Fagyasztás, felolvasztás, preparálás hatása a humán DNS fragmentáltságára Nagy Melinda MART VII. kongresszusa Sümeg, 215.5.8-9
Bevezetés Intézetünk egyik feladata a férfi infertilitás alapos kivizsgálása, a lehető legpontosabb diagnózis felállítása és az esetleges probléma kezelése. A pontos diagnózis segít az orvosoknak, az ART centrumoknak a leghatékonyabb terápia és a megfelelő megtermékenyítési technika kiválasztásában. A spermium genetikai állományának épsége elengedhetetlen a megfelelő termékenyítéshez és a korai magzati fejlődéshez. Azok a spermiumok, amelyek nagy százalékban tartalmaznak fragmentált DNS-t, alkalmatlanok életképes utód létrehozására. Irodalmi adatok szerint a humán ondóminták fagyasztása és fagyasztva tárolása növeli a spermiumok DNS állományának fragmentáltságát, és ezzel párhuzamosan csökkenti azok termékenyítő képességét.
Részletesebb spermium vizsgálat indokolt Ismeretlen eredetű meddőség Jó spermakép / de elmarad a gyermekáldás Több sikertelen lombik próbálkozás Elégtelen embriófejlődés Habituális vetélés Intézetünkben olyan páciensek DNS fragmentáltságát vizsgáltuk, ahol évek óta nem jött létre terhesség, vagy pedig vetéléssel végződött próbálkozások voltak. Közel másfél éve kezdtük el a férfi oldal alaposabb kivizsgálását.
Vizsgálataink menete és alkalmazott eljárások 1. ejakultáum analízise WHO 5. előírásának megfelelően. 2. A rutin labordiagnosztikai vizsgálatok után visszamaradt natív minták DNS fragmentáltságát vizsgáltuk áramlási citometriára épülő Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA) módszerrel. 3. A fagyasztást SpermCryo All-round (Gynotec) előírt protokoll szerint végeztük és a mintákat a vizsgálatok elvégzéséig folyékony nitrogénben tároltuk. A fagyasztott mintákat a mérés napján 37 o C-os vízfürdőben felolvasztottuk. 4. A felolvasztott minták preparálását szintén adott protokoll alapján végeztük el (SpermFilter,SpermWash Gynotec). /gradiens centrifugálás, majd mosás/ 5. A DNS fragmentáltságot a fagyasztás előtt, a felolvasztás után és a felolvasztást követő mintapreparálás után határoztuk meg.
Acridin Orange emisszió 5 526 nm-en (dsdns) DNS fragmentációs vizsgálat (SCSA módszer) Enyhe savas kezelés denaturálja a DNS-t a törések mentén Acridin Orange festék képes kötődni a szimpla szálú illetve a dupla szálú DNS lánchoz, de az emissziós hullámhosszuk más DFI = 12 % Eltérő emissziós maximum a kötődés függvényében Mintánként 1. db spermium DNS fragmentáltságát mérjük meg DFI = 27 % Acridin Orange emisszió 46 65 nm-en (ssdns)
Eddig diagnosztikai céllal mért összes ondó minta DNS fragmentációjának gyakoriság megoszlása Darabszám 25 2 15 Kvartilis 1 Medián Átlag Kvartilis 3 Átlag: 15,3 Medián (Kvartilis 2): 13, Kvartilis 1: 8,6 Kvartilis 3: 2,5 1 5 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 26 28 3 32 34 36 38 4 42 44 46 48 DNS Fragmentációs index (%) n=174 db Átlag: számtani közép Medián: mértani közép
DNS Fragmentáltsági Index Vizsgálat eredménye 1. 5 45 6 Összes minta esetében 4 5 35 3 Y Data 4 3 2 25 1 2 15 1 preparált Átlag: 17,5 2,4 1,2 Medián: 15,5 17,1 7,8 5 preparált n= 3
6 minta DFI>15,3 Vizsgálat eredménye 2. 6 Összes minta esetében DNS Fragmentáltsági Index 5 4 3 2 1 Y Data 5 4 3 2 1 minta DFI <15,3 Átlag: 24,5 24,7 12,1 Medián: 22,2 22,8 8,3 35 3 Átlag: 17,5 2,4 1,2 Medián: 15,5 17,1 7,8 DNS Fragmentációs Index 25 2 15 1 5 preparált preparált preparált n= 3 Átlag: 8,9 14,5 8,3 Medián: 9,2 12,3 6,9
A friss miták átlag fragentáltsága Eltolódás a fragmentáltabb tartományba Eltolódás a kevésbé fragmentáltabb tartományba
Vizsgálat eredménye 3. Átlag: 17,5 Medián: 15,5 Átlag: 2,4 Medián: 17,1 preparált Átlag: 1,2 Medián: 7,8 n= 3
Darabszám Vizsgálat eredménye 3. preparált Átlag: 1,2 Medián: 7,8 7 6 5 4 3 2 1 6 fagyasztott-preparált Átlag: 2,4 Medián: 17,1 Átlag: 17,5 Medián: 15,5 12 18 24 fagyasztott 3 36 42 friss n= 3 DNS Fragmentációs Index 48 friss fagyasztott fagyasztott-preparált
35 minta DFI <15,3 Tapasztalataink Alacsony DNS fragmentációval rendelkező minták esetében DNS Fragmentációs Index 3 25 2 15 1 5 preparált Átlag: 8,9 14,5 8,3 Medián: 9,2 12,3 6,9 Fagyasztás során nő a spermiumok DNS fragmentációjának mértéke. Fagyasztás-felolvasztáspreparálás után a friss mintához hasonló fragmentációs értékeket mutatnak a minták. A ivarsejt donorjainkat vizsgálva szintén ebbe a tartományba tartoznak mintáink.
6 minta DFI>15,3 Tapasztalataink Magas DNS fragmentációval rendelkező minták esetében DNS Fragmentáltsági Index 5 4 3 2 1 preparált Átlag: 24,5 24,7 12,1 Medián: 22,2 22,8 8,3 Fagyasztás során nő a spermiumok DNS fragmentációjának mértéke. Fagyasztás-felolvasztás-preparálás után a friss mintához képest jelentős javulást (5-65%) mutatnak a minták. Eredményeink alapján a fragmentáltabb DNS-sel rendelkező mintákat termékenyítés előtt a sikeresebb beavatkozás érdekében hasznos lehet fagyasztani.
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!