-16 mg/kg/nap). A kielégíto vas-ellátottság laboratóriumi diagnosztikája ill. értékelése a rhuepo kezelt koraszülöttek körében még nem teljesen tisztázott. Jóllehet a koraszülöttek körében nem elterjedt, néhány klinikai kísérletben intravénás vasbevitelt alkalmaztak az eritropoetikus hatás maximalizálásának reményében. Pollak és mtsai vizsgálatában az intravénásan adagolt vas nem eredményezett kedvezobb klinikai hatást, ugyanakkor a ferritin szintek növekedtek és a transzferrin szint csökkent, ami fokozott szöveti vasraktározást jelez. Azon felül a vas intravénás beadását követoen a teljes vasköto kapacitást meghaladó szérum vas szintet észleltek néhány esetben, ami a lipidperoxidáció fokozódását jelzo emelkedett malondialdehid (MDA) szérumszintekkel járt. 46 Mindez járulékos, klinikai bizonyítéka annak, hogy a fehérjéhez nem kötött szabadvas, függetlenül a kialakulásáért felelos mechanizmusoktól, in vivo fokozza a lipidperoxidációt. 22
3.4.4.3. Az EPO és eritroid hatásai Az EPO 30400 dalton tömegu glikoprotein, amely hypoxia hatására a vese peritubuláris sejtjeiben, illetve, foleg a magzati életben, nagyobb mennyiségben a májban is termelodik. A keringésbe került EPO hatására a csontveloben a vörösvérsejt prekurzorok kiérése és proliferációja következik be. Az eritroid sejtek (BFU-E, CFU-E) maturációja a felszínükön levo EPO receptorhoz történo EPO kötodés indukálta intracelluláris Ras /mitogén aktivációs kináz út beindításával jön létre. A sejtek maturációja döntoen az EPO indukálta antiapoptotikus protein család muködésének hatására alakul ki. Az EPO szinergista hatást fejt ki más olyan növekedési faktorokkal, mint a GM-CSF, IL-3, IGF-1. Mindez a keringo vörösvérsejtek számának növekedését eredményezi. A vörösvérsejtképzés fokozott vasfelhasználással jár, amely a szérum vasszint, majd a szöveti vasraktárak csökkenését idézi elo, amennyiben a külso vasbevitel nem fedezi a stimulált vörösvérsejtképzés igényeit. 3.4.4.4. Az EPO nem-eritroid hatásai Az EPO számos nem eritroid hatással is rendelkezik, Az EPO nagy adagban potens vazokonstriktor, fokozza az endotelin szintézist, a keringo vértömegre gyakorolt hatásától függetlenül emeli a szisztémás vérnyomást, stimulálja az angiogenezist és a simaizom proliferációt. Több olyan szerv van, amely a vérképzésben nem vesz részt, ugyanakkor egyaránt képes valamelyes EPO termelésre és rendelkezik EPO- receptorokkal is. Mindez az EPO további autokrin, parakrin funkcióinak lehetoségét veti fel. A központi idegrendszerben EPO- és EPO-receptor produkció egyaránt kimutatható. 47 Számos területen azonosítottak EPO-receptorokat, így a hippocampusban, az amygdalában és a temporális kéreg területén. Hasonlóan a veséhez, a központi idegrendszerben is hypoxia hatására következik be az EPO termelodése, amelynek lokális neuroprotektív hatása van. 48 A központi idegrendszerben termelodo EPO biológiai jelentoségét bizonyítja, hogy exogén rhuepo nagy dózisú adásával is hasonló neuroprotekció érheto el. Az EPO nak szerepet tulajdonítanak továbbá azokban a protektív mechanizmusokban, amelyek a hypoxiás prekondicionálás során jönnek létre. 49 23
Az EPO sejtprotektiv hatását a szöveti inzultust követoen az alábbi fobb mechanizmusokkal fejti ki. (1) Az EPO antiapoptotikus szignál mehanizmust triggerel a janus kináz -2 és a STAT5 aktiválásával, amelyek ún. survival fehérjék, mint a Bc1-xL termelodését eredményezik. (2) In vitro vizsgálatok szerint kalcium -dependens mechanizmus révén közvetlen és azonnali gátló hatást gyakorol a toxikus glutamát-kiáramlásra. (3) Az EPO mitogén-aktiválta proteinkináz indukciója révén fokozza az érújdonképzodést és ezzel is hozzájárul a sérült szövet regenerációjához. (4) Az EPO fokozza egyes antioxidáns enzimek (kataláz, glutation-peroxidáz, szuperoxid dizmutáz) expresszióját. 52 Az EPO növekedési faktor szerepét igazolják azok az állatkísérletek, amelyekben az EPO-gén knock-out embrióknál szív és agyi fejlodés zavart észleltek. 53 Az EPO receptorok nagy számban találhatóak az agyi kapillárisok endotheljében és a gliasejteken, ezzel szemben csak egyes neuronokban mutathatók ki EPO-receptorok. 54 Az uterusban a glanduláris epitheliális sejtekben található EPO és EPO-receptor termelodés, amelynek révén azek a sejtek szabályozó szerepet játszanak a myometrium angiogenezisében. 55 Mindezen hatások felvetik, hogy az EPO potenciális terápiás szereppel bír olyan kórállapotokban, mint egyes szervek hipoperfúziós károsodása, vagy ahol az angiogenezis zavart szenved, mint pl. a ROP és BPD betegség. 24
4. Célkituzések Az újszülött perinatális adaptációjának lényeges részjelensége a méhen belüli alacsonyabb oxigenizációs környezet és metabolikus státusz gyors ütemu megváltozása. Az oxigén-kínálat (parciális artériás oxigénnyomás) a megszületést követoen pillanatok alatt, a metabolikus ráta az elso életnapok során fokozatosan no, csaknem megduplázódik. 56 Vizsgálat-sorozatommal az újszülött-kori vasháztartás és az extracelluláris antioxidáns védekezoképesség összefüggéseit vizsgáltam két kérdéskör kapcsán, és az alábbi kérdések megválaszolását tuztem ki célul. 1. Újszülöttek perinatális vasanyagcsere-változásainak összefüggése az antioxidáns védekezoképességgel.? Érett újszülöttek korai posztnatális adaptációja során a vasháztartásban milyen változások figyelhetok meg az elso 3 életnap alatt?? Ezek összefüggenek-e az EC antioxidáns kapacitás változásaival?? Érett újszülöttek posztnatális adaptációja során a vasháztartást meghatározó antioxidáns hatású fehérjék milyen hatással vannak az EC térben kimutatható szabadvas megjelenésére, illetve eliminációjára? 2. Rekombináns humán eritropoetin (rhuepo) hatása koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, a vasanyagcserére és az antioxidáns védekezoképességére? Az rhuepo kezelés milyen hatást gyakorol a koraszülöttek vérképzésére, transzfúzió igényére, vasháztartására és szövodmény-betegségeire?? Az rhuepo által stimulált vérképzés és a következményes EC vasdepléció befolyásolja-e rövidtávon az EC antioxidáns kapacitást koraszülöttekben? 25
5. Betegek és módszer 5.1.1. A szérum vas és EC antioxidáns kapacitás akut perinatális változásainak vizsgálata. A szabad vas és a vasháztartásban szerepet játszó antioxidáns faktorok összefüggése érett egészséges újszülöttekben a perinatális idoszakban A kérdés teljes köru megválaszolásához szükséges vérmennyiség, etikai okok miatt, nem állt rendelkezésre, így vizsgálatunkat két szakaszban végeztük. A vizsgálat elso szakasza: 14 olyan egészséges, érett újszülött, átlagosan a 47. életórában levett vénás vérmintáját analizáltuk, akiknél valamilyen klinikai jel vagy a szülési anamnézis alapján gyanított kórállapot miatt laboratóriumi vérvizsgálatra volt szükség (sárgaság 12 esetben, infekció 2 esetben), de betegség nem igazolódott. Köldökzsinórból vett vérminta minden esetben rendelkezésre állt. A mintavételek a Kistarcsai Flór Ferenc Kórház Patológiás Újszülött osztályán történtek. A mintavételt követoen a szérumot (4000 g 10 perc, 4 C ) centrifugálás után 80 C fokon tároltuk a laboratóriumi meghatározások elvégzésig. Kórállapot késobbi igazolódása ill. hemolítikus minta miatt 4 mintapárt zártunk ki a vizsgálatból. A fennmaradó 10 újszülött születési súlya (átlag ± szórás) 3546 ± 371 g gesztációs kora 39.6 ±0.9 hét volt. A vizsgálat második szakasza: 25 olyan egészséges, érett újszülött, átlagosan a 42. (± 22,7) életórában levett vénás vérmintáját vizsgáltuk, akiknél valamilyen klinikai gyanújel (sárgaság, infekció, hipoglikémia) és / vagy a szülési anamnézis alapján gyanított kórállapot miatt laboratóriumi vérvizsgálatra volt szükség, de a feltételezett betegség nem igazolódott. Köldökzsinórból vett vérminta minden esetben rendelkezésre állt. A mintavételek a Kistarcsai Flór Ferenc Kórház Patológiás Újszülött osztályán történtek. A mintavételt követoen a szérumot (4000 g 10 perc, 4 C ) centrifugálás után 80 C fokon tároltuk a laboratóriumi meghatározások elvégzésig. Kórállapot késobbi igazolódása ill. hemolítikus minta miatt 4 mintapárt zártunk ki a vizsgálatból. A fennmaradó 21 újszülött születési súlya 3303 ± 401 g, gesztációs kora 39,6 ± 1,0 hét volt. A mintavételek a Regionális Tudományos és Kutatásetikai Bizottság (TUKEB 192/1998.) és a Kórházi Etikai Bizottság engedélye, valamint minden egyes esetben elozetes írásos szüloi beleegyezo nyilatkozat birtokában történtek. 26
5.1.2. Koraszülöttek rekombináns humán eritropoetin kezelésének hatása a transzfúzió igényre és a vasháztartásra. A vasháztartás-változás összefüggése az antioxidáns kapacitással A rhuepo vérképzésre és transzfúzió igényre gyakorolt hatását 1994. február és 1995. márciusa között 46 koraszülött bevonásával prospektív, randomizált, kontrollált klinikai vizsgálat keretében végeztük a Semmelweis Egyetem I. sz. Nogyógyászati Klinika, az I. sz. Gyermekklinika, valamint a Budapesti Önkormányzat Péterfy Sándor Utcai Kórház, Pest Megyei Önkormányzat Szent Rókus Kórház, és Kistarcsai Flór Ferenc Kórház koraszülött intenzív osztályain. A vizsgálatot a Semmelweis Egyetem Regionális Kutatási Etikai Bizottsága engedélyezte. RhuEPO kezelést csak írásos szüloi beleegyezo nyilatkozat birtokában kezdtünk. Felvételi kritériumok voltak: 1250 g-nál kisebb születési súly, a 32. hétnél kisebb gesztációs kor, 7. életnapnál fiatalabb életkor. Kizártuk a vizsgálatból azon újszülötteket, akiknél III, IV stádiumú intrakraniális vérzés, izoimmunizáció, intrauterin vírus infekció, cianotikus szívhiba, vagy jelentos fejlodési rendellenesség állt fent. Az 1:1 arányú randomizációt, a tervezett betegszámnak (46) megfelelo elore megírt, lezárt borítékok sorshúzásával végeztük. Placebót nem alkamaztunk. A rhuepo-t (Eprex l000, Janssen-Cilag) hetente 3 alkalommal 200 E/ttkg adagban, szubkután injekció formájában alkalmaztuk. A kezelést a 3-7. életnapon indítottuk, és 6 héten keresztül folytattuk. Kiegészíto kezelésként enterálisan 6 mg/ttkg/nap elemi vas adagolását kezdtük el, amennyiben a megelozo 2 hétben nem történt transzfúzió, a szérum ferritin érték 100 µg/l alatt volt, és nem állt fenn infekció. Mindkét csoportban 15 mg/ttkg/2 nap i.m. E vitamin (Ephynal, Roche) szupplementációt folytattunk. A vizsgálatban résztvevo intézetekben a transzfúziós kezelést standardizált indikációs kritériumok szerint végezték. A transzfúzió indikációi a következok voltak: 1. életnapon 40 % Htk érték alatt, késobb 30% FiO2 igény, szimptómás PDA esetén 35 % alatti Htk érték, anémiával asszociált klinikai tünetek (tartós tachcardia, apnoés epizódok, táplálási intolerancia, súlygyarapodás hiánya) és 30 % alatti Htk érték. Naponta mértük a testhomérséklet, vérnyomás, pulzusszám, légzésszám értékeit, a testsúlygyarapodás, kalória, fehérjebevitel adatait rögzítettük. A rhuepo kezelés megkezdése elott, majd hetente vizsgáltuk a kvalitatív és kvantitatív vérkép (Hgb, Htk), a relatív retikulocita szám, a szérum vas, ferritin és transzferrin változásait. Folyamatosan rögzítettük a diagnosztikus célból levett és a terápiás céllal beadott vér illetve vörösvérsejt koncentrátum számát és mennyiségét, valamint az oxigén terápia idotartamát. 27