A HIDROGÉN PEROXID SZEREPE A MIKROEREK TÓNUSÁNAK LOKÁLIS SZABÁLYOZÁSÁBAN (ROLE OF HYDROGEN PEROXIDE IN THE LOCAL REGULATION OF MICROVASCULAR TONE) Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei Dr. Cseko Csongor Semmelweis Egyetem Kórélettani Intézet Témavezeto: Prof. Dr. Koller Ákos Semmelweis Egyetem, Doktori Iskola Budapest, 2005
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ÉS CÉLKITUZÉSEK A kardiovaszkuláris betegségek világszerte a morbiditási és mortalitási statisztikák vezetoi. Sok, a szív - és érrendszert érinto betegség - mint pl. a magasvérnyomás betegség, cukorbetegség, hiperhomociszteinémia, szöveti sérülés, gyulladás és ischémia-reperfúzió - a hidrogén peroxid (H 2O 2) fokozott képzodésével jár. A megnövekedett H 2O 2 szint a vaszkuláris szövetben (endothélium-, simaizomsejt) különbözo jelátvivo mechanizmusokat aktiválhat, amely az erek funkcionális és morfológiai változását eredményezheti. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a H 2O 2 fajtól, értípustól és kísérleti protokolltól függoen a nagyerek kontrakcióját, vagy relaxációját okozza. Ezek az eltéro eredmények abból a ténybol adódhatnak, hogy az említett kísérletekben különbözo ereket, eltéro körülmények és H 2O 2 koncentrációk között vizsgáltak, illetve az erek tónusát különbözo hatásmechanizmusú vazoaktív szerekkel - mint pl. epinefrin, tromboxán analógok, kálium klorid - indukálták, melyek mindegyike a H 2O 2 által aktivált celluláris mechanizmusokkal interferálhat. Emberi koszorúserekben az exogén és endogén képzodött H 2O 2 eltéro mechanizmuson keresztül okozott vasodilat ációt, felvetve annak lehetoségét, hogy a H 2O 2 a hatás helyétol függoen eltéro átmérováltozásokat okozhat. A H 2O 2 vazomotor hatásának ezen aspektusa fontos lehet gyulladás esetén: azaz, amikor a H 2O 2 forrása lehet egyrészt intraluminális az aktivált leukociták hatására, másrészt extraluminális a makrofágok, illetve maguk az erek szövetei révén. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a H 2O 2 a simaizomsejteket hiperpolarizálja és a nagyerek 1
relaxációját, illetve az arteriolák dilatációját nem NO, nem prostaglandin mediálta, endotheliális eredetu hiperpolarizáló faktor (EDHF)-függo módon hozza létre. Egy H 2O 2 mediálta dilatátor mechanizmus fontos szerepet játszhat a szöveti keringés szabályozásában akkor, amikor a NO szintje csökkent, azonban bizonyos esetekben az erek patoló giás elváltozásához is vezethet. Néhány kísérletben az intraluminális nyomás változása és a H 2O 2 koncentrációja között kapcsolatot találták. A H 2O 2 magasvérnyomás betegségben fokozott konstrikciót okoz, melyet a K + -csatornák eltéro aktivációja hozhat létre. A legújabb eredmények szerint a H 2O 2 mediálja az izolált arteriolák nyomás-indukálta miogén konstrikcióját. Ennek megfeleloen a H 2O 2 menövekedett szintje fokozott arterioláris tónushoz, s ezáltal csökkent mikrovaszkuláris perfúzióhoz vezethet. Érdekes módon azt találták, hogy a kataláz emberi pitvari koszorúserekben gátolja az áramlás-indukálta dilatációt, illetve, hogy a nyíróero hatására az endothélsejtek H 2O 2-ot ürítenek az extracelluláris térbe. Mivel a szöveti keringést elsodlegesen az arteriolák határozzák meg a teljes perifériás ellenállás (TPR) nagy részét létrehozva, a H 2O 2 lokális keringésszabályozásban betöltött szerepének tanulmányozása hozzásegíthet bennünket ahhoz, hogy a H 2O 2 fiziológiás és patológiás körülmények - mint pl. atheroszklerózis, diabétesz mellitusz, magasvérnyomás és hiperhomociszteinémia - között játszott szerepét jobban megért sük. Patkányból izolált vázizom arteriolák vizsgálata során ezért a következoket tuztük ki célul: 2
1. megvizsgáljuk az izolált vázizom arteriolákban az exogén (intra-, extraluminális) H 2O 2-indukálta spontán tónusbeli változások hátterében álló celluláris mechanizmusokat, 2. kimutatjuk, hogy az extralumin álisan adott kat aláz hat az intralumin álisan bejuttatott H 2O 2 eloidézte átmérováltozásokra, 3. megvizsgáljuk a kataláz hatását az arteriolák miogén válaszára, 4. megvizsgáljuk a kataláz hatását az arteriolák áramlás-indukálta dilatációjára 3
2. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK Az arteriolák izolációja és a videómikrosz-kópos technika Kísérleteinket hím Wistar patkányok (250-350 g) izolált gracilis vázizom arterioláin (aktív belso átméro: 140±4?m, passzív belso átméro 230±4?m, 80 Hgmm-es intraluminális nyomáson) végeztük. Az arteriolák belso átmérojét videómikroszkóphoz kapcsolt mikroangiométerrel mértük, s a változásokat papír kiíron, illetve Powerlab analóg-digitális konverter segítségével számítógépen rögzítettük. Extraluminálisan adott H 2O 2 hatása az átmérore A H 2O 2 növekvo koncentráció it (10-6 -2x10-4 M) juttattuk a szervfürdoben lévo fiziológiás sóoldatba. A H 2O 2 minden dózisa után fiziológiás sóoldattal mostuk ki a szervfürdot és a következo dózist csak azt követoen adtuk, hogy a nyugalmi, kontroll átméro újra kialakult. Kísérleteink következo csoportjában az arteriolákat különbözo intracelluláris gátlószerekkel - mint pl. indomethacin, SQ 29,548, L- NAME, clotrimazole, vagy sulfaphenazole - inkubáltuk és újra megvizsgáltuk a H 2O 2-indukálta válaszokat. A H 2O 2 átmérore való hatásait endothélium hiányában is megfigyeltük, amit az arteriola levegovel történo, ~ 1 percig tartó, alacsony nyomású perfundálásával távolítottunk el. Ezt követoen endothélium hiányában az arteriolákat különbözo káliumcsatorna gátlókkal - mint pl. charybdotoxin plusz apamin, glybenclamide, vagy tetrabutyl-ammonium (TBA) inkubáltuk, majd újra megvizsgáltuk a H 2O 2-indukálta válaszokat. Intraluminálisan adott H 2O 2 hatása az átmérore A H 2O 2 intraluminális bejuttatása végett konstant intraluminális 4
nyomáson (80 Hgmm), a nyomás állandóan tartása érdekében a ki- és bemeno kanülök azonos mértéku, de ellentétes irányú változtatásával intraluminális áramlást hoztunk létre. A H 2O 2 növekvo koncentrációit (10-6 -10-4 M) juttattuk be intraluminálisan, majd minden dózist követoen fiziológiás sóoldattal mostuk át a lument és a következo dózist csak azt követoen adtuk, hogy a nyugalmi, kontroll átméro újra kialakult. Extraluminális kataláz hatása az intraluminálisan adott H 2O 2- indukálta átmérováltozásokra Az extraluminálisan adott kataláz intra- és intercelluláris térben való hatékonyságának kontrollálása végett a kataláz különbözo dózisait és típusait használtuk. A kataláz ezen típusainak extraluminális adását követoen újra megvizsgáltuk az intraluminálisan bejuttatott H 2O 2 patkány vázizom arteriolán indukált válaszait. A kataláz hatása a nyomás-indukálta átmérováltozásokra Áramlás hiányában megvizsgáltuk az arteriolák intraluminális nyomás-változás hatására kialakuló válaszait. A kataláz különbözo típusainak és dózisainak jelenlétében újra detektáltuk a nyomás-indukálta arterioláris válaszokat. A nyomás-indukálta passzív átméro (PD) görbe regisztrálásának érdekében az arteriolákat Ca 2+ -mentes, 10 5 M nifedipint és 10 4 M nátrium nitroprusszidot (SNP) tartalmazó fiziológiás sóoldatban inkubáltuk. A kataláz hatása az áramlás/fali nyíróero (WSS) - indukálta átmérováltozásokra Az intraluminális áramlást a fent leírt módon hoztuk létre (ld: a H 2O 2 intraluminális adása). A kataláz különbözo típusainak és dózisainak jelenlétében az áramlás-indukálta válaszokat újra rögzítettük. 5
3. EREDMÉNYEK Az extraluminálisan adott H 2O 2 okozta bifázisos átmérováltozások Az extraluminálisan adott H 2O 2 növekvo koncentrációi a gracilis arteriolák bifázisos átmérováltozását okozták. A H 2O 2 alacsonyabb koncentrációi (10-6 M 3x10-5 M) csak konstrikciót, míg a magasabbak (6x10-5 M 2x10-4 M) a kezdeti konstrikciót követoen jelentos dilatációt okoztak. A H 2O 2 alacsonyabb koncentrációi növelik az arteriolák tónusát: Az endothélium eltávolítása szignifikánsan csökkentette a H 2O 2 hatására kialakuló konstrikciót, míg az endothélium-intakt arteriolák indomethacinnal, vagy SQ29548-cal történo inkubálása teljesen meggátolta a H 2O 2-indukálta konstrikciót. A H 2O 2 magasabb koncentrációi csökkentik az arteriolák tónusát: Az indomethacin, vagy az SQ29548 jelenlétében a H 2O 2 nagyobb koncentrációi csak dilatációt okoztak. Endothélium-intakt arteriolákban sem a clotrimazole, sem a sulfaphenazole nem volt hatással a H 2O 2- indukálta dilatációra, míg az L-NAME szignifikásan csökkentette azt. Az endothélium eltávolítása szignifikánsan csökkentette a H 2O 2-indukálta arterioláris dilatációt. Az endothélium -fosztott arteriolákban a clotrimazole nem volt hatással a H 2O 2-indukálta válaszokra. A charybdotoxin és apamin szimultán adása, melyek a K Ca-csatorna inhibitorai, szignifikánsan csökkentették a H 2O 2 okozta dilatációt. A K ATP-csatorna gátló glibenclamide adása is szignifikánsan csökkentette a H 2O 2-indukálta dilatációt, míg a TBA jelenléte csökkentette az alaptónust és szignifikánsan, jelentos mértékben gátolta a H 2O 2-indukálta dilatációt. 6
Az intraluminálisan adott H 2O 2 okozta bifázisos átmérováltozások Az áramlás növekedése dilatációt okozott. Ezt követoen, amikor a perfuzátumban oldott H 2O 2 elérte az intraluminális teret, bifázisos átmérováltozást okozott. A H 2O 2 alacsonyabb koncentrációi (10-6 M 10-5 M) csak konstrikciót okoztak, míg a H 2O 2 nagyobb koncentrációi (10-4 M), a kezdeti konstrikciót követoen az arteriolák dilatációját eredményezték. A kataláz hatása a gracilis arteriolák myogén válaszára Kontroll körülmények között az intraluminális nyomás emelése az arteriolák konstrikcióját okozták. A különbözo típusú és dózisú katalázok extraluminális adása (500 U/ml por, 1500 U/ml oldat, 250 U/ml PEGkataláz) egyaránt meggátolta az intraluminálisan adott H 2O 2 kiváltotta konstrikciót és dilatációt. A katalázok jelenlétében sem a miogén konstrikció, sem a miogén index görbe meredeksége nem változott. A kataláz hatása a gracilis arteriolák áramlás-indukálta válaszára Kontroll arteriolákban az áramlás növekedése dilatációt okozott. A katalázok különbözo típusainak és dózisainak jelenléte (ld. fent: miogén válasz) nem okozott változást sem az áramlás-átméro görbében, sem az áramlás-, vagy a nyíróero-indukálta átmérováltozás görbe meredekségében. 7
4. MEGBESZÉLÉS Kísérleteink igazolták eloször, hogy 1. a H 2O 2 koncentráció függoen és bifázisos módon modulálja az izolált vázizom arteriolák spontán tónusát. Az arteriolák tónusa növekszik a H 2O 2 alacsonyabb koncentrációinak (10-6 M - 3x10-5 M) hatására, elsodlegesen az endotheliális és simaizom eredetu PGH 2/TxA 2 felszabadulásának következtében, míg csökken a H 2O 2 magasabb koncentrációi hatására (6x10-5 M - 2x10-4 M), az endotheliális NO és a simaizom különbözo K + -csatornáinak, mint pl. a K ATP- és K Ca-csatornák hatására, 2. az extraluminálisan adott kataláz gátolja az intraluminálisan bejuttatott H 2O 2 okozta átmérováltozásokat az izolált vázizom arteriolákban, 3. az intraluminális nyomás-növekedés kiváltotta miogén választ nem befolyásolja a kataláz, 4. az intraluminális áramlás-növekedés eloidézte dilatációt nem befolyásolja a kataláz. 1. A jelen kísérletek eredményei szerint a H 2O 2 mindössze mikromoláris koncentrációi PGH 2/TxA 2-t szabadítanak fel az arteriolákból, mely a H 2O 2 potenciálisan fontos élettani szerepét feltételezi a vázizom lokális véráramlásának szabályozásában. Eredményeink mások megfigyeléseivel összhangban állnak, ugyanis mások azt találták, hogy a H 2O 2 egér farok arteriában miogén konstrikció kifejlodéséhez vezet. Azt is kimutatták, hogy egyszeri hirtelen nyomásnövekedés, vagy krónikus magasvérnyomás megnöveli a H 2O 2 8
termelést, amely fokozza a PGH 2/TxA 2 képzodését a spontán tónus növekedéséhez vezetve. Az még nem teljesen világos, hogyan stimulálja a H 2O 2 az endothélium fokozott konstriktor prosztaglandin szintézisét. Kimutatták, hogy a H 2O 2 gyorsan aktiválja a ciklooxigenáz enzimet, mely különbözo prosztaglandinok, köztük a TxA 2 szintézisét eredményezi. Érdekes, hogy a kezdeti konstrikciót követoen a H 2O 2 a vázizom arteriolák maximális átmérojét megközelíto, dózisfüggo dilatációt okoz. Azt találtuk, hogy a H 2O 2 egy eddig ismeretlen mechanizmuson keresztül aktiválja az endotheliális NO szintázt, amely a vázizom arteriolák NOmediálta dilatáció ját idézi elo. Ezen eredményeink korábbi, aorta és bazális arteriola gyurubol származó megfigyeléseket támasztanak alá, ahol a H 2O 2- indukálta dilatációt részben az NO mediálta. A dilatáció másik részét a simaizomsejtek hiperpolarizációja okozta. Azt találták, hogy patkány aortában a H 2O 2 relaxációt okozó hatását a CYP450 enzim aktivációja mediálja. Ezzel ellentétben, vizsgálatainkban azt figyeltük meg, hogy akár endothélium jelenlétében, akár hiányában a CYP450 enzim clotrimazolelal, vagy sulfaphenazole-lal történo gátlása nem volt hatással a H 2O 2- indukálta dilatációra, mutatva, hogy a H 2O 2 nem a CYP450 aktiválásán keresztül hiperpolarizálja a vázizom arteriolák simaizmát. Eredményeink azt mutatják, hogy a H 2O 2 a K Ca és a K ATP-csatornákat, valamint egyéb típusú K + -csatornákat aktivál. Mások azt találták, hogy konduit típusú artériákban a nagy vezetoképességu Ca 2+ -aktiválta K + -csatornákat a H 2O 2 közvetlenül stimulálja. Összefoglalva, a H 2O 2-indukálta konstrikciót az endotheliális PGH 2/TxA 2 mediálja, míg a dilatációt elsodlegesen az endotheliális NO szintáz, valamint a vaszkuláris simaizom sejtek különbözo K + -csatornáinak 9
aktivációja okozza. Érdekes módon különbséget találtunk az extra- és intralumin álisan adott H 2O 2 hatása között. Az intralumin álisan bejuttatott H 2O 2 hasonló mértéku konstrikciót okozott, de kisebb dilatációt váltott ki, mint az extraluminálisan adott H 2O 2. A H 2O 2 eredetének helyétol függoen a vázizom arteriolák spontán tónusára különbözo hatással van, melyet eltéro mechanizmussal vált ki. A H 2O 2 vazomotor hatásának ezen aspektusa gyulladás esetén lehet fontos, amikor a H 2O 2 eredete lehet intraluminális az aktivált leukocitáknak köszönhetoen, vagy éppen extraluminális a makrofágoknak, a migrált leukocitáknak, parenchyma sejteknek, vagy magának a vaszkuláris szövetnek köszönhetoen. 2. A kataláz különbözo dózisainak és típusainak extraluminális adása meggátolta az intraluminálisan bejuttatott H 2O 2 által eloidézett konstrikciót és dilatációt egyaránt. Ez azt mutatja, hogy a kataláz hatékonyan képes lebontani akár az endothéliumban, akár a simaizomban képzodött H 2O 2-ot. Az egy érdekes kérdés, hogy a kataláz, fehérje molekula révén, hogyan éri el az endothél és a simaizom sejteket. Korábbi kísérletekben katalázt juttattak a kutyaszív bal pitvarába a 15 perces ischémiát közvetlenül megelozoen, valamint idotartama alatt is. 30 perc reperfúziót követoen az exogén katalázt kis vezikulákban lehetett megtalálni a kapilláris endothéliumban, az endothélium és simaizom közti térben, valamint a simaizomban elektronmikroszkópot használva. 3. Kontroll körülmények között az intraluminális nyomás emelése az arteriolák konstrikcióját okozta. A kataláz különbözo típusainak jelenlétében a miogén konstrikció meredeksége és a miogén index görbe nem változott. Eredményeink a Flavahan munka-csoportéval ellentétesek, 10
ugyanis ok azt találták, hogy az intraluminális nyomás egy lépcsoben 10- rol 90 Hgmm-re történo emelése NADPH oxidáz-függo H 2O 2 képzodést okoz az egér farok arteriolájának simaizmában. Ez az ellentét a eltéro érterület és kísérleti körülmény miatt lehet. 4. Kontroll arteriolákban az áramlás növekedése dilatációt okozott. A kataláz különbözo típusainak jelenlétében nem volt különbség az áramlásátméro és az áramlás-, vagy nyíróero-indukálta átmérováltozás görbék meredekségében. Eredményeink Gutterman munkacsoportjáéval ellentétesek, ugyanis ok azt találták, hogy az endothélium-eredetu H 2O 2 az izolált, emberi koszorúserek áramlás-indukálta dilatációjához vezet. Kimutatták, hogy a H 2O 2 okozta dilatáció a vaszkuláris simaizom membránjának K Ca-csatorna függo hiperpolarizációjához kapcsolódik, azt mutatva, hogy H 2O 2 EDHF-ként hat az emberi koszorúserekben, mely dilatátor mechanizmus fontos szerepet játszik a miokardiális perfúzió fenntartásában, amikor az NO szintje csökkent. A mi és Gutterman munkacsoportjának eredményei közt lévo különbség az arteriolák különbözo eredete miatt lehet, ugyanis Gutterman munkacsoportja szívbeteg emberekbol származó ereket használt, míg mi egészséges patkányokból valót. A H 2O 2 beteg koronária arteriola áramlás-indukálta dilatációjában való részvétele kompenzációs mechanizmus lehet abban az esetben, amikor az NO mediáció hiányzik. 11
Eredményeink élettani és kórélettani jelentosége Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy az extraluminálisan adott H 2O 2 eltéro vazomotor válaszokat okoz. A jelen tanulmány új eredményei szerint a H 2O 2 mind konstrikciót, mind dilatációt eloidéz, amely a H 2O 2 koncentráció-függo mediátor szerepét veti fel. Jelenleg nehéz meghatározni, hogy pontosan mekkora a vaszkuláris és egyéb sejtek által termelt H 2O 2 koncentrációja a különbözo élettani és kórélettani körülmények között. Hasonlóan nehéz meghatározni az érfalban lévo katalázok jelenléte miatt, hogy pontosan mekkora koncentrációban éri el a sejtek intracelluláris alkotórészeit az exogén adott H 2O 2. Érdekes módon azt találták, hogy 2x10 6 /ml polymorphonukleáris leukocita phorbol-12- myristate-13-acetate-tal (PMA) történo stimulációja 0,3 mm-t eléro koncentrációban képes H 2O 2-ot termelni in vitro kürülmények között. Megjegyzendo azonban, hogy az intracelluláris peroxidázok in vivo körülmények közötti eroteljes aktivitása miatt a sejtek alkotórészeiben lévo H 2O 2 koncentráció a mikromoláris, illetve az alacsony millimoláris koncentráció -tartományban lehet. Tehát a körülményektol függoen valószínuleg a sejtek különbözo H 2O 2 koncentrációknak vannak kitéve, amely ennek megfeleloen növelheti, vagy éppen csökkentheti az arteriolák spontán tónusát, s így a véráramlást. Valószínu például, hogy a H 2O 2 az arteriolák átmérojének megnöveléséhez elegendo koncentrációban szabadul fel akkor, amikor a szövetek oxidatív metabolizmusa fokozódik, s ezáltal megnöveli a lokális vázizomarteriola véráramlását a megnövekedett oxigén igényeknek megfele-loen. Másrészrol bizonyos patólógiás körülmények között, amelyek oxidatív 12
stresszel és gyulladással társulnak - mint pl. a magasvérnyomás betegség, hiperhomocisztei-némia és cukorbetegség - a H 2O 2 alacsonyabb koncentráció ja a spontán tónus megnöveke-déséhez vezethet, mely gyakran megfigyelheto ezekben a betegségekben. 13
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények 1. Cseko C, Bagi Z, Koller A. Biphasic effect of hydrogen peroxide on skeletal muscle arteriolar tone via activation of endothelial and smooth muscle signaling pathways. J Appl Physiol. Sep;97(3):1130-7, 2004 (IF: 3.027) 2. Bagi Zs., Cseko Cs., Toth E., Koller A. Oxidative stress-induced dysregulation of arteriolar wall shear stress in hyperhomocysteinemia is prevented by chronic vitamin -C treatment. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 285:H2277-H2283, 2003 (IF: 3.658) Egyéb közlemények 3. Iking-Konert C, Cseko C, Wagner C, Stegmaier S, Andrassy K, Hansch GM. Transdifferentiation of polymorphonuclear neutrophils: acquisition of CD83 and other functional characteristics of dendritic cells. J Mol Med Aug;79(8):464-74, 2001 (IF: 4.101) 4. Nemeth K, Furesz J, Adorjani E, Cseko C, Bielik H, Lakatos S. fmlp-induced respiratory burst and the intracellular Ca2+ signal are not interrelated in neutrophils. Haematologia 31(2):111-23, 2001 (IF: 0.4) 5. Nemeth K, Furesz J, Adorjani E, Cseko C, Bielik H, Lakatos S. Azurophil granules are heterogeneous with respect to mobilization induced by different concentrations of fmlp. Haematologia 31(3):181-9, 2001 (IF: 0.4) Referált tudományos folyóiratban megjelent közlemények összesített impakt faktora: 11,586 14