Transzgenikus egerek előállítása és felhasználásuk. Erdélyi Ferenc MTA KOKI Orvosi Géntechnológiai Részleg

Átírás

1 Transzgenikus egerek előállítása és felhasználásuk Erdélyi Ferenc MTA KOKI Orvosi Géntechnológiai Részleg

2 Transzgenikus állatok Mesterségesen megváltozatott genetikai állománnyal rendelkeznek. Genom módosítás Génaddíció Géntranszfer eredményeként a genomba (random) beépülve egy idegen DNS darabot tartalmaznak. Célzott génmódosítás Endogén gén célzott mesterséges megváltoztatása. Öröklődő: a gén/genom módosítás érinti az ivarsejtet is. (ivarsejt- embrionális őssejt módosítás) Szomatikus: gén/genom módosítás csak a testi sejteket érinti. (módosítás testi sejtekbe történik, a DNS integrálódhat a genomba, vagy lehet episzómális is ) A genom módosítás lehet térben és időben szabályozott és reverzibilis is.

3 Genetikai állatmodellek random spontán mutánsok kémiai mutagenezis tervezett (transzgenikus) szomatikus csíravonal öröklődő funkciónyeréses mutáns (gain-of-function) funkióvesztéses mutáns (loss-of-function) túltermelés domináns negatív null-mutáns knockout részleges (hipomorf) mutáns knockdown mutáció knockin sejt-abláció kondicionális/indukálható térben és/vagy időben szabályozott

4 Transzgenikus állatok felhasználása kutatás gyakorlat szövet- és fejlődés- specifikus génszabályozás (promoter vizsgálat) génfunkciós és fejlődéstani vizsgálatok sejtazonosítás sejtfunkciós vizsgálatok emberi betegségek állatmodelljeinek létrehozása gyógyszercélpontok validálása-fejlesztés gyógyászatban fontos fehérjék előállítása (bioreaktorok) haszonállatok előnyös tulajdonságainak javítása

5 Miért pont egér? Régóta tenyésztik Sok jól definiált törzse ismert Kis helyigény Felhasználó barát Könnyen manipulálható

6 Egerek embrionális fejlődése

7 Donor nőstények előkészítése 5-8 hetes nőstény: 5U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (FSH) 5U Human Chorionic Gonadotropin Időzítés: PMSG 14 h 47 órával később HCG 13 h Pároztatás donor hímmel Másnap reggel plugolás

8 Donor nőstény X Donor hím Embrió Álvemhes anya Recipiens nőstény X Vazektomizált hím

9 Embrió preparálás ampulla Hyaluronidáz

10

11 Mikroinjektált embrió beültetése

12 Az eukarióta génexpresszió szabályozásának lépései transzkripció sejtmag citoplazma mrns degradáció DNS primér mrns mrns transzkriptum transzlációs szabályozás RNS processzing RNS transzport inaktív mrns fehérje poszttranszlációs modifikáció aktív inaktív

13 Gének általános szerkezete 5 -upstream régió exon inron 3 -downstream régió ATG Kozák konszenzus GCCACCATGGCTG PoliA addiciós szignál Határoló szekvenciák MAR, SAR, LCR

14 Genetikai módosítás fajtái 1. transzgenikus A transzgén A transzgén transzgén A

15 A mikroinjektált transzgén sorsa Fej-farok irányú konkatamér képződés Beépülés a genomba általában egy helyre Koinjektált DNS együttes beépülésének esélye magas Integráció helye random (preferenciális helyek?) Bépülés helye hatással van az expresszióra (heterokromatikus régió- néma)

16 Hagyományos pronukleáris mikroinjektálás Előnyök Felszerelés igénye kicsi Olcsó Gyors Hatékony (1-25%) Nagy kópiaszám Expresszió szintje magas Hátrányok Véletlenszerű beépülés Transzgén beépülése konkatamer formában Inaktiváció esélye magas Csak génaddíció lehetséges.

17 Riportergéneket expresszáló transzgenikus egerek A riportergén egy olyan fehérjét kódol, amelynek az expressziója egy meghatározott génhez kötött és nem befolyásolja a sejtfunkciót. Alkalmazása gének szabályozó elemeinek azonosítása, jellemzése sejtek jelölése fehérjék jelölése fehérje expresszió, aktivitás lokalizáció sejtben, szövetben, szervezetben fehérje-fehérje kapcsolat fehérje mozgás jelátviteli funkciók

18 Riporterfehérjék bakteriális -galaktozidáz enzim: LacZ gén kódolja kimutatása enzimhisztokémiával/enzimaktivitás alapján Luciferáz enzim (szentjánosbogár) kimutatása: biolumineszcenciával/enzimaktivitás alapján fluoreszkáló fehérjék (GFP, DsRED) kimutatása autofluoreszcencia alapján Biolumineszcencia és fluoreszcencia alapján élőben, egész állatban is kimutathatók, nyomon követhetők (hűtött CCD kamera).

19 A génexpresszió helye in vivo detektálható a biolumineszcens markergént hordozó transzgenikus modellben könnyű valós in vivo detektálás ugyanazon kísérleti állaton több időpontban is elvégezhető a vizsgálat

20 Az inos gén transzkripciós aktivitásának in vivo egész állatban történő valós detektálása inos luciferáz IFN +slps kontrol IFNg+sLPS transzkripció a májban gyulladásos állapotokban aktiválódik: zimozán-indukálta arthritis bőrsérülés gyógyulása Gyulladáscsökkentő szerek tesztelésére IFNg+sLPS + Dex

21 Genetikailag kódolt fluorogének fluoreszcens riporter fehérjék fluoreszcens szenzorok (PF-k)

22 Genetikailag kódolt fluoreszkáló fehérjék használatának előnyei, hátrányai! detektálásához nem kell szubsztrát! expresszáló sejtek élőben és fixálatlan szeletben is azonosíthatók! fixálás után is működik! ellenanyaggal is kimutatható! mivel nincs amplifikálás a kimutatásnál nem túl érzékeny! nagyon stabil, ezért az expresszió gyors változásainak kimutatására kevésbé alkalmas! sokféleképpen módosítható aminósavcsere fúzió inszerció cirkuláris permutáció

23 Prototípus: zöld fluoreszkáló fehérje (GFP) GFP fehérje

24 GFP mesterséges színvariánsok

25 mrfp variánsok Spectra are normalized to the excitation and emission peak for each protein. (a,b) Excitation (a) and emission (b) curves are shown as solid or dashed lines for monomeric variants and as a dotted line for dtomato and tdtomato, with colors corresponding to the color of each variant. (c,d) Purified proteins (from left to right, mhoneydew, mbanana, morange, tdtomato, mtangerine, mstrawberry, and mcherry) are shown in visible light (c) and fluorescence (d). The fluorescence image is a composite of several images with excitation ranging from 480 nm to 560 nm.

26 Transzgenikus egérben: DsRedT3

27 Transzgén kódoló régiója start ATG kódoló régió stop TGA poli(a) riportergén: mrns másolat (cdns) minigén hibrid gén valódi gén intakt/mutáns sejtek jelölése/fehérjék -galaktozidáz zöld fluoreszkáló fehérje (GFP) luciferáz jelző funkció promoter sejt fehérje valódi gén mutáns, hibrid,csonkolt megváltozott sejtfunkció

28 Transzgén kifejeződés specificitását a DNS szabályozó elem határozza meg promoter GFP mindes sejtjében transzgenikus egér Általános (CAG) -gal transzgenikus agy Agyspecifikus (NSE) -gal transzgenikus idegsejt Purkinje sejt specifikus (L7)

29 Transzgenikus kisagyi Purkinje sejtek L7 Purkinje sejt specifikus gén E1 E2 E3 kisagy Purkinje sejt zöld fluoreszkáló fehérje -galaktozidáz

30 Gátló (GABAerg) idegsejtek genetikai módosítása GABAerg idegsejt-specifikus gén (GABA-szintetizáló enzim- GAD65) transzgén egfp medúza zöld fluoreszkáló fehérje gén embrió agy hippocampus cortex fluoreszáló GABAerg idegsejtek az agyban szaglógumó kisagyi Purkinje sejt

31 GFP+ Purkinje sejtek izolálása FAX-szal L7/gfp transzgenikus egér FAX tiszta Purkinje sejt tenyészet Purkinje sejt

32 Transzgén expresszió térbeni szabályozása transzgén regulációs régiója enhancer-promoter intron kódoló régió poli(a) Meghatározza a transzgén expressziójának: helyét idejét szabályozását promoter típusok természetes hibrid/mesterséges szövetspecfikus enhancerhsp68 (tk) minimál promoter szövetspecifikus enhancerek azonosítására általános, minden sejtben működő promoter CAG (csirke aktin promoter CMV enhancer) ROSA26 ubiqutin, RNS pol. II szövetspecifikus sejttípus-specifikus indukálható

33 Tipikus emlős génregulációs régió Az emlős géneket a promotereken kívül több enhancer és silencer szabályozza. Egy tipikus enhancer 500 bp hosszú 10 Kötőhelyet tartalmaz, amelyhez legalább háromféle transzkripciós faktor, valamint 2 különböző aktivátor és egy represszor kötődik.

34 A transzkripció szabályozásában résztvevő transz elemek

35 Nagyméretű inszertet tartalmazó klónozó vektorok Plazmid: ~10 kb l-fág: ~20 kb cosmid: kb P1 fág: 100 kb PAC/BAC: 350 kb YAC: 2 Mb

36 P1 fág BAC vector

37 YAC vector

38

39 PV-GFP transzgenikus egerek plazmid: csak izom expresszió BAC: izom és agy expresszió izom agy cerebellum Purkinje sejtek cortex hippocampus

40 Hagyományos pronukleáris mikroinjektálás Előnyök Felszerelés igénye kicsi Olcsó Gyors Hatékony (5-30%) Nagy kópiaszám Expresszió szintje magas Hátrányok Véletlenszerű beépülés Transzgén beépülése konkatamer formában Inaktiváció esélye magas Csak génaddíció lehetséges.

41

42 Genetikai módosítás fajtái 2. knock-out A exon1 P X Neo R gén exon2 X Homológ rekombináció P Neo R gén Transzláció nem megy végbe

43 Genetikai módosítás fajtái 3. knock-in A P X exon1 Transzlációs start kifejezendő gén X exon2 Homológ rekombináció P Transzlációs start

44 Genetikai módosítás fajtái 4. Speciális fajtája a speedy mouse, ahol egy olyan konstitutív génbe inzertálják homológ rekombinációval a kifejezendő gént, aminek hiánya nem okoz fiziológiai változást, viszont a gén környezete lehetővé teszi, hogy minden sejtben egyenletes expresszió alakuljon ki. (hprt lókusz X kromoszóma, ROSA26) P P Transzlációs start

45 Kiméra előállítás

46

47

48 Szőrszín kimérák

49 C57BL/6NTac- Atm1.1ArteTyrtm1Arte Blasztociszta donor cc,aa ES sejt CC,aa C57Bl6 CC,aa Hibridek Cc, Aa aguti

50 ES-sejt gén manipuláció Előnyök A génbevitel nagy hatásfokú Szelekciós lehetőségek állnak rendelkezésre Könnyen archiválható Szinte bármilyen gén és genom manipulációra lehetőség van. Knockout Mouse Project Hátrányok Korlátozott a sejtvonalak száma Folyamatos kromoszóma és fertilitás ellenőrzés Drága Csak olyan laborokban működik, ahol folyamatosan nagyszámú mutánst állítanak elő Neo kazetta problémás

51 Taconic rendszer exon flp flp loxp exon loxp Neo

52 Hagyományos pronukleáris mikroinjektálás Előnyök Felszerelés igénye kicsi Olcsó Gyors Hatékony (1-25%) Nagy kópiaszám Expresszió szintje magas Hátrányok Véletlenszerű beépülés Transzgén beépülése konkatamer formában Inaktiváció esélye magas Nagy kópiaszám Csak génaddíció lehetséges.

53 Transzpozícióra képes segédfehérjék használata Lentivírus Vírus mediált beépülés Módosított, defektív HIV vírus Helper vírussal burok generálás Korlátozott cargo kapacitás BLS2 szintű labor és állatház Transzpozonok

54 Genetikai módosítás fajtái 1b. transzgenikus A Transzpozáz LTR transzgén LTR A transzgén A LTR LTR

55 Transzpozon mediált genom módosítás A 2. típusú transzpozonok olyan mobil genetikai elemek, amelyek önkivágó/beépítő aktivitással rendelkező transzpozázt kódolnak és annak felismerő helyét is tartalmazzák. transzpozon alapú géntranszfer rendszer cut and paste transzpozició 1 2 önkivágás beépülés új helyre 1. a transzpozáz felismerő helyekkel (IR) körülvett beültetendő gént tartalmazó vektor 2. A transzpozázt hordozó vektor RNS-sel helyettesíthető Amennyiben mindkettő jelen van a sejtben a kivágás és a genomiális DNS-be való Integráció megtörténik.

56 Transzpozon mediált genom módosítás Gerincesekben aktív 2-es típusú transzpozon rendszerek Név/forrás Transzpozon család Cargo méret Integrációs preferencia Sleeping beauty (SB)* Tc1/mariner 5-7 kb? Méret növelésével csökken a hatásfok nincs gén preferencia inkább intron piggybac piggybac Hatásfok csökken 9 kb felett -pronukl. injektálás Frog prince Tc1/mariner ua. min egyéb Tc1/mainer Tol1/2 hat nagyobb mint a többi kb (BAC transzgén 70 kb) gén kódoló régió preferencia intron preferencia gének 5 -régiója? Izsvák Zs, Ivics Z, Matés L SB100 X- 100X aktívabb: 35-50% hatékonyság stem sejtekben, 45% stabil transzgenikus egér

57 Transzpozon mediálta genom módosítás Alapja random inszerciós mutagenezis (funkció vesztés funkció nyerés) két-komponensű rendszer: (1) transzpozon vektor tartalmazza a bevinni kívánt cdns-t, vagy a gén inaktiváláshoz (aktiváláshoz) szükséges elemeket (2) transzpozáz RNS/vektor formában. Mindkét komponenst be kell juttatni a sejtbe Néhány kópiába épül be (függ a transzpozon/transzpozáz mennyiségétől) Szomatikus és ivarsejt módosításra is alkalmas Nem vírus-eredetű géntranszfert tesz lehetővé Nagy hatásfokú, gyors módszer Használható Transzgenikus modellállatok előállítása (egér, patkány, nyúl stb) génaddíció RNAi knock down- kiválthatja a lentivírust Inszerciós mutagenezis- nem homológ rekombináción alapuló KO technológia- ES sejt független - nagyléptékű patkány KO projekt génterápia Humán (és egyéb) KO sejtvonalak előállítása ipsc vonalak előállítása vírus nélkül

58 sb-cag/eyfp transzgén kópiaszáma az alapító egyedekben

59 line # founder offspring F1 offspring F2 ID copy number pups/tg copy number ID/copy number pups/tg copy number mosaic 8/3 1 5/ mosaic 4/4 1 7/ / /4 2 5/ male/2 10/ / female/6 6/ female/4 8/ / / /5 1 7/6 7/6 6/ ~1 7/2 1 6/ ~2 6/1 ~ /0 4/ / / / male/ female/5 4/ female/5 7/7

60 A B C D SB-CAG/eYFP mouse brain sagittal sections. A: Cerebral Cortex, B: Cerebellum, C: Hippocampus D: Detailed part of prefrontal cortex. As figures show, however the brain itself seems to be green, CAG promoter is not active in neurons oposite of endothel layer of vessels.

61 Transzpozáz mediált genom módosítás Előnyök Nagy hatásfokú (15-85%) Az integrálódás egyedi, így a transzgén inaktiválódás esélye alacsonyabb A transzgén továbbörökítés aránya magas Hátrányok RNS munkát igényel, ami drágább és nagyobb odafigyelést igényel. Az alacsony kópiaszámból adódóan a transzgén expressziója alacsony lehet A cargo méretre korlátoz A random integrálódásból adódó gén inaktiválódás előfordulhat

62 PhiC31 integráz mediált géntranszfer Streptomyces ΦC31fág integráz attb helyek elhelyezése a ROSA26 locusba

63 Genetikai módosítás fajtái 4. Speciális fajtája a speedy mouse, ahol egy olyan konstitutív génbe inzertálják homológ rekombinációval a kifejezendő gént, aminek hiánya nem okoz fiziológiai változást, viszont a gén környezete lehetővé teszi, hogy minden sejtben egyenletes expresszió alakuljon ki. (hprt lókusz X kromoszóma, ROSA26) P P Transzlációs start

64 Meganukleázok Endonukleáz aktivitással bíró enzimek DNS duplaszál törést követően megnő a repair aktivitás, ami rekombinációs hot spotot alakít ki Target specifitással bíró hibrid meganukleázok kialakítása

65 Genetikai módosítás fajtái 2b. knock-out A P X TALEN, ZFN, CRISPR XX MN MN X P P Transzláció nem megy végbe

66 ZN-finger nukleáz mediált genom módosítások

67 ZN-finger nukleáz mediálta genom módosítások ZNF kettőszálú törést okoz a genom meghatározott helyén. Specificitást a ZF biztosítja. 1. A törést a sejt NHEJ mechanizmussal javítja mikrodeléció/inszerció potenciális KO 2. A törést a sejt HR mechanizmussal javítja + módosított homológ régió knock in deléció mutáció

68 ZN-finger nukleáz mediálta genom módosítással KO sejtek és modellállatok is létrehozhatók Előnye Transzgenikus patkány előállítása ZNF technológiával Homológ rekombináció nélkül létrehozható KO sejtvonal, vagy modellállat Azokba az állatfajokban is alkalmazható, amelyeknél nem áll rendelkezésre pluripotens ES sejt Nagy a hatásfoka és gyors Hátránya A kívánt specificitású ZNF-et elő kell állítani Ez nem egyszerű és drága mutáció a kódoló exonban KO

69 SIGMA-SAGE labs ZNF KO sejtvonalak előállítása GMO állatmodellek előállítása: egér, patkány és nyúl constitutive KO humanization reporter tagging point mutations bármely törzs Kész patkány KO modellek

70 TALEN

71 Xanthomonas sp. Transcriptional activator like effectors TALE 34 aminosav modulok (repeat variable diresidues RVD) 12., 13. aminosav a nukleotid kötésért felelős aminosavak NI = A, HD = C, NG = T, NN = G or A)

72

73

74 TRESK mutáns egerek szekvenciája Wt CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCTGTCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm48 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT-TCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm57 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT--CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm7 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATGCT--CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm57 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGATG--GTCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm60 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAAGC----TCCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm51 CTGAGGAGCCA CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm49 CTGAGGAGCCA CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm44 CTGAGGAGCCA CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm38 CTGAGGAGCCA CCTGAGGCCCTGGGGAAGGCCAGGGGATGCTGCCCCG Tm43 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGG GGATGCTGCCCCG Tm61 CTGAGGAGCCACCTGAGGCCAGGAGA TGAGGCCCCG TALEN felismerő hely Nucleotid mutáció --- deléció 9bp hosszú repeat

75 CRISPR/Cas

76

77 Lehetséges történések

78 Target specifikus nukleázok Cink finger TALEN CRISPR/Cas Tervezés közepes könnyű könnyű Konstruálás közepes könnyű nagyon könnyű Hatékonyság alacsony 80-90% magas Aktivitás Off-targeting vágás alacsony/ változó magas magas változó alacsony magas Toxikusság változó alacsony alacsony Költség magas közepes alacsony

79 ES sejt vs target specifikus nukleázok ES Csak dedikált laborokban Folyamatos ES sejt ellenőrzés Egy konstrukció 1 vonal Egy sejtvonal még nem garantálja az egész egeret és a továbbörökítés sem 100% ~ hét TSN Nem igényel nagy befektetést RNS munka Egy konstrukció több féle vonal (knock-out, potenciális knockdown és knockin) Vonal kialakítás közel 100% ~ hét

80 Konstitutív - indukálható Korai megnyilvánulás, vagy korai génhiány sok esetben káros A szervezet gyakorta kompenzál, így egy gén hiányát más, hasonló funkcióval bíró gének veszik át Egy gén sok szövet - és sejtféleségben nyilvánulhat meg, az általános génkiütés elfedheti a specifikus működést.

81 Indukálható promóterek I. indukálható endogén promoterek használata: transzgén expresszió szabályozása endogén kontrol szekvenciákkal heat shock promoter; metallothionein MAF kötődik a MRE-hez Cd/Zn jelenlétében; interferon aktiválható promoter; steroid regulált promoterek; GRE (glukokortikoid- MMTV) indukálhatóság nem túl magas, mellékhatások

82 Indukálható promóterek II. Mesterségesen indukálható génexpresszió: indukálható transzgenezis Szövetspecifikus promóter TRANSZKRIPCIÓS faktor Reszponzív promóter RNS pol Target transzgén

83 Szövetspecifikus promóter rtta-vp16 teto CMV IE RNS pol Target transzgén

84 Térbeli szabályozás Cre rekombinázzal

85 Cre mediált génkifejezés

86 Brainbow egér

87 1. Konstrukció elkészítése 2. Génbevitel 3. founder kiválasztása genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások

88

89

90

91

92 Transzgenikus egyedek azonosítása és jellemzése Genomiális DNS izolálás farok mintákból 2-3 mm darab - Proteináz K feltárás fenol-kloroform extrakció - etanol/izopropanol kicsapás Előny: nagy mennyiségő tiszta DNS, olcsó Hátrány: munkaigényes, veszélyes szerves oldószer magas ionerő mellett szilikátos megkötés - mosás guanidin izo tiocianát hidroklorid oldattal - elúció alacsony ionerő mellett Előny: automatizálható Hátrány: rossz kitermelés, drága

93

94

95 Transzgenikus egyedek azonosítása és jellemzése II. Génexpresszió alapján RNS - Northern hibridizáció - RT-PCR Fehérje - Western blot - enzim aktivitás - fenotípus Homozigóta egyedekben a transzgén expresszió szintje magasabb lehet.

96 1. Konstrukció elkészítése 2. Génbevitel 3. founder kiválasztása genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások

97 Transzgenikus egyedeket nem transzgenikus egyedekkel keresztezik, felszaporított heterozigóta egyedek keresztezésével homozigóta vonalakat alakítanak ki.

98 1. Konstrukció elkészítése 2. Génbevitel 3. founder kiválasztása genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások

99 Kísérletezés Mit használjunk, és hogyan?

100 Egér fajok elterjedése

101 Laboratóriumi egerek eredete

102 Kedvtelésből tartott egerek - Ázsia, Európa (XVIII-XX. Sz.) Abbie Lathrop összegyűjtötte és tenyésztette őket Granby, MA 1900 W.E. Castle C.C. Little Castle, Little és Mások folytatták Lathrop munkáját és alakították ki Az első inbred törzseket (1908-tól)

103 Egér Családfa Castle s egerek Kína Japán Swiss Egyéb törzsek C57- leszármazott vad eredetű

104

105

106

107 Felhasznált egértörzsek C57/BL6 129 FVB/N NMRI

108 Inbred Outbred/F1

109 A genetikai háttér hatása a genetikai módosítás fenotípusos megjelenésére Magatartás Szív és érrendszer élettana Fejlődési defektek Diabetes Immunitás and gyulladás Metabolizmus Tumor képzés és gyakoriság

110 B6 n 5 0 Blood glucose (mg/dl) Adapted from Almind et al., Diabetes 52:1535, 2003

111 2 típusú diabetes Diabetes db/db (Lepr db ) C57BL/6 (B6.Cg-m +/+ Lepr db /J) elhízás tranziens diabetes-szel Obese ob/ob (Lep ob ) C57BL/6 (B6.V-Lep ob /J) elhízás tranziens diabetes-szel C57BLKS (BKS.Cg- m +/+ Lepr db /J) elhízás megnyilvánuló diabetes-szel C57BLKS (BKS.V-Lep ob /J) elhízás megnyilvánuló diabetesszel

112 Episztatikus faktorok hatása a transzgén megnyilvánulásra Body weight (g) WT HDC -/ weeks Fülöp et al. Endocrinology 2003

113 FVB/N-FVB/Ant

114

115

116 Congenic Co-isogenic

117 Strain B b/b Strain B b/b A. Hagyományos B. SPEED CONGENIC Háttér specifikus genotipizálás nélkül Strain B b/b Strain A a/a mt Strain B b/b b/a mt Strain B b/b % loci A/B b/a mt 100% Strain B b/b b/a mt b/a mt Generation F1 50% b/a mt 25% F1N1 b/a mt N5-N11 b/a mt % loci A/B 100% F1N2 12.5% Strain A 6.25% <0.2% a/a mt <30% Szelektált tenyészpárokkal <5% F1N3 b/a mt F1N4 F1N12 Strain B <0.2% b/b b/a mt Strain B b/b Strain B b/a mt b/b b/a mt Strain B b/b Strain B b/b Beltenyésztett Kongenikus törzs Átlagos elvégzési idő: 5 generáció X 3 hónap/generáció => 1.25 év Minimum idő: 13 generáció X 3hónap/generáció => 3.25 év N12F1 a mt /a mt N12F1 a mt /a mt N12F1 a/a mt N12F1 a/a mt N12F1 a/a N12F1 a/a Beltenyésztett kongenikus törzs Strain B-a mt Strain B

118 Alom kontrol cb1z cb1 cypd D2R net +/+ 29% 27% 31% 30% 31% +/- 50% 50% 47% 48% 56% -/- 21% 23% 22% 22% 13% utódszám tenyészpár

119

120 1. Konstrukció elkészítése 2. Génbevitel 3. founder kiválasztása genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások Rederiválás Embrió mélyhűtés

121 Rederiválás Befogadó állatház Szuperovuláció kiváltása hormoninjekcióval Fertőzött kolónia SPF space Kórokozó mentes kolónia X zigóta/hólyagcsíra állapotú embrió preparálás barrier Tripszin kezelés SPF béranya Elválasztás után higiéniai státusz ellenőrzése

122 1. Konstrukció elkészítése 2. Mikroinjektálás 3. founder kiválasztása genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások Rederiválás Embrió mélyhűtés

123 Technológiai sor 1. Konstrukció elkészítése 2. Génbeviteli eljárás 3. founder kiválasztása genotipizálás 4. Transzgenikus vonal kialakítása 5. Kísérletezés 6. Egyéb állattechnológiai eljárások Rederiválás Embrió mélyhűtés

124