Genom editálás: Zn-finger nukleázok, Talen, CRISPR- Cas9 rendszerek. Hiripi László Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont

Átírás

1 Genom editálás: Zn-finger nukleázok, Talen, CRISPR- Cas9 rendszerek Hiripi László Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutatóközpont

2 Miért van szükség új technológiákra? A célzott transzgenezis nagyon fontos. (knock-out, knock-in, allélcsere) Őssejtes transzgenezis Csak egérben működik (patkány, ember) Bonyolult Drága Gyenge hatékonyság Klónozás Sok fajban működik Bonyolult Drága Bizonyos szempontból gyenge hatékonyság Rengeteg mellékhatás

3 A nukleáz technológia a megoldás. Első képviselői a cink finger nukleázok. A cink finger fehérjék kis strukturális fehérjemotívumok, a stabil szerkezethez cink ion(ok) kellenek Szerepük DNS,RNS, fehérjekötésbeninterakciós félként Cink finger fehérjedomén

4 A rendszer másik fele a FokI restrikciós enzimből származik DNS felismerő domén Nem specifikus hasító domén

5 Cink finger nukleázok Mesterséges fehérjerendszer, DNS specifikus hasítására. DNS kötő cink finger domének összekötése FOKI restrikciós doménnel Egér Zif268 transzkripciós faktorból származik a legtöbb cink finger domén Egy cink finger 3 bázist ismer fel Az összes lehetőséghez min 64 féle cink finger kell Dimerként működik Nagyon specifikussá tehető

6 Hogyan működik? Duplaszálú DNS törésrepair Frameshift mutáció, korai STOP így nincs megfelelő fehérje

7 A repairt követő lehetséges mutációk 1. Kicsi deléció 1-20 bp heterozigóta 2. Nagyobb deléció 20 bp- heterozigóta 3. Kisebb inszerció heterozigóta bármilyen kombinációja heterozigóta 5. Mozaikos események 6. Homozigóta események (ugyanolyan és eltérő események is!)

8 Felhasználási terület: Génkiütés Korai génkiütések sejtekben DNS vagy RNS formában vihető be. Sejtekbe egyszerűbb a DNS, embriókba célszerűbb az RNS forma A legtöbb sejtben működik. Ha nem akkor kombinálható adenovírus, vagy lentivírus rendszerekkel.

9 Génkiütés: Állatok Arabidopsis,dohány,szója, kukorica, drosophila, C.elegans, tengeri sün, selyemhernyó, zebradánió, Xenopus, egér, patkány,nyúl,sertés,szarvasmarha, ahol eddig kipróbálták, működött

10 Génbeütés, illetve géncsere Ebben az esetben a homológ rekombináció működik (HR) Plazmid donorral működik, de megy oligonukleotid donorral is

11 Célzott mutációval transzgénikus egér, mely lox-p helyeket hordoz Másik példa: szarvasmarha génbeütés (lysostaphin) casein lokuszra

12 Példa knock-in használatra emberi sejtekben Parkinson kórban szerepet játszó két mutáció

13 Nemcsak vágás, de transzkripciós aktiválás, receptorfüggő aktivitás, represszálás, metiláció is kivitelezhető

14 Honnan szerezhető be?

15 Hátrányok Nagyon erős protein mérnökség háttér kell Drága Szellemi tulajdon problémák (növényeseknél) Toxicitás Offtarget hatás

16 Xanthomonas oryzae pv. oryzae Komoly penészt okoz rizsen, fűféléken, sáson. A baktérium TAL effector része transzkripcionálisan aktiválja a rizs betegség-fogékony S génjét.

17 A TALEN technológia: TAL effector+ FokI endonukleáz TAL effector DNS kötő domén felhasználása Xantomonas baktérium termeli, bejut a növényi sejtmagba, és olyan géneket aktivál, mely a fertőzést elősegíti DNS kötő doménnel rendelkezik, mely egy adott helyen hipervariábilis de pontosan lehet tudni, hogy mely aminosavcserék kellenek a megfelelő bázisok felismeréséhez

18 TALEN DNS hasító rész: FokI restrikciós endonukleáz Nem specifikus DNS hasítását végzi

19 A TALEN rendszer működése

20 Kiütés mellett lehetőség van aktiválásra is, represszióra stb. Emlős sejttenyészetben promóterre tervezve, aktivátor doménnal felszerelve az expressziót 20X növelték (idegi növekedési faktor)

21 TALEN milyen fajokban működik (példák) Növények Különböző állati sejtek ES sejtek, ips sejtek Saccharomyces Zebradánió C. Elegans Patkány Egér Disznó, Szarvasmarha, kecske, Nyúl

22 Plazmid kitként megvásárolható Hogyan szerezhető be? Meg is vásárolható szőrőstől-bőrőstől

23 TALEN tervezés ngate/voytas

24 TALEN targeter ereménye

25 TALEN összeszerelése

26 Egy példa patkányban 1. Talen és a FokI restrikciós domén összerakása 2. Target konstrukció: patkány IgM génre 3. Injektálás patkány korai embriókba DNS formában

27 Eredmény ellenőrzése T7 nukleázzal Patkány sejt Patkány 7/74

28 Technológia finomítása (koncentrációk és injektálási formák) hosszú deléciók Mozaikos egyedek is Dupla KO egyedek is

29 Az állatok örökítik a módosítást

30 Funkcionális vizsgálatok

31 Példák Terápiás célkora in vitro kísérletek

32 Példák

33 Előnyök/hátrányok Nem kell fehérjés szakértő Olcsóbb Szellemi tulajdonok ok Toxicitás Offtarget hatás Jó sok klónozás

34 CRISPR/Cas9 Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats

35 CRISPR/Cas9 rendszer

36 CRISPR/Cas9 rendszer Baktériumok immunrendszere, behatoló fágok és plazmidok ellen

37 CRISPR/Cas9 rendszer 45 Cas gén család 3 fő divízió, sok aldivízió

38 A bakteriális immunrendszer részletesebben

39 CRISPR/Cas9 rendszer PAM szekvencia

40 CRISPR/Cas9 rendszer átalakítása

41 CRISPR/Cas9 rendszer

42 Lehetséges módosítások Nonhomologous end joining Homology-direct repair Cas9 ált. módosítás 20-60% Inszerciós mutagenezis hatékonysága: 0,5-20%

43 CRISPR/Cas9 rendszer 1. guiderns tervezés merce/cas9/input CRISP/designcrispr.html Finder/index.php esign

44 Egy CRISPR tervezés végeredménye

45 Cél oligonukleotid rendelése Vektorba ligálás Tisztítás, ellenörzés Munkamenet 1

46 Munkamenet 2 PCR Gélelektroforézis Fragment-izolálás gélből A PCR termék Prot. K és SDS kezelése Fenol/kloroformos precipitáció mmessage mmachine T7 Transcription Kit transzkripció in vitro Tisztítás

47 Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) Cas9

48 Cas9 In vitro transzkripció, vagy meg kell venni Cas9 mrns region=hu Cas9 fehérje

49 Mikroinjektálás kecske nyúl sertés blasztociszta

50 Ellenőrzés T7 endonukleáz emésztéssel

51 Cas9 Nickase

52 CRISPR/Cas9 rendszer, mint gátló faktor CRISPR/Cas9 rendszer, mint aktivátor

53 Példák In vitro alkalmazás terápiás célokra

54 Példák B-sejt hiányos mutáns sertés IgM nehéz láncán mutáció Fibroblast sejteken, majd szomatikus sejtmag átülteséses technikával ötvözve 3 biallélikus mutáns utód.

55 Mezőgazdasági hasznosítások Hipoallergén tojás tülök nélküli marha

56 Szuperizomolt sertések miosztatin hiányosak

57 PRRSV rezisztens sertések CD163 génben hordoznak mutációt

58 Érdekességek: Szuper-mini sertés háziállatnak BAMA törpesertésből (35-50 kg) növekedési hormon receptor hiányos, 1600 dollár

59 Xenotranszplantáció- multkori előadásból Állatból emberbe történő szervátültetés Probléma: azonnali kilökődés A kilökődés kiváltója egy sejtfelszíni cukor-oldallánc mely nincs meg az emberben (Gal-alfa-1,3-Gal) Klónozással készült KO sertések, melyek nem képesek ezt a sejtfelszíni markert szintetizálni. Gyakorlatilag alkalmasak szívátültetésre.

60 Sertés endogén retrovírus menetsítés

61 Tollmentes baromfi Természetes mutáns (báziscsere) Nagyon hasznos lenne a trópusi országokban a helyi fajtákban a mutáció kialakítása A megfelelő sejtvonal készen áll

62 Az első genetikailag módosított emberi embriók/b-globin gén

63 Érdekességek: Fajok újraélesztése CRISPR technikával

64 Gene drive- beépített CRISPR rendszer, minden utód genetikailag módosított Szúnyogpopulációk tejes kiirtása- ökológiai problémák? Csak a betegséget nem adja tovább- jobb megoldás

65 Meganucleases Archea, bacterial, algae origin Sequence recognition

66 Új Crispr rendszer: Single RNS alapú Cpf1 rendszer

67 Van ami mégsem működik?

68 Egy tisztán mezőgazdasági alkalmazás: Myostatin KO nyúlban Az izom növekedés negatív szabályozó faktora Gátolja a mioblasztok terminális differenciálódását és proliferációját. Védi a differenciálatlan mioblasztokat az apoptotikus folyamatoktól. Hiánya hiperpláziát és/vagy hipertrófiát idéz elő. Hatással van a zsírszövet alakulására. Természet CRISPR

69 Genetikai háttér szerepe? Vad szelektált TG K A genetikai háttér szerepe myostatin nyúlban Növekedési hormon túltermelés

70 Előkísérlet X X XX X Mikroinjektálás, in vitro tenyésztés

71 A konstrukció X

72 + Mutáns nyulak létrehozása

73 Hatékonyság Beültetett zigóta Recipiens Vemhessé g Újszülött TG Wt TTTGTGCAAATCCTGAGGCTCATCAAACCTATGAAAGACGGTACAAGGTATACTGGAATCCGA 5BKK TTTGTGCAAATCCTGAGGCTCATCAAAC GGTACAAGGTATACTGGAATCCGA 8BKK TTTGTGCAAATCCTGAGGCTCA GACGGTACAAGGTATACTGGAATCCGA 5BT TTTGTGCAAATCCTGAGGCTCATCAAACCTATG GTACAAGGTATACTGGAATCCGA 9FBL TTTGTGCAAATCCTGAGGCTCATCAAACCTATGA----CGGTACAAGGTATACTGGAATCCGA 9F TTTGTGCAAATCCTGAGGCTCATCAAACCTA---AAGACGGTACAAGGTATACTGGAATCCGA 7/3 TTTGTGCAAATCCTGAGGCTCATCAAAC GGTACAAGGTATACTGGAATCCGA 5JT TTTGTGCAAATCCTGAGGCTCATCTAA------AAAGACGGTACAAGGTATACTGGAATCCGA 11 bp del 14 bp del 7 bp del 4 bp del 3 bp del 11 bp del 6 bp del/3 ins

74 Súly (kg) 4 Növekedési potenciál 3,5 3 2,5 2 1,5 8JT 8BT 8BKK 8JTBT 8JKK 1 0,

75 Zsír/izom arányok a nyulakban Izom (cm3/kg) Zsír(cm3/k g)

76 Orvosi alkalmazás- SX1 gene Alacsony expresszió több szövetben Nagyon erős megjelenés a herében/spermatozoában (nyak, akroszóma) Szükséges a spermiumok mozgásához? Beültetett zigóta Recipiens Vemhessé g újszülött Hetero és homozigóta bak alapítónk is van egy lépésben TG

77 Friss sperma motilitása

78 Sperma eltarthatósága Idő

79 Szabályozzuk, vagy ne? Szabályozzuk Nem szabad a technológiát szabályozni A szabályozást a célok meghatározásánál érdemes elvégezni Előnyök/hátrányok teljes és átlátható feltérképezése Az egész társadalomnak kell elvégezni a döntést