Humán kórokozó vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl

Átírás

1 Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Környezettudományi Doktori Iskola Humán kórokozó vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl Kern Anita Témavezetı: Dr. Vargha Márta, Országos Környezetegészségügyi Központ Belsı konzulens: Dr. Márialigeti Károly, ELTE TTK Mikrobiológiai Tanszék

2 Bevezetés I. A vírusok helye az elıvilágban: élı vagy élettelen? Két megjelenési forma: vegetatív vírus és virion DNS és RNS vírusok Baltimore-féle rendszerezés A vírusok is a vízi élettér részei Klasszikus vízmikrobiológiai modellszervezetek Escherichia coli Intesztinális Enterococcus Terjedésük és túlélésük eltér a humán kórokozó vírusokétól Kevésbé ellenállóak Szomatikus colifág Indikátorok indikátorai

3 Bevezetés II. A legtöbb víz okozta megbetegedés esetén nem azonosítható a kórokozó ágens A fertızések többségét általában enterális vírusok okozzák Fıként széklet-száj úton terjednek A fertızött, illetve vírushordozó humán populáció a vírusürítés fı forrása Szennyezett, továbbá a tisztított szennyvízzel kerülhetnek a fürdıvizekbe a vírusok Rendkívül ellenálló, burok nélküli vírusok

4 Bevezetés III. Adenoviridae (HAdV) Humán Ad 6 csoport: A-F Vízben leginkább F: Ad40, Ad4 Hányás, hasmenés Továbbá C: Ad, Ad5 Fıként légúti megbetegedések Caliciviridae humán genus: Norovirus (NoV), Sapovirus Nem bakteriális gastroenteritis járványok 70-90%-át okozhatják (kortól függetlenül) winter vomiting disease Változatos terjedési út: kontaktus, széklet, aerosol, szennyezett víz, élelmiszer Picornaviridae Enterovirus (EV) Legtöbb fertızés enyhe vagy tünetmentes lefolyású, de olykor fatális kimenetelő is lehet Megbetegedések széles spektruma

5 Bevezetés IV. A vírusok vízben való jelenlétének kimutatására szolgáló módszerek még fejlesztés alatt állnak A vírusok kópiaszáma természetes vizekben alacsony Klasszikus molekuláris technikák Gyorsaság Specificitás Érzékenység Fertızıképesség Mennyiségi meghatározás Többféle vírus/minta

6 Célkitőzések Víruskoncentrálási módszer beállítása felszíni vizekre a Virobathe projektben kidolgozott protokoll alapján Víruskoncentrálás membránfilterrel Víruskoncentrálás üveggyapot tölteten A két koncentrálási módszer összehasonlítása Nukleinsav kivonás, specifikus PCR módszer és szekvenciameghatározás optimalizálása vírusok (HAdV, EV, NoV) kimutatására felszíni vízbıl nyert koncentrátumból Emberi kórokozó vírusok kimutatása magyarországi felszíni vízmintákból Enterális vírusok jelenlétének és a bakteriális indikátorok csíraszámának, illetve a szomatikus colifágok mennyiségének összevetése a felszíni vízmintákban Víruskimutatást gátló hatás jelenlétének vizsgálata Humán patogén vírusok évszakfüggı jelenléte

7 Mintavételi helyszínek Gyır, Mosoni-Duna Budapest, Dráva utca + Petıfi híd + Csepel Rózsa utca: Csongrád, Köröstorki strand Szeghalom, Berettyó Körösladány, Sebes- Körös Balatonfüred, Koloska + Kékipatak Tiszakécske, Tiszaparti Szabadstrand Gyoma, Hármas- Körös

8 Anyag és módszer I. 0 L felszíni vízminta ph beállítása 3,5-re Szőrés üveggyapot tölteten, illetve membránfilteren

9 Anyag és módszer II. Eluálás Flokkulálás majd centrifugálás Feloldás foszfát pufferben

10 Anyag és módszer III. Nukleinsav kivonás mágneses gyöngy technikával 5 ml víruskoncentrátumból Vírus Módszer Célszekvencia Termék (bp) Forrás Adenovírus nested PCR HEXON 30 7 Allard et al., 00 Enterovírus RT-PCR 5 NTR 534 Puig et al., 994 Norovírus RT-seminested PCR RNS-dependens RNS polimeráz Vennema et al., 00 Pozitív PCR termékek szekvenálása és szekvenciaanalízise (CLUSTAL W és BLAST )

11 Eredmények Koncentrálás Adenovírus Norovírus Üveggyapot Membránfilter Üveggyapot Membránfilter Tisza - Csongrád Tisza - Tiszakécske Sebes-Körös - Körösladány Duna - Csepel Duna - Dráva utca Duna - Petıfi híd Duna - Csepel Összes pozitív Összes vizsgált

12 Eredmények Vírusjelenlét Adenovírus (/35) Tisza - Csongrád (/3) Tisza - Tiszakécske (/3) Sebes-Körös - Körösladány (/) Duna - Budapest (7/8) Dráva utca (5/6) Tél (/) Petıfi híd (6/6) Csepel, Rózsa utca (6/6) Norovírus (6/35) Tisza - Tiszakécske (/3). PCR termék ~36 bp Duna - Budapest (4/8) Dráva utca (5/6) Tél (/) Petıfi híd (5/6) Tél (/) Csepel, Rózsa utca (4/6) İsz (/) Tél (/)

13 Eredmények - Szekvenciaelemzés Minta Eredmény Hasonlóság Lefedettség Tisza - Tiszakécske HAdV4 90 % 97 % Duna - Dráva utca HAdV4 95 % 98 % HAdV40 93 % 98 % Duna - Csepel HAdV4 88 % 00 % Duna - Petıfi híd Kevert szekvenciák? HAdV40 9 % 95 % HAdV4 9 % 95 %

14 Eredmények Enterovírus Minden mintasorozat mellett ECHO vírusizolátummal elegyített csapvíz koncentrálása (pozitív kontroll) Enterovírus specifikus RT-PCR (Puig et al., 994) három hígításban Kimutathatóságot befolyásolta A csapvízben található klórt közömbösítı Na-tioszulfát hozzáadásának mellızése Magasabb ph

15 Eredmények Összevetés Összes vizsgált: N A A N A N A N A N A N A N A N A N A E. coli N A Enterococcus sp. A szomatikus colifág 0 A Adenovírus pozitív minták N Norovírus pozitív minták Tisza - Csongrád Tisza - Tiszakécske Hármas-Körös - Gyoma Sebes-Körös - Körösladány Berettyó - Szeghalom Mosoni-Duna - Gyır Koloska Kéki-patak Duna - Észak-Budapest ısz Duna - Közép-Budapest ısz Duna - Dél-Budapest ısz Duna - Észak-Budapest tél Duna - Közép-Budapest tél Duna - Dél-Budapest tél Duna - Észak-Budapest tavasz Duna - Közép-Budapest tavasz Duna - Dél-Budapest tavasz lg CFU / 00mL

16 Eredmények - Inhibíció 30 Adenovírus pozitív mint ták száma : :0 :00 Összes vizsgált 3 3 Duna - Dél-Budapest tavasz Duna - Közép-Budapest tavasz * Duna - Észak-Budapest tavasz Duna - Dél-Budapest tél Duna - Közép-Budapest tél Duna - Észak-Budapest tél Duna - Dél-Budapest ısz Duna - Közép-Budapest ısz Duna - Észak-Budapest ısz Sebes-Körös - Körösladány Tisza - Tiszakécske Tisza - Csongrád * * Nukleinsav hígítási foka

17 Eredmények Évszakfüggés E. coli csíraszámváltozása lg CFU/00mL ısz tél tavasz Vizsgált minták (8): Enterococcus sp. csíraszámváltozása lg CFU/00mL ısz tél tavasz. Duna Észak- Budapest. Duna Közép- Budapest 3. Duna - Dél- Budapest 000 Szomatikus colifág titerváltozása lg CFU/00mL 00 0 ısz tél tavasz 3

18 Következtetések I. A víruskoncentrálás és kimutatás hatékonyságát enterovírusra igazoltuk ECHO vírussal elegyített csapvízzel A két vizsgált víruscsoportból a vízmintákban (35 minta) humán adenovírusokat ( minta) és norovírusokat (6 minta) sikerült kimutatni Adenovírusok stabilabbak vizes közegben DNS vírus vs. RNS vírus A minták nem tartalmazták a vizsgált vírusokat Nem megfelelı a módszer(ek) érzékenysége Esetleges inhibíció, amely a hígítás fokának növelésével és bovin szérumalbumin hozzáadásával sem csökkent kellıképpen

19 Következtetések II. Az adenovírus vizsgálatok alapján igazolható a vírusok kimutatását gátló anyagok jelenléte A hígított mintából olyan esetben is detektálni lehetett a vírust, amikor a tömény mintából nem Szennyvízbeömlésnél kisebb hatékonyságú vírusvisszanyerés Összevetve a vírus és baktérium vizsgálatok eredményeit, elmondható, hogy a humán enterális vírusok jelenléte nem korrelál az indikátor baktériumok magas csíraszámával (Koloska, Kéki-patak) Hasonlóan, a szomatikus colifágok titere sem jelzi megfelelıen a humán enterális vírusok jelenlétét a felszíni vizekben Mind a három mikrobiológiai indikátor nagy koncentrációban volt jelen télen a Dunában, mégis ezekbıl a vízmintákból volt a legkisebb hatékonyságú az enterális vírusok kinyerése ıszi minták

20 Kitekintés A víruskoncentrálást és kimutatást gátló anyagok mennyiségének, illetve a gátló hatás csökkentése Szervetlen ionok (pl.: fémionok) Humuszsavak BSA, glicerin, DTT Alkalmazott PCR-k további optimalizálása Kondíciók Belsı kontroll Enterovírus, hepatitis A vírus és rotavírus kimutatás Kvantifikálás Visszanyerés hatékonyságának meghatározása Mintaspektrum kiszélesítése

21 A témában megjelent közlemények Tudományos elıadások Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Bánfi Renáta, Barna Zsófia, Farkas Ágnes, Dr. Vargha Márta: Vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl Vízmikrobiológusok VII. Országos Konferenciája, Budapest, 008. november 8. Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Bánfi Renáta, Barna Zsófia, Farkas Ágnes, Dr. Vargha Márta: Humán patogén vírusok kimutatása EpiBathe - Záróértekezlet, Budapest, 009. március 9. Tudományos poszterek Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Vargha Márta: Humán patogén vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl Fiatal Higiénikusok Fóruma, Gyır, 008. május Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Vargha Márta: Humán patogén vírusok kimutatása magyarországi fürdıvizekbıl Magyar Higiénikus Társaságának XXXVIII. Vándorgyőlése, Balatonvilágos, 008. szeptember 30 - október. Kern A., Kapusinszky B., Banfi R., Barna Zs, Farkas Á., Kadar M., N. Szomor K, Berencsi Gy., Vargha M.: Human pathogen viruses in Hungarian bathing waters COST99 Current developments in food and environmental virology, Pisa, Olaszország, 008. október 9-. Kern Anita, Kapusinszky Beatrix, Vargha Márta: Humán patogén vírusok kimutatása magyarországi felszíni vizekbıl A Magyar Mikrobiológiai Társaság 008. évi Nagygyőlése, Keszthely, 008. október 5-7.