Eötvös Loránd Tudományegyetem - Természettudományi Kar Környezettudományi Doktori Iskola Legionella kolonizáció diverzitása ivóvízhálózatban Barna Zsófia Témavezetı: Dr. Vargha Márta Országos Környezetegészségügyi Intézet Belsı konzulens: Dr. Márialigeti Károly ELTE Mikrobiológiai Tanszék
A Legionella baktérium Gyakran vízzel asszociált kórokozó nedves meleg környezetben fordul elı Vízi egysejtő eukarióta szervezetekben intracellulárisan is szaporodik Szaporodásának optimális hımérséklete: 25-45 C Gram-negatív, aerob, poláris vagy szubpoláris csillós pálca A Legionella genusnak > 50 ismert faja van Eddig 21 fajról derült ki, hogy képes humán megbetegedést okozni A jelentett fertızések 80-90 %-a a Legionella pneumophila-ra vezethetı vissza L. pneumophila-nak 16 szerotípusa ismert L. pneumophila 1 okozza a legtöbb megbetegedést
A legionellosis A Legionella által okozott humán megbetegedések összefoglaló neve Pontiac-láz (nem pneumóniás forma) Legionárius betegség (pneumónia)
Kockázatot jelentı közegek hőtıtornyok légkondícionáló berendezések épületek nedves hőtési technológiával üzemelı légkondicionáló berendezései (hőtıtornyok) rosszul kialakított felületi hőtık (pl. split-klíma) (nagy) épületek hideg- és melegvíz-rendszerei Kórházak Szállodákban/irodaházak Oktatási intézmények szökıkutak légnedvesítı berendezések pezsgıfürdık kerti locsolók talaj
Bejelentett legionellosis esetek száma Magyarországon (1998-2008) 120 Esetszám [fı] 100 80 60 40 Egyedi vizsgálati járványügyi lap bevezetése A nyilvántartásban csak pneumoniával járó megbetegedések nem halálos kimenetelő halálos kimenetelő 20 0 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 Morbiditás [fı/millió lakos] 1,3 1,2 2,0 2,7 Letalitás [%] 15,4 8,3 30,0 14,8 Forrás:Dr. Horváth Judit Krisztina Országos Epidemiológiai Központ, Járványügyi Osztály
CÉLKITŐZÉS: Legionella hazai elterjedésének vizsgálata
Legionella kolonizáció hazai hálózati vízrendszerekben objektumok 25 20 15 10 Összes vizsgált objektum: 102 Legionella-val kolonizált: 66 (65 %) objektumok száma [db] 5 0 Szállodák Egészségügyi Int. Oktatási int. Élelmiszereá. üzem Gyógyszergyár Üzem - egyéb Irodaház Magánház Áruház nem kolonizált kolonizált
Mintavételi pontok szállodák eü. intézmények oktatási intézmények élelmiszer eá. üzem irodaház üzem - egyéb gyógyszergyár
Legionella kolonizáció hazai hálózati vízrendszerekben minták 300 250 200 150 100 Összes vizsgált minta: 1065 Legionella kimutatható: 466 (44%) 1 000 CFU/L felett: 267 (25 %) vízminták száma [db] 50 0 Szállodák Egészségügyi Int. Oktatási int. Élelmiszereá. üzem Gyógyszergyár Üzem - egyéb Irodaház Magánház Áruház < 10 10-1000 > 1000
Hımérséklet hatása a Legionella- kolonizációra N=656 N=656 75,2 % 160 Kritikus hımérséklet-tartomány 100% <1000 Vízminták száma [db] 140 120 100 80 60 40 20 80% 60% 40% 20% >1000 0 0% < 10 10-14,9 15-19,9 20-24,9 25-29,9 30-34,9 35-39,9 40-44,9 45-49,9 50-54,9 55-59,9 > 60 Összesen 656 minta Hımérséklet [ C] Minták 75,2 %-a esik a 20-54,9 C-os tartományba Hımérséklet [ C] Szaporodási hımérséklet tart.: 20-50 C 20 C alatt perzisztál 60 C-on 3 perc alatt pusztul el 70 C felett azonnal elpusztul
CÉLKITŐZÉS: Intézkedések a Legionella csíraszám visszaszorítására
Védekezési lehetıségek a legionellák ellen Aktív módszerek: csökkentik a baktériumok számát Klóros fertıtlenítés (pl. klór-dioxid) Ózonos fertıtlenítés UV-sugaras fertıtlenítés UV-sugárzás + ultrahang "aacheni-módszer" Mikrobicidek alkalmazása Termikus fertıtlenítés Passzív módszerek: megakadályozzák a baktériumok szaporodását
Hıkezelés A gyár egész területén problémát jelent a Legionella jelenléte Kísérleti jelleggel hıfertıtlenítés az egyik 2004-ben épült épületben Vegyszeres kezeléstıl elzárkóznak Választott 100 000 kezelés: rendszeres hıfertıtlenítés Legionella [CFU/l] 10 000 1 000 100 10 1. pont 2. pont 3. pont 4. pont 2008.11.01. 2009.03.07. 2009.04.17. 1 2007.07.26 2008.04.07 2008.10.08 2008.11.03 2008.12.11 2009.03.12 2009.04.22
Egyszeri vegyszeres fertıtlenítés Egészségügyi intézmény használati melegvíz-hálózata a tényleges vízfogyasztáshoz képest jelentısen túlméretezett HMV tartály cseréje az elsı vízvizsgálati eredmények után Fertıtlenítés: A használati melegvízhez nagy koncentrációban klór-dioxid oldatot adagoltak 100 l 0,3%-os 100 000 klór-dioxid oldat (kb. 600 mg/l végkonc.) 24 órát maradt a rendszerben a fertıtlenítıszer (10 mg/l végkonc.) 49 Csapok kifolyatása 0 mg/l szabad-klór koncentrációig 10 000 46 46 46 46 44 43 40 40 41 40 50% hidrogén-peroxid és ezüst: kb. 5-10mg/l (2-58 mg/l) - jelenleg folyamatos Legionella csíraszám [CFU/l] 1 000 100 10 1 2007.11.06 2009.02.02 fertıtl. elıtt 2009.02.02 - fertıtl. után 40 2009.05.05 60 50 40 30 20 10 0 Hımérséklet [ C] HMV tartály 3. emelet 1. emelet
CÉLKITŐZÉS: Legionella-törzsgyőjtemény létrehozása és jellemzése Pozitív vízmintákból 3-3 izolátum Törzsgyőjtemény: 864 Legionella törzs
Faj alatti szintő azonosítás szerológiai vizsgálattal N=520 3,5% 17,7% 1,5% 1,3% Denka Seiken Ltd. 9,0% 0,6% 21,3% 2,1% 14,0% 1,3% 27,5% nem aggl. L. pn. 1 L. pn. 2 L. pn. 3 L. pn. 4 L. pn. 5 L. pn. 6 L. pn. 8 L. pn. 9 L. pn. 10 L. pn. 12 Kérdések: Miért kizárólag Legionella pneumophila? 21,3 %-ban L. pn. 2-14 szerocs. (=nem aggl.) további vizsgálatok L. pneumophila 3: 14,0 % L. pneumophila 6: 17,7 % L. pneumophila 1: 27,5 %
A L. pneumophila 2-14 szerocsoportú törzsek molekuláris vizsgálatai Genus specifikus PCR minden izolátum pozitív ARDRA Alu I Hinf I rpob PCR-RFLP is probléma a PCR optimalizálásával cél: a törzsek faj alatti szintő azonosítása Szekvencia-analízis csoportosítás REP-PCR-rel (11 csoport) reprezentánsok szekvencia-analízis mip gén 16S rdns-nél variábilisabb régió faji szintő azonosítás 95% hasonlóság felett 6 törzs > 95% hasonlóság Legionella pneumophila 1 csoport 1 faj nagy hasonlóság több Legionella pneumophila szerotípussal is Megoldás: MLST beállítása
Ismert szerotípusú L. pneumophila törzsekkel végzett vizsgálatok REP-PCR vizsgálat (ERIC primerekkel) 377 vizsgált izolátum (+ típustörzsek): Egy-egy dendrogram a kül. intézményekbıl izolált törzsek hasonlósági viszonyait ábrázolja Összevetettük a kül. intézményekbıl izolált jellemzı törzsek mintázatait egymással Különbözı mintavételi helyekrıl is lehet hasonló REP-PCR mintázat 1 Összes izolátum: 12 nagyobb REP-PCR csoport REP-PCR-rel kapott csoportosítás összevetése a szerotípusokkal 7 6 5 szerotípusok REP-PCR csoportok szerotípusok alatti felbontás 4 3 1 REP-PCR csoport több szerotípus 2 1 0 1.eü.* 2.eü. 4.eü. 8.eü. 10.eü.* 11.eü. 12.eü.* 1.sz. 1 FPQuestTM Software (verziószám: 4.5) Dice hasonlósági index, UPGMA távolságszámítás 2.sz. 3.sz. 4.sz. 5.sz.* 7.sz.* 8.sz. szerotipizálás kiváltására közvetlenül nem alkalmas
Célkitőzés: Real-time PCR beállítása
Feltételezett elıny: Alátámasztás: További elıny: Módszer beállítása: DNS kivonás csak az élı sejtek Pseudomonas aeruginosa-val elölt Legionella Alacsony csíraszámnál is reprodukálhatóan mőködik 1. Legionella-val inokuált steril deszt. víz minta (10-10 4 CFU/l) 2. Legionella-val + P. aeruginosa-val inokuált steril deszt. víz minta (mátrix: 10 és 10 3 CFU/L) 3. Legionella-val inokuált steril deszt. víz minta (10-10 4 CFU/l) + összcsíra (10 4 CFU/L) 10,00 9,00 8,00 értékek 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 y = -1,0945x + 9,1293 R 2 = 0,8248 DNS konc. [ug/ml] log 10 Legionella csíraszám [CFU/100ml] Lineáris (DNS konc. [ug/ml]) Lineáris (log 10 Legionella csíraszám [CFU/100ml]) 2,00 1,00 0,00 y = -0,51x + 3,9136 R 2 = 0,9492 A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 minták
Real-time PCR 10 2 kópia 16S rdns és mip gén alapú egyidejőleg Alacsony csíraszámnál is Elızetes eredmények: 100 kópia számunkra elégséges érzékenység Eddig csak inokuált vízmintán teszteltük (Legionella pneumophila 1)
Célkitőzés: FISH technikán alapuló módszer beállítása
Fluorescens in situ hibridizálás (FISH) CÉL: FISH-technika alapú módszer kidolgozása a legionellák megtelepedésének és túlélésének közvetlen vizsgálatára biofilmekben 1. A legionellák megtelepedésének nyomonkövetése tárgylemezen növesztett biofilmben Kérdés: amıbák nélkül képesek-e szaporodni? 2. Legionellák vízmintából történı kimutatására alkalmas FISH technika kidolgozása Terv: A vízmintát membránszőrın szőrjük A filtert néhány órán át elıinkubáljuk Közvetlenül a filteren végezzük a hibridizációt Beállítás alatt eddig beállítva tárgylemezen
Célkitőzés: Bevezetett módszerek alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál
Járványügyi kivizsgálások A bevezetett vizsgálati módszerek alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál Szerotipizálás (pontos szerotípus meghatározás) Törzsek elızetes vizsgálata: REP-PCR PFGE (pulse field gel electrophoresis) Esetek Nosocomiális eset I. ø humán izolátum Nosocomiális eset II. (két kórház érintett) ø humán izolátum Területen szerzett legionárius megbetegedés ø humán; ø környezeti izolátum Utazással összefüggı legionárius megbetegedés
Utazással összefüggı legionárius N=27 megbetegedés kivizsgálása Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] Legionella_9812 60 70 80 90 100 Legionella_9812 Vizsgálati módszer: kromoszóma restrikciós enzim emésztést követı PFGE (pulzáltatott mezejő gél elektroforézis). 1251/1/1. 1258/2/1. 1251/1/2. 1254/2/2. 1253/2/2. 1258/1/08. 198. 1256/1/1. 1250/1/1. 732/1/08. 723/1/08. 725/1/08. 726/1/08. 716/2/08. 734/2/08. 711/2/08. 1. 1. 1. 1. 1. 1. 1. 3. 3 1 1 1 1 1 1 1 Lpn001 Lpn002
Összefoglalás Az összesen vizsgált 102 objektum 65 %-a legionellával kolonizált Az összes vizsgált minta (1 065) 25%-nak Legionella-csíraszáma haladja meg az 1 000 CFU/l-t A rendszeres hıfertıtlenítés megfelelı védelmet biztosít; a vegyszeres fertıtlenítésnél elengedhetetlen a megfelelı méretezés 864 törzsbıl álló törzsgyőjtemény összeállítása Leggyakoribb szerotípus: L. pneumophila 1, 6, 3 REP-PCR nem alkalmas a szerotipizálás kiváltására, de járványügyi kivizsgálásoknál elıszőrésre kiválóan alkalmazható Beállított módszerek sikeres alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál További feladatok: 1. Real-time PCR alkalmazása valós vízmintákon 2. FISH beállítása (és FISH beállítása biofilm-vizsgálatokra) 3. MALDI-TOF MS eredmények kiértékelése 4. MLST beállítása és alkalmazása a járványügyi szempontból releváns törzseken
Cikk referált folyóiratban: Publikációk Zs. Barna, K. Antmann, R. Bánfi., M. Németh., A. Szax, M. Vargha: Role of drinking water system in the transmission of Pseudomonas aeruginosa and Legionella ssp. in an intensive care unit. in: Journal of Water and Health folyamatban Nemzetközi konferencia részvételek: Vargha, M.; Barna, Zs.; Illés, E.; Varga, D.; Kádár, M.: Tracing Legioneallae in a hospital s hot water system by rep-pcr and intact cell MALDI-TOF MS. International Symposium on Microbial Ecology, Bécs, Ausztria, 2006. 08 Barna, Zs.; Bognár, Cs.; Horváth, K.; Kalácska, J.; Kádár, M.; Vargha, M.: Prevelance of Legionella types in Hungarian water samples by different typing methods. 22nd Meeting of European Working Group for Legionella Infections. Stockholm, Svédország, 2007.06 Barna, Zs.; Bognár, Cs.; Kádár, M.; Kalácska J.; Szax, A.; Vargha, M.: Current status of environmental Legionella prevalence in Hungary. 23th Meeting of European Working Group for Legionella Infections. Madrid, Spanyolország, 2008.05 Zs. Barna, K. Antmann, J. Pászti, M. Németh, R. Bánfi, M. Vargha Tap water as a potential source of nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections in an intensive care unit, 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Helsinki, Finnország, 2009.05 Témavezetés: Szax Anita (ELTE TTK): Legionella környezeti elıfordulásának jellemzése, Budapest, 2009