Transzgenikus technikák a neurobiológiában. általános fogalmak

Átírás

1 Transzgenikus technikák a neurobiológiában általános fogalmak

2 Némi történeti áttekintés Mendel genetikai törvényei fajta-nemesítés már korábban is! 1940 s- kémiai (ethyl methanesulfonate, methyl methane sulfate, methyl N-nitrosourea, ethyl N-nitrosourea) és fizikai (pl. radioaktivitás) mutagenezis 1973: első rekombináns baktérium; 1978: E. coli insulin termelés (Genentech) Rudolf Jaenisch (1976): első mesterséges vírusbevitel egér embrióba (SV40) Gordon és Ruddle (1981): tisztított DNS injektálás egysejtes egér embrióba; csíravonal-transzmisszió 1999: Enviropig : trágyában csökkentett foszfor-mennyiség (nyálban: fitáz) 2000: spider goat 2003: GloFish 2009: transzgenikus csíravonalban örökítő - főemlős (selyemmajom) E Sasaki et al. Nature 459, (2009)

3 Transzgenezis és tenyésztés/keresztezés GMO: Genetically modified organism - olyan tulajdonsággal rendelkezik, amely idegen DNS bevitel eredménye tenyésztés: egy fajból származó két egyed keresztezése, hogy jobb/hasznosabb tulajdonságokkal rendelkező egyedeket kapjunk - csak a faj egyedeiben megtalálható gének (génvariánsok) kerülnek át egyik egyedből a másikba transzgenezis: a fajokat a fajra nem jellemző tulajdonságokkal is felruházzuk - transzgén: más fajba/élőlénybe/egyedbe beviendő, génsebészeti eljárással előállított gén: lehet olyan mesterséges gén is, ami a természetben nem is fordul elő - transzgenikus (transgenic) élőlény: mesterségesen, nem tenyésztéssel bevitt gént tartalmaz: a transzgenikus élőlény olyan növény vagy állat, amely más sejtből vagy szervezetből származó genetikai állományt [gén(eke)t] stabil formában tartalmaz [és azokat a következő nemzedékekre átörökíti]. - növény, állat, gomba, baktérium, vírus, tenyésztett sejtek...

4 Transzgén állatok felhasználása (alap)kutatási célok humán betegség-modellek (Alzheimer, parkinson, AIDS, tumorok...) táplálkozási célok: élelmezési szempontok alapján módosított állatok (GH, hús/zsír arány, stb) transpharmers : humán fehérje, FIX, lactoferrin termelés (kecske, nyúl, disznó, marha) xenotransplanters : humanizált szövetek, szervek transzplantációhoz etikai és jogi problémák sokasága!

5 1. a konstrukció in vitro előállítása GMO állatok előállítása - a gének működéséhez szükséges DNS elemek kellenek a transzgének megfelelő működéséhez is

6 1. a konstrukció in vitro előállítása GMO állatok előállítása intron (locus control region) - a vektorok származhatnak vírusokból, pro- vagy eukarióta plazmidokból + YAC, BAC (yeast/bacterial artificial chromosome), minikromoszóma

7 1. a konstrukció in vitro előállítása GMO állatok előállítása - a transzgén kódoló régió legyen a célnak megfelelő

8 1. a konstrukció in vitro előállítása GMO állatok előállítása - a transzgén kódoló régió legyen a célnak megfelelő

9 GMO állatok előállítása 2. a konstrukció bejuttatása - vagy közvetlenül a sejtmagba, vagy a citoplazmába fizikai módszerek: - Ca precipitáció - mikroinjekció - elektroporáció - génpuska - lipofekció - elektrofúzió

10 2. a konstrukció bejuttatása GMO állatok előállítása - vagy közvetlenül a sejtmagba, vagy a citoplazmába biológiai módszerek: - vírus-mediált: SV40, retrovírus, adenovírus, lentivírus sejtes módszerek: - spermium-közvetített génbevitel - blasztomer-embrió aggregáció (nem specifikus, multigén) - teratokarcinóma /ES sejt transzfer - sejtmag transzplantáció ( klónozás ) - genetikailag módosított sejtek bevitele (sejtterápia)

11 3. a konstrukció integrációja GMO állatok előállítása - öröklődő: a gén/genom módosítás érinti az ivarsejtet is (ivarsejtembrionális őssejt módosítás) - szomatikus: gén/genom módosítás csak a testi sejteket érinti (a módosítás testi sejtekben történik, a DNS integrálódhat a genomba, vagy lehet episzómális is ) - a genom-módosítás lehet térben és időben szabályozott és reverzibilis is random: génaddíció - igen kis (<10-6 ) hatékonyság; pozitív szelekció; gyakori fejfarok konkatamer -> utólagos rekombinációs esély!! - a beépülés helyétől nagyban függ az expresszió - igazi transzgenikus állat irányított: célzott génmódosítás - homológ rekombináció 2x - ált. pozitív és negatív szelekció egyszerre - knockout, knockin, knockdown

12 Transzgenikus modellek

13 Genetikailag módosított egér-típusok

14 Transzgenikus egerek előállítása

15 Az egér embriogenezis kezdeti lépései

16 Transzgenikus egér előállítási lépései

17 Transzgenikus egér leggyakoribb előállítási lehetőségei 1.

18 Megtermékenyített petesejtbe DNS mikroinjektálás

19 Transzgenikus egér leggyakoribb előállítási lehetőségei 2.

20 Pluripotens ES sejtvonalak

21 Transzgenikus ES sejtvonalak

22 ES kimérák készítése

23 Transzgenikus egér leggyakoribb előállítási lehetőségei 3. lentivírus / retrovírus injektálás

24 Transzgenikus egér leggyakoribb előállítási lehetőségei 4. transzpozon

25 Szomatikus sejtmag-transzfer - klónozás

26 Transzgenikus technológiák a neurobiológiában

27 Irányított mutációk saját eredmény: NR2B/2C egértörzs - NR2C génbe NR2B cdns integrálás -> NR2C knockout + NR2B knockin fenotípus NR2B ISH

28 Humanizált egerek

29 Génaddíció

30 Szövet- és sejttípus-specifikus promóterek

31 Szövet- és sejttípus-specifikus promóterek

32 Általános, minden sejtben működő promoter

33 Sejttípus-specifikus promoter

34 BAC: az expresszió specifikusságának fokozása

35 BAC: az expresszió specifikusságának fokozása pl. parvalbumin (PV) gén kifejeződése agyban / izomban

36 A transzgén expresszió időbeli szabályozása indukálható promoterek - gyors és reverzibilis, magas szintű expresszió - alacsony szintű nem-indukált expresszió indukálható endogén promoterek - endogén kontroll szekvenciák metallothionein MAF kötődik a MRE-hez Cd/Zn jelenlétében interferon aktiválható promoter steroid regulált promoterek GRE (glukokortikoid- MMTV) - DE az indukálhatóság ált. nem túl magas + mellékhatások mesterséges indukálható promoterek

37 Indukálható transzgenezis kettős transzgén rendszerek

38 Indukálható transzgenezis kettős transzgén rendszerek

39 Transzaktivátor rendszerek Tet-off - Manfred Gossen, Hermann Bujard - effektor: VP16 (herpes simplex) transzaktivátor domén + E. coli tetraciklin represszor (TetR) - reszponder: tetraciklin operon 19 bp (teto) + a kívánt gén - Dox -> transzkripció Tet-on - rtta: reverz transzaktivátor - Dox -> transzkripció kettős génátírás - 2 minimál promóter: kívánt transzgén mellett pl. reporter gén átírását is szabályozza

40 Transzaktivátor rendszerek saját eredmény: PKDkd-EGFP egértörzs - mutáns, EGFP-taggelt PKD (protein kináz D) forma indukálható, előagy-specifikus expresziója

41 Transzaktivátor rendszerek Gal4/UAS rendszer - élesztő: Gal4 az UAS (upstream activator sequence)-hez kötve indítja az expressziót indukálható: GVLP - Gal4 + VP16 + LBD 42 (mutált progeszteron receptor) - induktor nélkül a citoplazmában Hsp70/90-hez köt - induktor: RU486 (anti-progeszteron) - embrionális fejlődés alatt csak nagyon korlátozottan használható

42 Helyspecifikus rekombinációs rendszerek Cre: P1 bakteriofág rekombináz (LoxP) Flp: élesztő flipáz (FRT) 34 bp - helyspecifikus rekombináció a floxolt vagy flrted helyek között -> cis inverzió / kivágódás; trans átrendezés - nem várt hatás: maradék target hely (+ neo kazetta) hatása emlős pseudosite-ok: DNS károsodás

43 Helyspecifikus rekombinációs rendszerek - rengeteg szövet-specifikus deleter törzs ismert / vásárolható - sejtsors-térképezésre is alkalmas Fate mapping the descendants of a gene-expression domain. In this example, a tissue-specific promoter (TSP) (for example, the Wnt1 promoter) controls the expression of a cre or FLP transgene. a The cre (or FLP) transgene is not expressed outside the dorsal neural tube. A reporter transgene is transcribed from a ubiquitous promoter (UP), but no functional gene product is produced outside the dorsal neural tube because Cre (or Flp)-mediated recombination is required to remove the floxed (or flrted) Stop sequences that separate the promoter from the reporter coding sequences (red arrowheads, loxp or FRT sites). b Cre activity in the dorsal neural tube (red) results in the removal of the Stop sequence and reporter activation (blue). c Migrating neural-crest cells (blue arrow) no longer express cre or FLP, but the reporter remains activated (blue).

44 Helyspecifikus rekombinációs rendszerek - természetesen indukálható Cre rendszer is van... fúziós fehérje

45 Reporter fehérjék termeltetése élő szövetben / állatban is!

46 Biolumineszcencia

47 A Brainbow egér fluoreszcens fehérjék véletlenszerű rekombinációja / deléciója -> akár 90- féle színárnyalat - 3 fluorokróm, egymással nem kompatibilis LoxP helyek

48 A Brainbow egér fluoreszcens fehérjék véletlenszerű rekombinációja / deléciója -> akár 90- féle színárnyalat - 2 / 4 fluorokróm, invertált elrendezés -> kivágódás és inverzió is lehetséges

49 A Brainbow egér fluoreszcens fehérjék véletlenszerű rekombinációja / deléciója -> akár 90-féle színárnyalat - tandem kópiaszám csökkentése -> FRT hely

50 A Brainbow egér