DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI MÓDOSÍTOTT GAUSS-FÜGGVÉNYEK ALKALMAZÁSA KROMATOGRÁFIÁS ELÚCIÓS GÖRBÉK LEÍRÁSÁRA Osváthné Pápai Zsuzsa VESZPRÉMI EGYETEM ANALITIKAI KÉMIA TANSZÉK VESZPRÉM 2002
Bevezetés, célkitűzések Az elmúlt években a matematikai módszerek analitikai kémiai alkalmazása a számítástechnika nagyléptékű fejlődése, valamint az analitikai kémiával való egyre szorosabb kapcsolata következtében jelentősen megnőtt. A kemometria kifejezést már harminc éve alkalmazzák az analitikai kémiában használt matematikai módszerek megjelölésére. A kemometria fő célja a megfelelő mérési eljárások kiválasztása, az optimális kísérleti körülmények meghatározása, valamint a mérési adatok információ tartalmának maximális kinyerése. A kromatográfia a kemometriás módszerekkel együtt a modern analitikai kémia egyik legdinamikusabban fejlődő ágát képezi. Az analitikai kémiában a digitális jelfeldolgozás célja a műszerek jelének digitális formában történő kiértékelése, valamint azoknak az információknak a kinyerése, amelyek közvetlenül összefüggésbe hozhatók az anyag minőségi vagy mennyiségi jellemzőivel. A digitális jelfeldolgozás tartalmazza az analóg jel digitálissá történő alakítását, a digitális zajszűrést, az alapvonalkorrekciót, a jelalak-elemzést (peak shape analysis), a görbeillesztést, a jelek tárolásának és visszakeresésének műveletét, a különböző jeltranszformációk végrehajtását és mindazon folyamatokat, amelyek elősegítik a fenti célok megvalósítását. A kromatogramok számítógépes kiértékelése manapság lehetővé teszi a kromatográfiás csúcs(ok) alakjának alaposabb elemzését, és nem csupán a retenciós idő és a görbe alatti terület kiszámítására korlátozódik. A csúcs alakjának vizsgálata nemcsak a minőségi és mennyiségi elemzést szolgálja, hanem segítségével a kromatográfiás rendszer működésére, a paraméterek megváltozására is következtethetünk. A csúcs alakját közönséges és centrális momentumokkal, a belőlük számítható csúcsossági és ferdeségi együtthatókkal, valamint a csúcs különböző magasságaiban vett csúcsszélességekkel és a szélességi adatokból számított, különböző aszimmetria faktorokkal jellemezhetjük. Dolgozatomban a kromatográfiás jel- és adatfeldolgozás területén belül új eljárások kidolgozását és létező programok bővítését tűztem ki célul: három új empirikus függvénnyel, illetve ezek kombinációival foglalkoztam, melyek külön-külön is különböző csúcsalakot képesek leírni. Az általam alkalmazott matematikai modellek különböző típusú kromatográfiás eljárások során kapott "valódi" csúcsok digitális pontjainak illesztésére alkalmasak, ezáltal a csúcsok gyors és pontos jellemzését teszik lehetővé. Kidolgoztam egy új aszimmetria meghatározási módszert is, mely esetben az aszimmetria együttható a kromatográfiás csúcsot teljes egészében jellemzi. 1
Vizsgálati módszerek A vizsgált matematikai függvények illesztése különböző típusú kromatográfiás elválasztások során nyert kromatogramok digitalizált pontjaira történt. A használt kísérleti módszerekhez tartozik a gázkromatográfia, a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia, az ion-kromatográfia és a kapilláris elektroforézis. A gázkromatográfiás készülék egy INTEL 8085 mikroprocesszorhoz kapcsolt Chromatron GCHF 18-3 típusú berendezés volt. Az így összeállított rendszerrel történt az adatgyűjtés és a digitalizált kromatogramok tárolása. Az adatokat egy nagykapacitású IBM kompatibilis számítógépbe továbbítottam. A folyadék-kromatográfiás kísérleteket egy UV detektorral összekapcsolt Merck - Hitachi típusú folyadék-kromatográf segítségével végeztük el. A detektor jele egy A/D átalakítón keresztül került egy IBM-kompatibilis számítógépbe, ahol a jelek kiértékelése Nelson-programcsomag segítségével történt. Az ion-kromatográfiás kísérletek egy Dionex 10 ion-kromatográf (Dionex Co., Sunnyvale, CA, USA) típusú készülékkel történtek, mely egy vezetőképességi detektorhoz volt kapcsolva. A kapilláris elektroforézis készülék egy UV detektorral összekapcsolt Quanta 4000 kapilláris elektroforézis rendszer volt. A nemlineáris illesztéseket a Gnuplot (Ms-windows 32 bit version 3.7) programmal végeztem, a területszámításokhoz és az illesztett görbék adatainak szimulálásához pedig az általam kidolgozott Pascal programokat használtam. 2
Az új tudományos eredmények összefoglalása Értekezésemben kromatográfiás jelek kemometriai módszerekkel történő feldolgozásával foglalkoztam a kromatográfiás adatsorokból nyerhető információk (retenciós idő, csúcsszélesség, csúcsmagasság, aszimmetria, ferdeség, lapultság, statisztikai momentumok, stb.) pontosabb meghatározása céljából. Ezen jellemzőket empirikus modellek felállításával kaptam meg, mely modellek paraméterként tartalmazzák a kromatográfiás csúcsjellemzőket. A kromatográfiás oszlopban bonyolult fizikaikémiai folyamatok játszódnak le, melyekhez még hozzáadódnak a kolonnán kívüli hatások is. Mindezen tényezők a kromatográfiás csúcs alakjának változásához vezetnek. Mivel ezek a hatások összetettek, a kromatográfiás görbékre nem lehet egy egységes függvényt illeszteni. A csúcs alakjához legjobban illő modellt ki kell választani annak érdekében, hogy a kromatográfiás görbét a legpontosabban jellemezhessük. Több különböző alakú matematikai függvényt állítottam fel, melyek különböző típusú csúcsalakokra illeszthetők: 1. A logaritmikusan módosított Gauss-függvény négy, egymástól független paramétert (M, H, a, D) tartalmaz. 1.1. A különböző aszimmetria együtthatójú (0 < a < 2) görbék szimulálásával bemutattam azokat a csúcsalakokat, melyek esetében a függvény digitális pontok illesztésére jól alkalmazható. 1.2. Megállapítottam, hogy a logaritmikusan módosított Gauss-függvény szimmetrikus, illetve meredeken emelkedő és lassan leszálló u.n. "tailing"-es csúcsok illesztésére alkalmas. 1.3. A görbeillesztéseket valódi kromatográfiás csúcsok (gázkromatográfia, HPLC) alkalmazásával mutattam be és meghatároztam a csúcsok optimális paramétereit. 1.4. Az illesztések jóságát a maradék négyzetösszeg, valamint a számított és mért pontok közötti különbség határozta meg. Az illesztett függvény számított értékeit az általam megírt Pascal programmal szimuláltam. 1.5. Megállapítottam, hogy a logaritmikusan módosított Gauss-függvény alkalmas átlapoló csúcsok felbontására, zajszűrésre és alapvonal korrekcióra. 3
4 1.6. A modell egyik fő előnye, hogy zárt formában integrálható, mely a csúcs alatti terület meghatározására pontosabb és gyorsabb eredményt szolgáltat, mint a közelítő numerikus integrálási módszerek. Új Pascal-programokat fejlesztettem ki kromatográfiás csúcsok területének meghatározása céljából (közelítő trapéz módszer, zárt formájú integrálás). A programok alkalmazhatóságát fenolszármazékok nagyhatékonyságú folyadék-kromatográfiás elválasztása során igazoltam. 1.7. Megállapítottam, hogy a két területmeghatározási módszer eredményei közötti különbség kisebb, mint 0,01%. 1.8. A logaritmikusan módosított Gauss-függvény további előnye, hogy paraméterei és a kromatográfiás jellemzők (első, második, harmadik, negyedik statisztikus momentum) között közvetlen összefüggések állnak fenn, egyszerű formában. 2. A módosított Hermite-polinomos függvény, mely egy módosított Gaussfüggvény és a módosított Hermite-polinom szorzatának eredménye, öt paramétert (M, H, A p, D p, C) tartalmaz. A paraméterek számának növekedése lehetővé teszi, hogy a logaritmikusan módosított Gauss-függvényhez képest többféle csúcsalak is leírható legyen. 2.1. Módosításokat vezettem be a Grushka által javasolt alapfüggvénybe: Csak az első és másodrendű polinomot vettem figyelembe, minek következtében megszűnt az eredeti függvény hullámzása a csúcs előtt és után. A Hermite polinom első tagjának köbös hatványát kicseréltem négyzetes taggá, ezáltal kiiktattam a csúcs leszálló ágának oszcillálását az alapvonal közelében. A csúcsosság értékét leszűkítettem (C < 1 ) annak érdekében, hogy a csúcsmaximum közelében ne lépjen fel hullámzás (ezt a hullámzást az előbbi módosításokkal nem sikerült kiiktatni a függvényből). 2.2. Szimuláltam a különböző csúcsosságú (C) és aszimmetria együtthatójú (A p ) görbéket. 2.3. Megállapítottam, hogy a függvény alkalmas mind meredeken felszálló és lassan leszálló ("tailing"-es), mind pedig lassan felszálló és meredeken leszálló ("fronting"-os) csúcsok leírására. 2.4. A módosított Hermite-polinomos függvényt valódi (gáz-, ion-) kromatográfiás csúcsok digitális pontjainak illesztésére alkalmaztam és meghatároztam a csúcsok optimális paramétereit.
2.5. Az illesztések jóságát a maradék négyzetösszeg, valamint a számított és mért pontok közötti különbség határozta meg. Az illesztett függvény számított értékeit az általam megírt Pascal programmal szimuláltam. 2.6. A függvény előnye, hogy paraméterei közvetlenül jellemzik a csúcsot, és egyszerű összefüggések állnak fenn az illesztett paraméterek és a kromatográfiás jellemzők (statisztikai momentumok) között. 2.7. A függvényt átlapoló csúcsok felbontására és alapvonal korrekcióra alkalmaztam. 2.8. Megállapítottam, hogy (bár az aszimmetria együttható változásával a csúcsmaximum eltolódik) valódi csúcs illesztése során ez nem befolyásolja a retenciós időt és az egyéb tényezőket. 3. Az egyszerűen módosított Gauss-modell négy paraméteres (M, H, A mg, D mg ) függvény. 3.1. Módosítottam a Gauss-modell alakját azáltal, hogy a kitevő nevezőjébe bevezettem az idővel megszorzott aszimmetria tényezőt. 3.2. Megszerkesztettem a különböző aszimmetriájú görbéket. 3.3. Megállapítottam, hogy a függvény szimmetrikus és gyengén aszimmetrikus ("tailing"-es) csúcsok leírására alkalmas. 3.4. Az egyszerűen módosított Gauss-függvényt ion-kromatográfiás (egyedi és átlapoló) csúcsok digitális pontjaira való illesztésre, valamint az alapvonal javítására alkalmaztam. 3.5. Közvetlen összefüggéseket állapítottam meg a függvény paraméterei és a statisztikai momentumok között. 3.6. Az egyszerűen módosított Gauss-függvény előnye, hogy olyan függvénykombinációkban alkalmazható, melyek extrém alakú csúcsokat is leírnak. 4. Erősen aszimmetrikus csúcsok leírása. 4.1. Felállítottam egy olyan függvény-kombinációt (I.), mely egy egyszerűen módosított Gauss-modellből (felszálló ág) és egy logaritmikusan módosított Gauss-függvényből (leszálló ág) áll. A két függvény egymásba való átváltása a csúcsmaximumnál történik. 4.2. A szimulált görbékből megállapítottam, hogy a függvénykombináció (I.) alkalmas erősen elhúzódó (erősen "tailing"-es) csúcsok leírására is. 5
4.3. A függvénykombinációt (I.) valódi, igen aszimmetrikus csúcsok (gázkromatogram, elektroferogram) digitális pontjainak illesztésére alkalmaztam és meghatároztam az illesztés paramétereit. 4.4. Egy olyan függvénykombinációt (II.) állítottam fel, mely egy módosított Hermite-polinomos függvényből (felszálló ág), valamint egy egyszerűen módosított Gauss-modellből (leszálló ág) áll. 4.5. A függvénykombináció (II.) görbéinek szimulálásával megállapítottam, hogy a függvény leírja a lassan emelkedő (erősen "fronting"-os) aszimmetrikus csúcsok alakját is. 4.6. A függvénykombináció (II.) segítségével az általam vizsgált gázkromatogramok között előforduló azonos alakú csúcs pontjaira illesztést végeztem és meghatároztam az illesztés paramétereit. 4.7. Az illesztéseket a maradék négyzetösszeg alapján mindkét függvénykombináció (I., II.) esetén összehasonlítottam az összetevő egyedi függvények illesztésével. Megállapítottam, hogy a függvénykombinációk akár nagyságrendileg is a legpontosabb illesztést eredményezik. 5. A módosított egyedi függvények (logaritmikusan módosított Gauss-függvény, módosított Hermite-polinomos függvény, egyszerűen módosított Gaussfüggvény) és kombinációik között összehasonlítást végeztem. Az illesztések során valódi kromatográfiás görbéket alkalmaztam, melyek a gázkromatográfia, a folyadék-kromatográfia és a kapilláris elektroforézis területéről származnak. Az általam vizsgált különböző elúciós görbék esetén megállapítottam, hogy mely módosított Gauss-függvény illeszkedett legpontosabban a mért digitális pontokra (mely függvény paraméterei a kromatográfiás csúcsot a legpontosabban jellemzik). 6. Egy új aszimmetria vizsgálati módszert dolgoztam ki, melynek alkalmazása során a logaritmikusan módosított Gauss-függvény aszimmetria tényezőjét (a) tanulmányoztam. Az a együttható megadja a szimmetrikus csúcstól való eltérés nagyságát, de nem mutatja meg, hogy a csúcs melyik részén jelentkezik ez az eltérés és mekkora a különbségarány a csúcs különböző pontjain. Ezért abból az elgondolásból kiindulva, hogy az aszimmetria tényező a kromatográfiás csúcs eltérését jellemzi az ideális szimmetrikus csúcstól, különböző a együtthatójú csúcsokat szimuláltam, majd erre az azonos csúcsmaximum helyzetű és magasságú, azonos függvénnyel szimulált szimmetrikus görbét illesztettem. A két görbe különbségéből aszimmetriára vonatkozó következtetéseket vontam le: 6
6.1. A kidolgozott módszer megadja a különbségterületek abszolút értékének arányát ( L / R ) a csúcsmaximumtól balra ( L ) illetve jobbra ( R ). 6.2. A csúcsmaximumtól jobbra meghatározható az aszimmetria az x = 0 tengely feletti (R + ) és alatti (R - ) területek képezésével, illetve arányuk (R + /R - ) segítségével. 6.3. A logaritmikusan módosított Gauss-függvény esetén az L terület értéke felhasználható valódi aszimmetria tényezőként, mivel jó korrelációs összefüggésben van az a értékkel. 6.4. A javasolt aszimmetria meghatározási módszert valódi kromatográfiás csúcsok vizsgálata során (fenolszármazékok HPLC-módszerrel történő elválasztása) alkalmaztam. 6.5. Megállapítottam, hogy az eluens áramlási sebességének növekedésével a normált területek számértékei ( L ; R ) lineárisan csökkenek, ami megfelel a tapasztalatnak. 6.6. A kromatográfiás csúcsok esetén az aszimmetrikus és szimmetrikus görbék közötti területkülönbségek hűen jellemzik a csúcs aszimmetriáját és normálás után nem függnek a csúcs maximumának helyétől, magasságától és szélességétől. 7
Az értekezéssel kapcsolatos közlemények és előadások jegyzéke Közlemények: 1. T. L. PAP, ZS. PÁPAI: Application of a New Mathematical Function for Describing Chromatographic Peaks. Journal of Chromatography A, 930, 53-60 (2001). 2. PAP T., PÁPAI ZS.: Jelfeldolgozás a kromatográfiában I. Új matematikai függvény alkalmazása kromatográfiás csúcsok alakjának leírására. Magyar Kémiai Folyóirat, 108 évf., 1. sz. (2002). 3. ZS. PÁPAI, T. L. PAP: Determination of Chromatographic Peak Parameters by Non-linear Curve Fitting Using Statistical Moments. The Analyst, 127, 494-498 (2002). 4. ZS. PÁPAI, T. L. PAP: Analysis of Peak Asymmetry in Chromatography. Journal of Chromatography A, 953, 31-38 (2002). 5. PÁPAI ZS. ÉS PAP T.: Kromatográfiás csúcsparaméterek meghatározása nem lineáris görbeillesztéssel statisztikai momentumok felhasználásával. Magyar Kémiai Folyóirat (beküldve) 6. ZS. PÁPAI, T. L. PAP: Describing of tailing peaks in electrophoresis. Electrophoresis (előkészületben) 8
Tudományos előadások: 1. ZS. PÁPAI; T. L. PAP: Fitting Equations to Overlapping Chromatographic Peaks (p) Conferentia Chemometrica (CC'97) Budapest, Aug. 21-23, 1997. 2. PÁPAI ZS.: Matematikai függvények illesztése kromatográfiás csúcsokra az optimális elválasztási körülmények megválasztása céljából (e) Veszprémi Egyetem, Veszprém, 1998. jan. 28. 3. ZS. PÁPAI, T. L. PAP: Determination of Asymmetry Factor of Chromatographic Peaks Using Curve Fitting Method (p) International Symposium on Advances Chromatography, Electrophoresis and Related Separation Methods (ACE'98), Szeged, Jun. 18-20, 1998. 4. PAP, T. L.; ZS. PÁPAI: Experimental Design for the Separation of Phenol Derivatives Using HPLC (p) 216 th American Chemical Society National Meeting and Exposition Program, Boston, MA, USA, Aug., 23-27, 1998. 5. ZS. PÁPAI, T. L. PAP: Comparison of Different Functions for Curve Fitting of Chromatographic Peaks (p) 22 nd International Symposium on Chroamtography (ISC'98), Roma, Italy, Sept. 13-18, 1998. 6. PAP T., PÁPAI ZS.: Folyadékkromatográfiás elemzések optimálása kísérlettervezéssel, szimplex módszerrel és csúcsalakelemzéssel (e) Kemomertria'98, Miskolc-Lillafüred, 1998. október 7-9. 7. PÁPAI ZS., PAP T.: Új módszer kromatográfiás csúcsok aszimmetriájának meghatározására (p) Vegyészkonferencia, Kolozsvár, 1998 nov. 20-22. 8. ZS. PÁPAI; A. FELINGER; T. L. PAP: Determination of Asymmetry Factor of Chromatographic Peaks Using Curve Fitting Method (p) 23 rd International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques, HPLC'99, Granada, Spain, May 30 - June 4, 1999. 9
9. ZS. PÁPAI; T. L. PAP: Frequency-Domain of Cromatographic Peaks from Separation of Phenol Derivatives Using Curve Fitting (p) Balaton Symposium '01 on High-Performance Separation Methods, Siófok, Sept. 2-4, 2001. 10. PÁPAI ZS.: Matematikai módszerek kromatográfiás elválasztás optimálása során (e) Veszprémi Egyetem, Veszprém, 2001. szept. 5. 11. Pápai Zs.: Matematikai függvények alkalmazása kromatográfiás görbék elemzése során (e) Veszprémi Egyetem, Veszprém, MTA Automatikus Elemzés Munkabizottsági ülés, 2002. júl. 8. 12. ZS. PÁPAI, T. L. PAP: Curve Fitting to Chromatographic Peaks in Frequency Domain (p) 24 th International Symposium on Chromatography, Leipzig, Germany, Sept. 15-20., 2002. 10