KÓROKOZÓ VÍRUSOK ELŐFORDULÁSA MAGYARORSZÁGI FELSZÍNI- ÉS FÜRDŐVIZEKBEN. Doktori értekezés tézisei. Kern Anita

Átírás

1 KÓROKOZÓ VÍRUSOK ELŐFORDULÁSA MAGYARORSZÁGI FELSZÍNI- ÉS FÜRDŐVIZEKBEN Doktori értekezés tézisei Kern Anita Eötvös Loránd Tudományegyetem, Környezettudományi Doktori Iskola, Környezetbiológia Program, Budapest Doktori Iskola Vezetője: Prof. Dr. Galácz András Programvezető: Prof. Dr. Ács Éva Témavezető: Dr. Vargha Márta Vízmikrobiológiai Osztály Országos Környezetegészségügyi Intézet, Budapest 2014

2 I. Bevezetés A vírusok a környezetben széles körben előfordulnak, így különféle víztípusokban is fellelhetők. A szennyvizek koncentráltan tartalmazzák a széklettel vagy a vizelettel ürülő, az emésztőrendszeren keresztül fertőzést kialakító úgynevezett enterális vírusokat. Jóllehet a vírusok jelentős része a szennyvízkezelés során eltávolítható, a kis méretüknek és a nagy ellenálló-képességüknek köszönhetően kisebb hányaduk átjuthat a tisztított szennyvízbe. Ahol a tisztított szennyvizet befogadó víz ivóvíz kinyerésére szolgál, vagy fürdési, sportolási célra is használják, ott nagy egészségügyi kockázattal kell számolni. Természetes fürdőhelyeken vagy medencés fürdőkben a fürdőzőktől származó szennyezés közvetlenül növeli a megbetegedés kialakulásának a kockázatát. A felszíni vizek szennyezése kommunális és mezőgazdasági szennyvízzel világszerte közegészségügyi problémát jelent. A fejlődő országokban a vízkezelés hiányában, vagy a nem megfelelő vízkezelés következtében gyakoriak a kórokozó vírusoknak tulajdonított enterális járványok, amelyekre a legérzékenyebbek az öt éven aluli gyermekek, az idősek és a legyengült immunrendszerű emberek. A probléma a fejlett országokban is megmutatkozik, de esetszerűen, javarészt rendkívüli időjárási eseményekkel összefüggésben. A klímaváltozás következtében a szélsőséges események előfordulása várhatóan gyakoribbá válik, elősegítve ezáltal a vízzel is terjedő enterális vírusok térhódítását. Az egyre sűrűbben előforduló heves esőzések, a növekvő átlaghőmérséklet és a világszerte gyakoribbá váló áradások mind elősegítik a patogén mikroorganizmusok terjedését és túlélését. Magyarországon az utóbbi évtizedekben egyre gyakrabban derül fény a víz közvetítő szerepére vírusjárványok esetén. A kórokozók terjedésének azonosítása a júniusi miskolci ivóvízjárványtól eltekintve közvetett módon történt: a humán minták, a vízmintákból kimutatott fekális indikátor baktériumok és epidemiológiai adatok alapján azonosították az ivó-, illetve fürdővizet, mint szennyező terjesztő közeget. A jelen dolgozatban olyan víruskimutatásra alkalmas módszerek kidolgozása történt meg, amely a vízzel is terjedő potenciálisan patogén vírusok kimutatására ad lehetőséget nagy mennyiségű akár 10 liter vízmintából. A víruskoncentrálási és vírus nukleinsav detektáló technikák alkalmazásával a víz, mint lehetséges fertőzést közvetítő közeg vizsgálata a rutin vírusdiagnosztika részévé válhat Hazánkban is. A vizekben előforduló vírusok kimutatása több okból kifolyólag nagy kihívást jelent, ami a víztípusok nagy változatosságában, azok összetettségében és a vírusok vízben fellelhető alacsony titerében rejlik. A folyamatsor egészét és az egyes lépéseit tekintve sem létezik 2

3 szabványos eljárás. A klinikai mintáktól eltérően a vizekben alacsonyabb a vírusok titere, ezért első lépésként koncentrálni kell a vízben található vírusokat. A koncentrálási módszereket alapvetően négy fő kategóriába sorolhatjuk adszorpciós-elúciós, ultraszűrés, ultracentrifugálás és direkt kicsapatás, amelyek közül kétféle adszorpciós-elúciós metodika és egy direkt kicsapatás koncentrálás összevetésére került sor. A módszerek széles tárháza áll rendelkezésre az enterális vírusok koncentrált mintából történő kimutatására, a közvetlen elektronmikroszkópos észleléstől kezdve a citopatogén hatás különböző sejtvonalakon történő detektálásán át az immunológiai vagy a molekuláris technikákkal történő indirekt diagnosztizálásig. Jelen dolgozatban a nukleinsav kivonást és tisztítást követően molekuláris módszereket alkalmaztunk (PCR és qpcr) a vírusok jelenlétének, illetve mennyiségének meghatározásához nyers és másodlagosan tisztított szennyvizekből, természetes és mesterséges fürdővizekből és egyéb felszíni vizekből. Emellett egy másfél éves mintázási időszakra kiterjedően vizsgáltuk különféle fizikai-kémiai, hidrológiai és meteorológiai paraméterek vírusokra gyakorolt hatását vizes közegekben a Viroclime pályázat keretein belül. A pályázat során lehetőség nyílt kórokozó vírusok és indikátor baktériumok kapcsolatának vizsgálatára. II. A kutatás célkitűzései ü Víruskoncentrálási, vírus nukleinsav kivonási és tisztítási, valamint molekuláris víruskimutatási módszerek kidolgozása és összehasonlítása. ü Enterális vírusok jelenlétének, mennyiségének meghatározása különféle víztípusokból Magyarország több pontjáról. ü Fizikai-kémiai, hidrológiai és meteorológiai tényezők víz közvetítette enterális vírusok terjedésére és túlélésére gyakorolt hatásának vizsgálata. ü Másodlagos (biológiai) szennyvíztisztítás hatékonyságának értékelése kórokozó vírusokat és indikátor baktériumokat tekintve. ü Humán enterális vírusok, állati enterális vírusok és indikátor baktériumok közötti kapcsolat vizsgálata felszíni- és szennyvízben. ü Emberi és állati vírusok mikrobiális nyomkövetésben való alkalmazhatóságának vizsgálata. 3

4 III. Vizsgálati módszerek A humán és állati patogén vírusok kimutatása céljából 10 liter térfogatú felszíni- és fürdővízmintákat, illetve ml szennyvíz mintákat vettünk. Az indikátor szervezetek jelenlétének elemzéséhez 250 ml vizet mintavételeztünk. A vizsgált vízminták összesen 41 különböző helyről származtak, közülük medencés fürdővízből 13, természetes fürdővízből 6, nyers szennyvízből 2, másodlagosan tisztított szennyvízből 1, valamint egyéb felszíni vízből 19 helyszínen történt mintavétel. A vízminták koncentrálása a módszertesztelés időszak alatt adszorpciós-elúciós módon történt kétféle adszorbenssel: membránfilterrel, illetve üveggyapottal. Az előzetesen 3,5 ph-ra beállított vízmintákat átáramoltattuk a kitapadásért felelős felületen, majd 3 %-os, 9,5 ph-jú glicines húskivonat oldattal oldottuk le a vírusrészecskéket, amelyeket a centrifugálást megelőzően pelyhesítettünk 1 N HCl oldattal. Az ülepített vírusrészecskékről a felülúszót elöntöttük, majd foszfát pufferrel 10 ml végtérfogatra kiegészítve nyertük a víruskoncentrátumot. A direkt kicsapatás metodika esetében első lépésként a felszíni vízminta vezetőképességét 1600 µs fölé állítottuk, míg a szennyvíz mintákat 1:2 térfogatarányban 0,25 M glicin oldattal elegyítettük és 30 percen keresztül jégen rázattuk. A szennyvizek felesleges lebegőanyagainak eltávolítása centrifugálással történt, így a továbbiakban a felülúszóval dolgoztunk. A 3,5 ph-jú vízmintához ezt követően 1:100 térfogatarányban előzetesen 1 N HCl oldattal 3,5 ph-n pelyhesített fölözött tejoldatot adagoltunk. Az így kezelt mintákat legalább 8 órán keresztül kevertettük, ezáltal a vízmintákban található vírusrészecskék a tejfehérjékhez kapcsolódtak. A kevertetés után minimum 8 órán át ülepítettük a vírusrészecske-tejfehérje komplexeket. A szennyvíz mintákat közvetlenül az ülepítés után centrifugáltuk, majd a felülúszót elöntöttük és az üledéket foszfát pufferben feloldva 2 ml-es végtérfogatú víruskoncentrátumot hoztunk létre. A 10 literes felszíni vízminták felülúszóját eltávolítottuk úgy, hogy a maradék térfogat kevesebb, mint 500 ml legyen, majd centrifugálással tovább ülepítettük. Az ülepített vírusrészecske-tejfehérje komplexről leöntve a felülúszót, foszfát pufferben oldottuk fel, a koncentrátumot 10 ml végtérfogatra állítva. A kezdeti vizsgálatok során a nagyobb kiindulási térfogat feldolgozására is alkalmas mágneses szilikát gyöngy alapú módszert NucliSens minimag TM alkalmaztuk, majd a két nukleinsav kivonási és tisztítási módszer összevetését követően áttértünk a kisebb térfogatból kiinduló, de nagyobb érzékenységű és tisztaságú nukleinsav oldatot előállító szilikát oszlopos nukleinsav kivonási és tisztítási technikára QIAGEN QIAamp Viral RNA Mini kit. A mágneses szilikát gyöngy módszerrel 5 ml víruskoncentrátumból vontuk ki a 4

5 vírus nukleinsavat 100 µl tisztított nukleinsavat nyerve. A szilikát oszlop technika 140 µl víruskoncentrátumból indult ki, amely 80 µl tisztított nukleinsav koncentrátumot eredményezett. A humán adenovírus, enterovírus, egyes és kettes genocsoportú norovírus, JC polyomavírus, sertés adenovírus és szarvasmarha polyomavírus örökítőanyag kimutatása vírus specifikus primerekkel működő polimeráz láncreakcióval (PCR) történt. A humán és a sertés adenovírus, valamint a szarvasmarha polyomavírus jelenlétének igazolása nested PCR-rel, enterovírus RNS kimutatás reverz transzkripciós nested PCR-rel, kettes genocsoportú norovírus kimutatás pedig reverz transzkripciós seminested PCR-rel történt. A mennyiségi meghatározást humán és sertés adenovírus, JC és szarvasmarha polyomavírus, illetve egyes és kettes genocsoportú norovírus esetében kvantitatív PCR-rel (qpcr) végeztük. A qpcr-hez kompetens sejtekbe transzformált plazmidban voltak klónozva a célgének meghatározott régiói, amelyekből linearizálást és restrikciós endonukleázokkal történő emésztést követően kinyerhetőek voltak a célszakaszok. Az inzert hosszának ismeretében olyan törzsoldatot készítettünk vírusonként, amelynek 10 µl-ében 10 6 genom kópiaszámban (GC) van jelen a célszakasz. Ezen törzsoldatból készült hattagú tízes alapú hígítási sor szolgált a qpcr-ek standard görbéjeként és adott lehetőséget az abszolút mennyiségi meghatározásra. A vírusok mellett indikátor baktériumok (Escherichia coli, intesztinális Enterococcus, medencés fürdők esetében Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, összes coccus is) csíraszámát is mértük a vizekben felszíni vizek és szennyvizek esetében mikrotiter módszerrel, míg medencés fürdővizek esetében membránszűréssel. Szomatikus colifág titert is meghatároztunk szabványos lemezöntéses technikát alkalmazva. IV. Új tudományos eredmények 1. Az adszorpciós-elúciós víruskoncentrálási módszert kétféle negatív töltésű membránfilter és üveggyapot adszorbenssel teszteltük 37 vízminta pár vizsgálatával. Humán adenovírus és enterovírus esetében nagyobb arányban találtunk pozitív mintákat üveggyapoton történő koncentrálást követően, míg kettes genocsoportú norovírust mindkét adszorbenssel azonos hatásfokban tudtuk a vízmintákból detektálni. Üveggyapottal a kimutatható adenovírus genom kópiaszám is magasabb volt. Az üveggyapot és a direkt kicsapatás koncentrálás összehasonlítása felszíni- és szennyvizek vizsgálata során nem mutatott szignifikáns különbséget sem víruskinyerés, sem vírusvisszanyerés tekintetében. Mivel a két víruskoncentrálási metodika hatékonysága meglehetősen hasonló, viszont a direkt 5

6 kicsapatással kisebb anyag- és eszközköltség mellett egyszerre több minta is feldolgozható, könnyebben kivitelezhető és kisebb a keresztszennyeződés esélye is, így vizsgálatainkat kizárólag direkt kicsapatással folytattuk. 2. A nagy térfogatú felszíni vízminták és a kisebb térfogatú szennyvíz minták koncentrálását követően a humán adenovírus nukleinsav kimutatása, illetve visszanyerése a szilikát oszlopos technikával hatékonyabbnak és megbízhatóbbnak bizonyult a mágneses szilikát gyöngy módszerrel szemben. Emellett a vízmintákhoz adagolt humán adenovírus titerét a szilikát oszlopos módszert követő qpcr eredmények közelítették meg jobban. 3. A módszerek tesztelése alatti időszakban a vizsgált vízminták több mint kétharmada (53/74) mutatott humán adenovírus pozitivitást nested PCR vizsgálattal. Kettes genocsoportú RNS 31 mintából, enterovírus RNS pedig 13 mintából volt kimutatható. Ötvenhat minta tartalmazott legalább egyet a tesztvírusok közül. Az egyéb felszíni vizekben általános volt a vizsgált vírusok jelenléte. Mind a természetes, mind a medencés fürdőknél nagy arányban mutattuk ki potenciálisan patogén vírusok örökítőanyagát. Mindegyik természetes fürdővíz mintavételi ponton és medence vízből legalább az egyik vizsgált víruscsoport nukleinsavát detektáltuk. Ezzel szemben a minősítésre alkalmazott mikrobiológiai paraméterek megfelelőséget jeleztek több esetben is. 4. A szisztematikus vizsgálatok során összesen 129 felszíni vízmintából történtek vírus- és indikátor baktérium vizsgálatok. Szinte valamennyi vízminta (127) tartalmazott humán adenovírust. Kimagasló mennyiségű mintából sikerült a többi DNS vírust is detektálni: sertés adenovírusra 106, szarvasmarha polyomavírusra 101, JC polyomavírusra 83 minta volt pozitív. Kevesebb, mint a minták fele (51 minta) mutatott egyes, míg 52 minta kettes genocsoportú norovírus pozitivitást. A vírusok koncentrációit tekintve szintén DNS vírusok esetén tapasztaltuk a legmagasabb kópiaszámot. Átlagosan GC/L DNS vírus kópiaszámot detektáltunk, míg a norovírus titer GC/L között mozgott. Az egyes mintavételi pontok közötti vírustiterekben nem volt jelentős különbség. 5. A fizikai-kémiai, hidrológiai és meteorológiai paraméterek vírusok előfordulására, terjedésére és túlélésére gyakorolt hatását is vizsgáltuk a pályázat részeként. Legerősebb (negatív) korreláció állt fenn az összes általunk ismertetett hidrológiai változó és az állati vírusok titere között. A DNS vírusok átlagos lassú és gyors vízáramlásnál mért átlag titerei közti különbség a két nagyságrendet is elérte, amely különbség a vízhozam esetében szintén kimutatható volt. Mind a humán, mind az állati vírusok esetében is megfigyelhető volt az évszakosság. A humán adenovírus folyamatosan jelen volt a Tisza vizében a vizsgált szakaszon. A JC polyomavírus esetében látványos szezonalitás jelentkezett: a 6

7 tavaszi legalacsonyabb és az őszi legmagasabb titer közti különbség elérte a kettő nagyságrendet. A norovírusok közül az egyes genocsoport tagjai 2011 telén és tavaszán mutatta a csúcsot, ami a 2012-es mintázások alkalmával nem ismétlődött meg. Viszont a kettes genocsoportú norovírusok téli-tavaszi megnövekedett genom kópiaszámát mindkét évben detektáltuk. A legszembetűnőbb különbségek az állati vírusok esetében voltak megfigyelhetőek. A minimum koncentrációkat a téli és kora tavaszi hónapokban mutatták mind a két évben. A vírus titerben két maximum csúcs volt megfigyelhető mindkét állati vírusnál: júniusban és az őszi hónapokban. A számítások is alátámasztják, hogy az állati vírusok koncentrációja nagyobb a meleg évszakokban, és a JC polyomavírus titer is alacsonyabb a hideg hónapokban. A mintavételt megelőző 24, 48 és 72 órában hullott csapadék mennyisége nem gyakorolt hatást a mikroorganizmusok koncentrációjára, amennyiben az összes felszíni vízmintát együttesen kezeljük. Viszont ha a mintavételi helyeket külön elemezzük, akkor az állati vírusoknál tapasztaltunk 24 órán belül hullott csapadék esetében egy nagyságrendnél magasabb koncentráció különbséget az egyik (Tisza4) mintavételi ponton. Az összes mintát együttesen tekintve is és a mintavételi pontokon külön vizsgálva is trendszerű titerbeli csökkenést észleltünk, amennyiben a JC polyomavírust és a mintavételt megelőző 24, 48 és 72 óra alatt mért napsütéses órák számát tekintjük. A víz ph-ját összevetve a kapott vírus titerekkel nem jelentkeztek szignifikáns különbségek. Az összes vizsgált DNS vírus esetében átlagosan magasabb volt a nagyobb vezetőképességű minták titere. Mind a négy általunk vizsgált DNS vírus kimutathatóságát csökkentette a minta nagyfokú lebegőanyag tartalma. A háttéradatok és a mikrobiológiai eredmények összevetésekor többször is tapasztaltuk, hogy az állati vírusok általában hasonló módon viselkedtek meghatározott környezeti feltételek között, amelyet számítással is igazoltunk. Ezzel szemben az indikátor baktériumok jellemzően ellentétes trendet mutattak. 6. A másfél éves monitorozási időszakban a Tiszába kibocsátó szennyvíztisztítóból összesen 33 kezeletlen nyers szennyvíz mintát és 32 másodlagosan kezelt szennyvíz mintát vizsgáltunk. A nyers szennyvíz minták mindegyike tartalmazott humán és sertés adenovírust, JC polyomavírust és kettes genocsoportú norovírust. Egyes genocsoportú norovírust 27, szarvasmarha polyomavírust 29 nyers szennyvíz mintából tudtunk kimutatni. Miután a szennyvíz további mechanikai és biológiai eleveniszapos tisztításon átesett, a vírus pozitív minták aránya csökkent. A 32 effluens minta közül 29 mintában sertés adenovírus, mintában JC és szarvasmarha polyomavírus, 25 mintában a kettes genocsoportú norovírus, míg a minták majdnem felében (18/32) az egyes genocsoportú 7

8 norovírus koncentráció a módszer kimutatási határa fölött volt. Ezzel szemben humán adenovírust az összes vizsgált effluens mintában is detektáltuk. Az eleven iszaposan kezelt szennyvíz minták átlagos vírus titere GC/L között mozgott, vírusonként ilyen mértékű terheléssel kell számolni a befogadó víztest esetében. Az átlagos víruskoncentráció a DNS vírusoknál volt magasabb ( GC/L), az RNS vírusoké a GC/L tartományban volt. Az enterális vírusok genom kópiaszámában átlagosan 0,5-1,5 nagyságrendnyi csökkenést tapasztaltunk. Az RNS vírusok eltávolítása történt a legnagyobb hatásfokkal, míg az állati (DNS) vírusok tanúsították a legnagyobb ellenállást a másodlagos szennyvízkezelés során. Az indikátor baktériumok eliminálása a nyers szennyvízből jelentősen hatékonyabb volt, mint a vírusoké. 7. A Tisza Szolnok és Tiszakécske közötti szakaszán előforduló lehetséges szennyező források összetétele alapján humán és állati (sertés és szarvasmarha) eredetű szennyezés nyert bizonyosságot. A Tiszában mért magas vírus koncentrációk okának felderítése érdekében további pontok mintázása és virológiai vizsgálata történt meg. A két emberi vírus együtt mozgott a kiegészítő mintázások során, minden mintában jelen voltak. Az egyik csatorna kétszeri mintázásakor sertés adenovírus DNS egyik alkalommal sem volt kimutatható koncentrációban jelen, míg szarvasmarha polyomavírust mindegyik mintából detektáltuk. A vizsgált állati és emberi vírusok arányában sem a Tiszában sem a Tisza befolyóiban nem jelentkezett szignifikáns különbség. V. Következtetések A dolgozat első szakaszát víruskimutatási módszerek koncentrálási és molekuláris detektálási technikák beállítása és összehasonlítása képezte. Az általunk vizsgált víztípusok esetében az üveggyapot hatékonyabban köti meg a vírusokat, mint a membránfilter. A két koncentrálási lépést magába foglaló adszorpciós-elúciós folyamatnál jelentősen egyszerűbb és kisebb munkaigényű a direkt kicsapatás módszere. Eredményeink alátámasztották, hogy a direkt kicsapatás nemcsak egyszerűbben kivitelezhető és költséghatékonyabb, hanem alkalmasabb adenovírusok felszíni- és szennyvizekből történő kimutatására és a vírusvisszanyerés is megbízhatóbb. A mágneses szilikát gyöngy és a szilikát oszlopos nukleinsav kivonási és tisztítási módszerek összevetése alapján kijelenthető, hogy a szilikát oszlopos metodikával a koncentrálás során feldúsuló PCR-t gátló anyagok nagyobb hatásfokkal távolíthatók el, amely nem megy a nukleinsav tisztaságának és mennyiségének rovására. Öt laboratórium részvételével végzett összemérési vizsgálatok során bizonyosságot 8

9 nyert, hogy az alkalmazott vírus specifikus qpcr-k mind érzékenység, mind reprodukálhatóság, mind ismételhetőség tekintetében megfelelőnek tekinthetők. A szennyvíztisztítás során csökken a vírusok mennyisége, de nem távolíthatók el teljes mértékben a vízkezeléssel. A (tisztított) szennyvizek befogadója gyakran felszíni víz, így nem meglepő, hogy a módszertesztelés időszakában vizsgált egyéb felszíni és természetes fürdővizekben általános volt a humán adenovírus jelenlét, illetve RNS vírusok is figyelemre méltó arányban fordultak elő. Legnagyobb kockázatot azon felszíni vizek jelentik, ahol kijelölt fürdőhely és/vagy ivóvízkinyerő hely található. A vírusokat a vírushordozó és -ürítő fürdőzők is juttathatják a vizekbe, ezáltal a medencés fürdővizek is vírusokkal szennyeződhetnek. A vízforgatásos rendszerű medencék vizét folyamatosan fertőtlenítőszerrel kezelik, mégis megközelítő arányban tudtuk kórokozó vírusok örökítőanyagát kimutatni töltőürítő és vízforgatott medencék vizéből. Ehhez a nem megfelelő vízkezelés járulhatott hozzá. Mindegyik medencés fürdővíz minta tartalmazta legalább az egyik vizsgált vírust, ugyanakkor volt olyan medencés fürdővíz, amely bakteriológiailag nem esett kifogás alá, amely alátámasztja a korábbi megfigyelést, miszerint a bakteriális indikátorok nem adnak jó előrejelzést a humán patogén vírusok jelenlétére vonatkozóan. Az eredmények ismeretében elképzelhető, hogy a rekreációs vízhasználathoz kapcsolódó fertőzések az eddig feltételezettnél gyakoribbak, csak az összefüggést a legtöbb esetben nem ismerik fel. A Tisza Szolnok-Tiszakécske közti szakaszán a teszt időszak alatt emberi és állati enterális vírusok perzisztáltak nemcsak a nyers szennyvíz mintákban, hanem a biológiai úton tisztított szennyvíz és a felszíni vízmintákban is. A négy felszíni víz mintavételi helyen mért vírus titerek között számottevő különbség nem mutatkozott. A folyóvíz hidrológiai tulajdonságai és a víruskoncentrációk ellentétesen változtak. Egyes vírusok évszakos periodikusságot, mások folyamatos jelenlétet tanúsítottak. A Nap UV sugarainak víruselimináló hatását JC polyomavírus esetében lehetett kis mértékben tapasztalni. A vizsgálati periódus alatt kevés csapadék hullott, nem befolyásolta a vírusok eloszlását. A Tisza víz mért fizikai-kémiai változói közül a vezetőképesség csökkenésével párhuzamosan csökkent a DNS vírusok titere. A víz zavarossága negatívan befolyásolta a vírus titert, illetve a vírusok kimutathatóságát. A két állati vírus hasonlóan reagált a hidrológiai, a meteorológiai és a fizikai-kémiai tulajdonságok változására. A térségi epidemiológiai adatok az enterális vírusok állandó jelenlétét mutatták a lakosságban, így nem meglepő a szennyvizek és a felszíni vizek humán adenovírus, JC polyomavírus és norovírusok általi nagyfokú terheltsége. A nyers szennyvízben a vírus titerek kiegyenlítettebbek voltak, de kisfokú évszakosság jelentkezett a koncentrációk változásában 9

10 és a szennyvíztisztítás hatékonyságában. Az elsődleges és a másodlagos (biológiai) szennyvíztisztítás átlagosan 1-2, maximálisan három nagyságrenddel csökkentette a vírusok mennyiségét a szennyvíz kifolyóban. A DNS vírusok eltávolíthatósága kisebb volt, mint az RNS vírusoké. A Tisza sodorvonalába engedett másodlagosan tisztított szennyvíz GC/L vírussal terhelte a folyót, ami a nagy víztesttel elegyedve kihígult. Az állati vírusok mind a felszíni, mind a szennyvizekből kimutathatók voltak. A Tisza mellékfolyójában, a Tiszába ömlő csatornákban az állati és a humán vírusok egyaránt jelen voltak. Ezzel igazolást nyert, hogy a vizsgálati területről eredő szennyezések állati és emberi forrásból is származnak. Az indikátor baktériumok és az enterális vírusok közötti kapcsolat hiányának kísérletes bizonyítása megtörtént, ami azért lényeges, mert olyan helyeken is folyamatosan és számottevő koncentrációban mutattunk ki vírusokat, amely ivóvíz kinyerésére szolgál, illetve kijelölt természetes fürdőhelyként működik. A jelen vizsgálatok jelentősen bővítették a kórokozó vírusok hazai környezeti előfordulásáról való ismereteket, és nemzetközi vonatkozásban is jelentős eredményeket szolgáltattak a vírusok előfordulását befolyásoló környezeti tényezők terén. A bevezetett módszerek lehetőséget nyújtanak az emberi kórokozó vírusok kimutatására az expozíció szempontjából jelentős vizekben, akár rutin vízminősítő vizsgálatok, akár járványügyi kivizsgálások során. VI. Az értekezés témaköréből készült publikációk jegyzéke Rusiñol M, Fernandez-Cassi X, Hundesa A, Vieira C, Kern A, Eriksson I, Ziros P, Kay D, Miagostovich M, Vargha M, Allard A, Vantarakis A, Wyn-Jones P, Bofill-Mas S, Girones R: Application of human and animal viral microbial source tracking tools in fresh and marine waters from five different geographical areas. Water Res. 2014; 18: Kern A, Kádár M, Szomor K, Kapusinszky B, Vargha M: Detection of enteric viruses in Hungarian surface waters, first steps towards environmental surveillance. J. Wat. Health. 2013; 11 (4): Rusiñol M, Carratalà A, Hundesa A, Bach A, Kern A, Vantarakis A, Girones R, Bofill-Mas S: Description of a novel viral tool to identify and quantify ovine fecal pollution in the environment. Sci. Tot. Environ. 2013; : Carratalà A, Rusiñol M, Hundesa A, Biarnés M, Rodriguez-Manzano J, Vantarakis A, Kern A, Suñen E, Girones R, Bofill-Mas S: A novel tool for trace poultry fecal contamination in the environment. Appl. Env. Microbiol. 2012; 78: Kern A, Bánfi R, Kádár M, Vargha M: Vízzel terjedő vírusok a hazai felszíni és fürdővizekben Egészségtudomány LV. Évfolyam szám oldal 10