Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A BIOTECHNOLÓGIA ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN 4. előadás PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK
A BIOTECHNOLÓGIA MÓDSZEREK ALKALMAZÁSA A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN I. TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A betegségek molekuláris hátterének összehasonlítása egészségesen működő szövetekkel Adatbázisok kutatása A működési hibák molekuláris hátterének azonosítása klinikai minták összehasonlításával A működési hibák in vitro analízise és reprodukálása a molekuláris háttér és interakciók megértése céljából A hibásan működő molekuláris folyamatok befolyásolása in vitro kémiai és biológiai molekulák felhasználásával
A BIOTECHNOLÓGIA MÓDSZEREK ALKALMAZÁSA A GYÓGYSZERKUTATÁSBAN II. TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 In vivo reprodukálása a betegség folyamatoknak kísérleti állatokban és tervezett terápiákra adott válaszképesség tesztelése In vitro reprodukálása a betegség folyamatoknak emberi szövetekben
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 ADATBÁNYÁSZAT Meglévő adatbázisokból információ lekérdezése, az OMICS adatbázisok alapján következtetések leszűrése
A KUTATÁSBAN HASZNÁLT LEGGYAKORIBB MOLEKULÁRIS MÓDSZEREK I. TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 DNS és fehérje szekvenálás mrns és mirns expressziós mintázatok vizsgálata mikroarray és qrt-pcr (kvantitatív polimeráz láncreakció) technikákkal Normál funkciójú és mutáns gének klónozása Indukált mutagenezis Változások összehasonlító elemzése: Southern (DNS), Northern (RNS) és Western blot (fehérje) technikákkal
A KUTATÁSBAN HASZNÁLT LEGGYAKORIBB MOLEKULÁRIS MÓDSZEREK II. TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 In vitro sejtkultúrák, sejtvonalak, primer sejtek 3 dimenziós komplex szöveti kultúrák A sejtek felszínén és sejtekben található fehérjék vizsgálatához használt módszerek: hisztológia, immuncitokémia, áramlási citometria, sejt szorter In vivo rendszerek: knock-out és knock-in transzgén egerek
HOGYAN HATÁROZZUK MEG A TERÁPIÁS CÉLPONTOKAT?
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 MIKRODISSZEKCIÓS TECHNIKÁK Vékony szerv metszet, amely a tumor egy részét is tartalmazza Lézersugárral körülvágható az érdekelt terület Tumor Üveg mikroszkóp tárgylemez A második lézersugár kibillenti a kivágott szövetdarabot egy tartályba
MIKROARRAY GÉNEXPRESSZIÓS KÜLÖNBSÉGEK AZONOSÍTÁSÁRA TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 RNS-ből cnds készítése reverz transzkripcióval cdns-k fluorescens festékkel történő megjelölése Mikroarrayhez hibridizálás Kontroll Kísérleti Lézer gerjesztés (excitáció) Lézer kibocsátás (emisszió) + =
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A KROMATIN IMMUNPRECIPITÁCIÓJA Az ellenanyag felismeri és kapcsolódik a specifikus transzkripciós faktorhoz Immunoprecipitáció ellenanyaggal Kromatin-ellenanyag komplex összegyűjtése Sejtek formaldehides kezelése, majd szonikálása, hogy kromatin darabok keletkezzenek Reverz keresztkötés DNS tisztítása Kromatin fragmentumok amelyekhez a transzkripciós faktorok kötődnek DNS fragmentum, amely tartalmazza a specifikus transzkripciós faktor kötőhelyet
PROTEOMIKAI VIZSGÁLAT PROTEIN ÖSSZETÉTELBEN LÉVŐ KÜLÖNBSÉGEK KIMUTATÁSÁRA TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 (A) Minta frakcionálás (B) Proteázos emésztés Protein szeparálás Trypszin Protein Peptidek (C) Ionizáció és mérés Tömeg spektrométer
FEHÉRJÉK POSZT-TRANSZLÁCIÓS MÓDOSULATIANAK VIZSGÁLATA TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Foszforiláció Glikoziláció Lipid kötött fehérjék Acetiláció Metiláció Ubiquitináció
A MEGHATÁROZOTT KÜLÖNBSÉGEK VISSZAELLENŐRZÉSE
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 SOUTHERN (DNS) BLOT DNS Hasítás restrikciós enzimekkel Gél elektroforézis Nitrocellulóz membrán Autoradiogram Filter papír Alkalikus oldat Nitrocellulóz Gél Jelzett DNS próbával hibridizáltatva Kapilláris hatás a DNS-t a gélből a nitrocellulóz membránra transzferálja
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 NORTHERN (RNS) BLOT Sejtek, szövetek RNS kivonása RNS Agaróz gél elektroforézis Marker RNA bands Minta RNS csíkok Filter papír Blottolás Nitrocellulóz Gél Hibridizáció és autoradiográfia Jelzett DNS próba az RNS transzkripthez hibridizál
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 WESTERN (FEHÉRJE) BLOT Elektromos áram (A) Elektroforézis/transzfer Az antigént felismerő Elsődleges ellenanyaggal Ab 1 ( ) inkubáljuk, majd lemossuk a feleslegben lévő Ab 1 t (B) Ellenanyag (Ab) detektálás SDS-PAGE Membrán (C) Kromogén detektálása Enzimmel kapcsolt másodlagos Ab 2 ( ) ellenanyaggal inkubáljuk, majd a feleslegben lévő AB 2 -t lemossuk és aktiváljuk a színreakciót Szubsztrát hozzáadása
A MEGHATÁROZOTT CÉLMOLEKULÁK FELSZAPORÍTÁSA, EXPRESSZIÓJUK MÓDOSÍTÁSA
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A KLÓNOZÁS ÖSSZEFOGLALÓ LÉPESEI Plazmid DNS Beillesztett DNS A plazmid a baktériumban felszaporodik A plazmid DNS szekvencia Felnyitása endonukleázzal A DNS szekvencia beillesztése, ligálása Baktérium transzformálás Baktérium kolóniák Számos DNS kópia
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 CÉLZOTT MUTAGENEZIS (A) DNS lánc szintézise Mismatch Mismatch Egy-láncú DNS A mismatched Oligonukleotid hozzákötése Lánc szintézis Kettős-láncú DNS (B) Mutáns fágok azonosítása Blot, próba Fertőzött E. coli Bakteriofágok kiszélesztése, hogy plaque-k keletkezzenek Hibridizáció szignál mutáns fág plaque
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 RNS INTERFERENCIA 3 5 5 Kettős-láncú RNS 3 Dicer nukleáz elvágja a kettős-láncú RNS-t Rövid-interferáló RNS (sirns) Szimpla-láncú sirns-k az mrns-hez kapcsolódnak 5 3 mrns RDE-I degradálódás
A FELTÉTELEZETT FOLYAMATOK IN VITRO ÉS IN VIVO TESZTELÉSE
KETTŐS-LÁNCÚ RNS EMBERI SEJTBE JUTTATÁSA LIPOSZÓMA SEGÍTSÉGÉVEL TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Fúzió Kettős-láncú RNS-t tartalmazó liposzóma RNS a sejten belül
FLUORESZCENSEN AKTIVÁLT ÁRAMLÁSI CITOMETRIA ÉS SEJT SZORTOLÁS (FACS) TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Fluoreszcens festékkel jelzett sejtek a mintában Rezgő sejt áramlás Minta Sheath folyadék Vörös fluoreszcencia Sugár elosztó Zöld fluoreszcencia Lézer 90 0 Oldal irányú fényszórás (Side light Scatter) (granularity) Előre irányuló fényszórás (Forward light Scatter) (méret) Töltött köpeny Eltérítő köpeny Gyűjtőedények Hulladék
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 KLÓNOZOTT GÉN FUNKCIONÁLIS ANALÍZISE Nagyon aktív, más-specifikus promoter cdns A klónozó vektor számos példányban Egérbe klónozás Fenotípus vizsgálat Máj sejtek Proteinek a véráramba szekretálva
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 GÉN SPECIFIKUS KNOCK-OUT EGEREK Genetikailag módosított embrionális őssejtek injektálása a blasztocoel üregébe Embriók álterhes egerekbe történő beültetése Homozigóta fehér Kimérák Kiméra és homozigóta Egerek pároztatása Fekete progeny kifejlődik a germ-line sejtekből, amelyek heterozigóta ES sejtekből származnak
TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 TRANSZGÉN EGEREK Pro-nukleuszba Az idegen DNS beinjektálása az egyik pro-nukleuszba Megtermékenyített egér petesejt a hím és nőstény pro-nukleuszok fúziója előtt A megtermékenyített petesejt transzferálása a Foster anyába A születendő utódok 10-30%-a tartalmazza az idegen DNS-t. Az idegen DNS egyenlő arányban oszlik meg minden szövetben Az idegen DNS-t tartalmazó egereket továbbtenyésztik
AZ EREDMÉNYEK FELHASZNÁLÁSA A GYÓGYSZERTERVEZÉSBEN
AZ EREDMÉNYEK FELHASZNÁLÁSA A GYÓGYSZERTERVEZÉSBEN I. TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 A kísérletek és adatbázis analízis alapján a módosítandó folyamat azonosításra kerül A mechanizmus megismerése következtetni enged arra, hogy hol lehet a leghatékonyabban interferálni a sejtben/szövetben zajló folyamatokkal Lehet-e biológiai inhibítorok és aktivátorok felhasználásával funkció módosító hatást elérni Amennyiben igen, úgy azok mérete miatt bejuthate a sejtbe?
AZ EREDMÉNYEK FELHASZNÁLÁSA A GYÓGYSZERTERVEZÉSBEN II. TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Be kell-e jutnia a sejtbe egyáltalán avagy a sejtek közötti interakció módosítása elegendő a hatás kiváltásához? Ha csökkenteni kell a biomolekula méretét, akkor hogyan tartható meg a funkció a méretcsökkentés mellett? Mely módon juttatható el a célszövetbe a biomolekula a degradáció nélkül?
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET JELEN MUNKA AZ EURÓPAI UNIÓ TÁMOGATÁSÁVAL, AZ EURÓPAI SZOCIÁLIS ALAP TÁRSFINANSZÍROZÁSÁVAL VALÓSUL MEG, AZ ÉLETTUDOMÁNYI-KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE CÍMŰ, TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZONOSÍTÓSZÁMÚ PROJEKT KERETÉBEN.