Barna Zsófia. Eötvös Loránd Tudományegyetem - Természettudományi Kar Környezettudományi Doktori Iskola. Országos Környezetegészségügyi Intézet

Átírás

1 Eötvös Loránd Tudományegyetem - Természettudományi Kar Környezettudományi Doktori Iskola Legionella kolonizáció diverzitása ivóvízhálózatban Barna Zsófia Témavezetı: Dr. Vargha Márta Országos Környezetegészségügyi Intézet Belsı konzulens: Dr. Márialigeti Károly ELTE Mikrobiológiai Tanszék

2 A Legionella baktérium Gyakran vízzel asszociált kórokozó nedves meleg környezetben fordul elı Vízi egysejtő eukarióta szervezetekben intracellulárisan is szaporodik Szaporodásának optimális hımérséklete: C Gram-negatív, aerob, poláris vagy szubpoláris csillós pálca A Legionella genusnak > 50 ismert faja van Eddig 21 fajról derült ki, hogy képes humán megbetegedést okozni A jelentett fertızések %-a a Legionella pneumophila-ra vezethetı vissza L. pneumophila-nak 16 szerotípusa ismert L. pneumophila 1 okozza a legtöbb megbetegedést

3 A legionellosis A Legionella által okozott humán megbetegedések összefoglaló neve Pontiac-láz (nem pneumóniás forma) Legionárius betegség (pneumónia)

4 Kockázatot jelentı közegek hőtıtornyok légkondícionáló berendezések épületek nedves hőtési technológiával üzemelı légkondicionáló berendezései (hőtıtornyok) rosszul kialakított felületi hőtık (pl. split-klíma) (nagy) épületek hideg- és melegvíz-rendszerei Kórházak Szállodákban/irodaházak Oktatási intézmények szökıkutak légnedvesítı berendezések pezsgıfürdık kerti locsolók talaj

5 Bejelentett legionellosis esetek száma Magyarországon ( ) 120 Esetszám [fı] Egyedi vizsgálati járványügyi lap bevezetése A nyilvántartásban csak pneumoniával járó megbetegedések nem halálos kimenetelő halálos kimenetelő Morbiditás [fı/millió lakos] 1,3 1,2 2,0 2,7 Letalitás [%] 15,4 8,3 30,0 14,8 Forrás:Dr. Horváth Judit Krisztina Országos Epidemiológiai Központ, Járványügyi Osztály

6 CÉLKITŐZÉS: Legionella hazai elterjedésének vizsgálata

7 Legionella kolonizáció hazai hálózati vízrendszerekben objektumok Összes vizsgált objektum: 102 Legionella-val kolonizált: 66 (65 %) objektumok száma [db] 5 0 Szállodák Egészségügyi Int. Oktatási int. Élelmiszereá. üzem Gyógyszergyár Üzem - egyéb Irodaház Magánház Áruház nem kolonizált kolonizált

8 Mintavételi pontok szállodák eü. intézmények oktatási intézmények élelmiszer eá. üzem irodaház üzem - egyéb gyógyszergyár

9 Legionella kolonizáció hazai hálózati vízrendszerekben minták Összes vizsgált minta: 1065 Legionella kimutatható: 466 (44%) CFU/L felett: 267 (25 %) vízminták száma [db] 50 0 Szállodák Egészségügyi Int. Oktatási int. Élelmiszereá. üzem Gyógyszergyár Üzem - egyéb Irodaház Magánház Áruház < > 1000

10 Hımérséklet hatása a Legionella- kolonizációra N=656 N=656 75,2 % 160 Kritikus hımérséklet-tartomány 100% <1000 Vízminták száma [db] % 60% 40% 20% > % < , , , , , , , , , ,9 > 60 Összesen 656 minta Hımérséklet [ C] Minták 75,2 %-a esik a 20-54,9 C-os tartományba Hımérséklet [ C] Szaporodási hımérséklet tart.: C 20 C alatt perzisztál 60 C-on 3 perc alatt pusztul el 70 C felett azonnal elpusztul

11 CÉLKITŐZÉS: Intézkedések a Legionella csíraszám visszaszorítására

12 Védekezési lehetıségek a legionellák ellen Aktív módszerek: csökkentik a baktériumok számát Klóros fertıtlenítés (pl. klór-dioxid) Ózonos fertıtlenítés UV-sugaras fertıtlenítés UV-sugárzás + ultrahang "aacheni-módszer" Mikrobicidek alkalmazása Termikus fertıtlenítés Passzív módszerek: megakadályozzák a baktériumok szaporodását

13 Hıkezelés A gyár egész területén problémát jelent a Legionella jelenléte Kísérleti jelleggel hıfertıtlenítés az egyik 2004-ben épült épületben Vegyszeres kezeléstıl elzárkóznak Választott kezelés: rendszeres hıfertıtlenítés Legionella [CFU/l] pont 2. pont 3. pont 4. pont

14 Egyszeri vegyszeres fertıtlenítés Egészségügyi intézmény használati melegvíz-hálózata a tényleges vízfogyasztáshoz képest jelentısen túlméretezett HMV tartály cseréje az elsı vízvizsgálati eredmények után Fertıtlenítés: A használati melegvízhez nagy koncentrációban klór-dioxid oldatot adagoltak 100 l 0,3%-os klór-dioxid oldat (kb. 600 mg/l végkonc.) 24 órát maradt a rendszerben a fertıtlenítıszer (10 mg/l végkonc.) 49 Csapok kifolyatása 0 mg/l szabad-klór koncentrációig % hidrogén-peroxid és ezüst: kb. 5-10mg/l (2-58 mg/l) - jelenleg folyamatos Legionella csíraszám [CFU/l] fertıtl. elıtt fertıtl. után Hımérséklet [ C] HMV tartály 3. emelet 1. emelet

15 CÉLKITŐZÉS: Legionella-törzsgyőjtemény létrehozása és jellemzése Pozitív vízmintákból 3-3 izolátum Törzsgyőjtemény: 864 Legionella törzs

16 Faj alatti szintő azonosítás szerológiai vizsgálattal N=520 3,5% 17,7% 1,5% 1,3% Denka Seiken Ltd. 9,0% 0,6% 21,3% 2,1% 14,0% 1,3% 27,5% nem aggl. L. pn. 1 L. pn. 2 L. pn. 3 L. pn. 4 L. pn. 5 L. pn. 6 L. pn. 8 L. pn. 9 L. pn. 10 L. pn. 12 Kérdések: Miért kizárólag Legionella pneumophila? 21,3 %-ban L. pn szerocs. (=nem aggl.) további vizsgálatok L. pneumophila 3: 14,0 % L. pneumophila 6: 17,7 % L. pneumophila 1: 27,5 %

17 A L. pneumophila 2-14 szerocsoportú törzsek molekuláris vizsgálatai Genus specifikus PCR minden izolátum pozitív ARDRA Alu I Hinf I rpob PCR-RFLP is probléma a PCR optimalizálásával cél: a törzsek faj alatti szintő azonosítása Szekvencia-analízis csoportosítás REP-PCR-rel (11 csoport) reprezentánsok szekvencia-analízis mip gén 16S rdns-nél variábilisabb régió faji szintő azonosítás 95% hasonlóság felett 6 törzs > 95% hasonlóság Legionella pneumophila 1 csoport 1 faj nagy hasonlóság több Legionella pneumophila szerotípussal is Megoldás: MLST beállítása

18 Ismert szerotípusú L. pneumophila törzsekkel végzett vizsgálatok REP-PCR vizsgálat (ERIC primerekkel) 377 vizsgált izolátum (+ típustörzsek): Egy-egy dendrogram a kül. intézményekbıl izolált törzsek hasonlósági viszonyait ábrázolja Összevetettük a kül. intézményekbıl izolált jellemzı törzsek mintázatait egymással Különbözı mintavételi helyekrıl is lehet hasonló REP-PCR mintázat 1 Összes izolátum: 12 nagyobb REP-PCR csoport REP-PCR-rel kapott csoportosítás összevetése a szerotípusokkal szerotípusok REP-PCR csoportok szerotípusok alatti felbontás REP-PCR csoport több szerotípus eü.* 2.eü. 4.eü. 8.eü. 10.eü.* 11.eü. 12.eü.* 1.sz. 1 FPQuestTM Software (verziószám: 4.5) Dice hasonlósági index, UPGMA távolságszámítás 2.sz. 3.sz. 4.sz. 5.sz.* 7.sz.* 8.sz. szerotipizálás kiváltására közvetlenül nem alkalmas

19 Célkitőzés: Real-time PCR beállítása

20 Feltételezett elıny: Alátámasztás: További elıny: Módszer beállítása: DNS kivonás csak az élı sejtek Pseudomonas aeruginosa-val elölt Legionella Alacsony csíraszámnál is reprodukálhatóan mőködik 1. Legionella-val inokuált steril deszt. víz minta ( CFU/l) 2. Legionella-val + P. aeruginosa-val inokuált steril deszt. víz minta (mátrix: 10 és 10 3 CFU/L) 3. Legionella-val inokuált steril deszt. víz minta ( CFU/l) + összcsíra (10 4 CFU/L) 10,00 9,00 8,00 értékek 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 y = -1,0945x + 9,1293 R 2 = 0,8248 DNS konc. [ug/ml] log 10 Legionella csíraszám [CFU/100ml] Lineáris (DNS konc. [ug/ml]) Lineáris (log 10 Legionella csíraszám [CFU/100ml]) 2,00 1,00 0,00 y = -0,51x + 3,9136 R 2 = 0,9492 A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 minták

21 Real-time PCR 10 2 kópia 16S rdns és mip gén alapú egyidejőleg Alacsony csíraszámnál is Elızetes eredmények: 100 kópia számunkra elégséges érzékenység Eddig csak inokuált vízmintán teszteltük (Legionella pneumophila 1)

22 Célkitőzés: FISH technikán alapuló módszer beállítása

23 Fluorescens in situ hibridizálás (FISH) CÉL: FISH-technika alapú módszer kidolgozása a legionellák megtelepedésének és túlélésének közvetlen vizsgálatára biofilmekben 1. A legionellák megtelepedésének nyomonkövetése tárgylemezen növesztett biofilmben Kérdés: amıbák nélkül képesek-e szaporodni? 2. Legionellák vízmintából történı kimutatására alkalmas FISH technika kidolgozása Terv: A vízmintát membránszőrın szőrjük A filtert néhány órán át elıinkubáljuk Közvetlenül a filteren végezzük a hibridizációt Beállítás alatt eddig beállítva tárgylemezen

24 Célkitőzés: Bevezetett módszerek alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál

25 Járványügyi kivizsgálások A bevezetett vizsgálati módszerek alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál Szerotipizálás (pontos szerotípus meghatározás) Törzsek elızetes vizsgálata: REP-PCR PFGE (pulse field gel electrophoresis) Esetek Nosocomiális eset I. ø humán izolátum Nosocomiális eset II. (két kórház érintett) ø humán izolátum Területen szerzett legionárius megbetegedés ø humán; ø környezeti izolátum Utazással összefüggı legionárius megbetegedés

26 Utazással összefüggı legionárius N=27 megbetegedés kivizsgálása Dice (Opt:1.00%) (Tol 1.0%-2.0%) (H>0.0% S>0.0%) [0.0%-100.0%] Legionella_ Legionella_9812 Vizsgálati módszer: kromoszóma restrikciós enzim emésztést követı PFGE (pulzáltatott mezejő gél elektroforézis). 1251/1/ /2/ /1/ /2/ /2/ /1/ /1/ /1/1. 732/1/ /1/ /1/ /1/ /2/ /2/ /2/ Lpn001 Lpn002

27 Összefoglalás Az összesen vizsgált 102 objektum 65 %-a legionellával kolonizált Az összes vizsgált minta (1 065) 25%-nak Legionella-csíraszáma haladja meg az CFU/l-t A rendszeres hıfertıtlenítés megfelelı védelmet biztosít; a vegyszeres fertıtlenítésnél elengedhetetlen a megfelelı méretezés 864 törzsbıl álló törzsgyőjtemény összeállítása Leggyakoribb szerotípus: L. pneumophila 1, 6, 3 REP-PCR nem alkalmas a szerotipizálás kiváltására, de járványügyi kivizsgálásoknál elıszőrésre kiválóan alkalmazható Beállított módszerek sikeres alkalmazása járványügyi kivizsgálásoknál További feladatok: 1. Real-time PCR alkalmazása valós vízmintákon 2. FISH beállítása (és FISH beállítása biofilm-vizsgálatokra) 3. MALDI-TOF MS eredmények kiértékelése 4. MLST beállítása és alkalmazása a járványügyi szempontból releváns törzseken

28 Cikk referált folyóiratban: Publikációk Zs. Barna, K. Antmann, R. Bánfi., M. Németh., A. Szax, M. Vargha: Role of drinking water system in the transmission of Pseudomonas aeruginosa and Legionella ssp. in an intensive care unit. in: Journal of Water and Health folyamatban Nemzetközi konferencia részvételek: Vargha, M.; Barna, Zs.; Illés, E.; Varga, D.; Kádár, M.: Tracing Legioneallae in a hospital s hot water system by rep-pcr and intact cell MALDI-TOF MS. International Symposium on Microbial Ecology, Bécs, Ausztria, Barna, Zs.; Bognár, Cs.; Horváth, K.; Kalácska, J.; Kádár, M.; Vargha, M.: Prevelance of Legionella types in Hungarian water samples by different typing methods. 22nd Meeting of European Working Group for Legionella Infections. Stockholm, Svédország, Barna, Zs.; Bognár, Cs.; Kádár, M.; Kalácska J.; Szax, A.; Vargha, M.: Current status of environmental Legionella prevalence in Hungary. 23th Meeting of European Working Group for Legionella Infections. Madrid, Spanyolország, Zs. Barna, K. Antmann, J. Pászti, M. Németh, R. Bánfi, M. Vargha Tap water as a potential source of nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections in an intensive care unit, 19th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Helsinki, Finnország, Témavezetés: Szax Anita (ELTE TTK): Legionella környezeti elıfordulásának jellemzése, Budapest, 2009