TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLITÁSA ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI. BŐSZE ZSUZSANNA MTA Doktora MEZŐGAZDASÁGI BIOTECHNOLÓGIAI KUTATÓKÖZPONT 2013

Átírás

1 TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLITÁSA ÉS ALKALMAZÁSI TERÜLETEI BŐSZE ZSUZSANNA MTA Doktora MEZŐGAZDASÁGI BIOTECHNOLÓGIAI KUTATÓKÖZPONT 2013

2 TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS Eredet az egyik legkésőbben háziasított állatfaj, őse az üregi nyúl (Oryctogalus cuniculus) az üregi nyúl az utolsó jégkorszak után terjedt el Spanyolországból, részben oly módon hogy királyi vadas parkokba telepítették Klasszikus alkalmazási területei fiziológia vizsgálatok pl. vérkeringés, vérnyomás, toxicítás vizsgálatok pl. gyógyszerek tesztjei ellenanyag termelés értékes szarvasmarha embriók szállítása Gyakorlati alkalmazás hús, szőrme és angóra fonal hobby állat

3

4 Transzgenikus nyúl előállítása mikroinjektálássalsematikus ábra Donor nőstény Petevezető Embriótartó pipetta DNS Előmag mikroinjektálás Embrióbeültetés Álvemhes nőstény PCR analízis Southern analízis

5 TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLÍTÁSA MIKROINJEKTÁLÁSSAL Hormon kezelések: Donorok 6x FSH vagy 1xPMSG HCG+ 2x termékenyít Recipiensek HCG vagy GnRh Embrió transzfer sebészeti vagy laparoszkópos eljárással Módszer hatékonysága 1-2% transzgénikus alapító/ injektált és beültetett embrió

6 PLAZMID ALAPÚ TRANSZGÉN ELVI SZERKEZETE IRES (internal ribosomal entry site) = vírus eredetű DNS szekvencia, amely lehetővé teszi a transzláció iniciációját a mrns 5 CAP-tól függetlenül

7

8

9 Fényképalbum szerző: Bősze Zsuzsanna

10

11 Transzgenikus nyúl előállítása mikroinjektálással saját felvételek

12 A véletlenszerű transzgén beépülés és a célzott génbeépítés összehasonlítása Hagyományos előmag mikroinjektálással random, véletlenszerű transzgén beépülést tudunk elérni, sem a beépülés helyét sem a beépült transzgén kópiaszámot nem tudjuk meghatározni

13 Problémák a hagyományos mikroinjektálással:a véletlenszerűen beintegrálódó transzgén kromoszómális környezete által okozott változások a transzgén kifejeződésében-pozíció effektust eredményeznek

14 A sejtmagban a gének expressziós doménekbe szerveződnek

15 3D functional architecture of the nucleus in animal and plant kingdoms Visualization of genomic regions of different sizes by FISH. J. Localization of genes encoding casein (green) andwhey acidic protein (white) in the nucleus of HC11 cells after hybridization with gene specific BAC probes and DNA staining with propidium iodide(red). K. Localization of 3 genomic regions (about 100 kbp) with 3 BAC probes (2 in green and one in red) in an A. thaliana leaf nucleus L. Territory of chromosome 15 (green) in the nucleus of a cultured rabbit embryonic fibroblast; DNA counterstained with propidium iodide (red)

16 Megoldás:a pozíció hatás kivédése nagy méretű kromoszóma darabok bejuttatásával

17 Véletlenszerűen integrálódott transzgénre ható távoli szabályozó elemek

18 centromer FLT3LG FCGRT FcRn génje telomer MAR helyek keresése az IgG kötő FcRn régióban

19 BAC TRANSZGENIKUS EGÉRMODELL LÉTREHOZÁSA Az IgG kötő FcRn szerepe a transzcitosisban és az IgG katabolizmusában vizsgálatára Bender és mtsai. Transgen Res. 16: Rojas and Apodaca Nat Rev Mol Cell Biol Ghetie and Ward Immunol Res.

20 BAC transzgenezis előnyei Integrációs helytől független, kópiaszámfüggő génkifejeződés. Az endogén génnel megegyező szövet- és fejlődésspecifikus kifejeződés függetlenül attól, hogy milyen más emlősből származik a transzgén. Alkalmas a géntől nagy távolságban elhelyezkedő szabályozó elemek vizsgálatára.

21 MM # 14# 19# BAC 1. BAC 128E04 5 vég 2. FLT3LG 3. LOC FCGRT -lánc kódoló gén 5. LOC LOC LOC BAC 128E04 3 vég BAC128E04: 107 kb centromer R E L A T I V E P O S I T I O N ( B a s e P a i r s ) FLT3LG LOC FCGRT LOC LOC LOC telomer

22 Ct value Ct value Kópiaszám meghatározása Real-Time PCR-rel QPCR_b_actin QPCR_bFcRn Slope: ± 0.27 R2: Slope: ± 0.19 R2: logq logq #line gene Ct Absolute quantity of gene in sample (AGN) Absolute quantity of cell number in sample (ACN) bfcrn copy number (ACNb- FcRn/ACN) Estimated copy number of bfcrn transgene in a diploid hemizygous animal Mouse -actin 31, , ,248 bfcrn 28, ,48 2,04 2 Mouse -actin 30, , ,722 bfcrn 27, ,18 5, # vonal heterozigóta: 2 kópia homozigóta: 4 kópia 19# vonal heterozigóta: 5 kópia homozigóta: 10 kópia

23 denzitás denzitás B. Kópiaszám függő expresszió kimutatása lu n g liv e r n e w b o rn in te s tin e A. Western blot 500 bp (tüdő szövetből) Northern blot (máj szövetből) C WT b o v # 1 4 h e ho * ** # 1 9 h e ho totalrna bfcrn B * K (B4 sejtvonal) 2. FVB/N egér 0 kópia C # 2 kópia 4. 19# 5 kópia WT bov 2 ine integrált bfcrn gének száma 1. FVB/N egér 0 kópia 2. Szarvasmarha 2 kópia 3. 14# 2 kópia heterozigóta 4. 14# 4 kópia homozigóta * 5. 19# 5 kópia heterozigóta 6. 19# 10 kópia homozigóta * ** tot bf

24 A laboratóriumi nyulat poliklonális ellenanyag termelésre használják világszerte

25 Percent remaining (%) days; AVG SEM Total IgG (mg/ml) SEM IgG védelem az FcRn transzgenkus nyúlban A B Half-life of C Elimination of OVA-spec IgG in vivo rabbit IgG TG (+/+) WT * Total IgG * 10 7 Time (days) 14 0 WT TG (+/+) 0 WT TG (+/+)

26 ALTERNATÍV MÓDSZER A MIKRONJEKTÁLÁSHOZ: LENTIVIRUS VEKTOROKKAL TÖRTÉNŐ TRANSZGÉN BEVITEL

27 HARMADIK GENERÁCIÓS LENTIVÍRUS VEKTOROK ELŐÁLLÍTÁSA

28 A PRONUKLEUSZ MIKROINJEKTÁLÁS ÉS SZUBZONÁLIS LENTIVÍRUS TRANSZDUKCIÓ MÓDSZER ÖSSZEHASONLÍTÁSA (Fassler R. EMBO Reports )

29

30 LENTIVÍRUS TRANSZGENEZIS ÖSSZEHASONLÍTÁSA A MIKROINJEKTÁLÁSSAL ÖSSZEHASONLÍTOTT TULAJDONSÁGOK MIKROINJEKTÁLÁS TRANSZGÉN MÉRETHATÁR 50 KB (PLAZMID) 8 KB LENTIVÍRUS TRANSZDUKCIÓ EMBRIÓ TÚLÉLÉS ALACSONY MAGAS 70% TRANSZGENIKUS UTÓDOK ARÁNYA INTEGRÁLÓDOTT TRANSZGÉN KÓPIASZÁM % /FAJTÓL FÜGGŐEN/ ÁTLAGOSAN 1-5 (50) KONKATAMER EGY HELYRE % EGY HELYRE MINDIG CSAK 1 DE TÖBB HELYRE IS BEÉPÜLHET

31 Zöld jelzőgént kifejező egér előállítása lentivírus transzgenezissel Bősze Zs. és munkatársai-kvell K. (Pécsi Egyetem) Transgen Res. 19:

32 Lenti vírus transzgenezis gazdasági állatokon Fiziológiai és anatómiai modell Betegség modell Xenotranszplantáció Hoffmann et al. (2003)

33 Zöld jelzőgént kifejező transzgenikus nyúl lentivírus transzgenezissel Hiripi és mtsai. Transgenic Res Jan 13. [Epub ahead of print]

34 EGFP EXPRESSZÁLLÓ LENTVÍRUS TRANSZGENIKUS EMBRIÓK ÉS NYÚL- SAJÁT EREDMÉNYEK

35 LENTIVÍRUS TRANSZGENIKUS UTÓD 14 napos p.c. embrió A,B: nem transzgenikus C,D: transzgenikus embrió A B C D

36 SIV9 BT liver Control liver Control heart Control cerebellum SIV9 BT liver SIV9 BT kidney SIV9 BT spleen SIV9 BT lung SIV6 JT cerebellum SIV6 JT spleen SIV6 JT pancreas SIV6 JT kidney SIV6 JT lung SIV9 BT liver SIV6 JT skin SIV6 JT heart SIV6 JT liver Control lung Control kidney Control pancreas Control spleen Control skin SIV3 F1 placenta Dead #1 (SIV9 JTBT F1) Dead #2 (SIV9 JTBT F1) SIV6 JT ear SIV9 JTBT ear SIV9 BT ear SIV9 JKK ear SIV7 JKK ear SIV7 JT ear SIV3 F1 placenta SIV10 JBK+JT ear SIV7 BKK ear SIV9 JBK ear SIV9 BT heart SIV9 BT skin SIV9 BT cerebellum SIV9 BT pancreas SIV9 BT liver 35 kda 5 l / slot 35 kda 7 l / slot 7 l / slot 35 kda LENTIVÍRUS TRANSZEGIKUS ALAPÍTÓ NYULAK WESTERN ANALÍZISE

37 YFP YFP Működési mechanizmus YFP - transzpozáz - genom

38 3,5 napos YFP-t expresszáló blasztociszta Transzgénikus blasztociszta

39 Kimosott embriók Beültetett embriók Recipiens/ ellések Transzgén utódok/ összes Transzgénikus vonalak /10 40 % 7/46 15 % 4 Alapítók F1 generációs TG utódok

40 AZ ALKALMAZOTT MÓDSZEREK ELŐNYEI ÉS HÁTRÁNYAI BAC transzgenezis Lentivírusos transzgenezis SB transzpozon rendszer Hatékonyság 1-6 % % 15 % Kapacitás >2 Mb <10 kb <6 kb Integráció random random random (TA) Integráció formája konkatamer egyedi egyedi Expresszió % % 100 % Örökítés

41 ÚJGENERÁCIÓS MÓDSZEREK TRANSZGÉNIKUS NYÚL ELŐÁLLÍTÁSRA Mesterséges kromoszóma /BAC/ mikroinjektálása Lentivírus transzdukcióval először hoztunk létre GFP-TR-nyulat Transzpozon/ sleeping beuty/ mediált transzgén beépülés először hoztunk létre Venus-TR-nyulat Tervezett:célzott génkiütés ZFN nukleázzal Bender és mtsai. Transgenic Res. 2007;16(5): Hiripi és mtsai. Transgenic Res. 2010, 19(5): Catunda és mtsai. PlosOne (1):e28869.

42 Zinc Finger Proteins = DNA transcription factors Sequence specific DNA-binding proteins The "classic zinc finger protein -2 Cys, 2 His and 3 hydrophobic AA: framework of tertiary folding -first described in the mid 80s -ZFP ~2-3 % of genes in many species!

43 Cys2His2 sequence specific DNA-binding proteins The individual zinc finger domains typically occur as tandem repeats with two, three or more fingers comprising the DNA-binding domain of the protein. These tandem arrays can bind in the major groove of DNA and are typically spaced at 3-bp intervals. The α-helix of each domain (often called the "recognition helix") can make sequence specific contacts to DNA bases

44 Zinc Finger Nucleases or chimeric nucleases Kim et al. PNAS 93: The two monomer subunit dimerization activates the FokI endonuclease to create double strand break If the zinc finger domains are perfectly specific for their intended target site then even a pair of 3-finger ZFNs that recognize a total of 18 basepairs can theoretically target a single locus in a mammalian genome.

45 Quantifying ZFN efficiency The mismatch assay consists of amplifying the target region from ZFNtreated genomic DNA via standard PCR. Resultant PCR products are denatured and allowed to re-anneal. A fraction of re-annealed products will contain bulges of DNA where heterogeneous mismatches occur. A mismatch sensitive enzyme Cel I is added to the reaction, cleavage of the DNA duplexes occur at the site of the nucleotide mismatch. PCR pools are analyzed via PAGE and sequencing. Surveyor mutation detection kit Transgenomic Inc.

46 ZFN-driven Targeted Gene Knockout or Homologous Recombination Eukaryotic cells bone marrow (IL2Rγ) CD4+ T cells (CCR5) CHO human ES and ips cells Rat one-cell embryos Porteus & Baltimore, Science 2003 Perez et al., Nat. Biotech, 2008 Santiago et al., PNAS 2008 Liu et al Hockemeyer et al. Nat. Biotech Geurts et al., Science 2009 Mashimo et al. PlosOne 2010

47 X-SCID KNOCKOUT RAT /Mashimo et al. Plos One /

48 EGYÉB ALTERNATÍV MÓDSZEREK TRANSZGENIKUS NYÚL ELŐÁLLITÁSÁRA SZOMATIKUS SEJTBE TÖRTÉNŐ GÉNBEVITEL MAJD KLÓNOZÁS Transzgenikus felnőtt fibroblaszt sejtek Tg(Wap-GH1) gén marker mikrosebészeti eljárással enukleált blasztomerbe juttatva egy két sejtes nem transzgenikus embrió egyik sejtjébe, 1.2% transzgenikus utód /Skrzyszowska és mtsai Biol Reprod. 76: SPERMÁVAL TÖRTÉNŐ GÉNBEVITEL Exogén DNS/DMSO inkubálása spermával,majd herébe történő injektálása, 36 élő tr nyúl /56,3%/ PCR és Southern is. /Shen és mtsai. Mol Reprod Dev. 73: / 85-ből 29 (34.1%) IVF embrió transzgenikus lett DMSO mediált spermába történő transzgén bevitelnél. 21-ből 17 tr nőstény nyúl termelt humán lactoferrint a tejében 153 ug/ ml mennyiségben /Li és mtsai. Reprod Fertil Dev. 18: / NINCS ÚJABB KÖZLEMÉNY EGYIK MÓDSZERREL SEM!!

49 TRANSZGENIKUS NYULAK FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEI BIOFARMING GYÓGYHATÁSÚ FEHÉRJÉK VAGY PEPTIDEK TERMELTETÉSE GÉNMÓDOSÍTOTT ÁLLATOK TEJÉBEN HUMÁN BETEGSÉGEK MODELLÁLLATAI LIPID ANYAGCSERE ÉS ÉRELMESZESEDÉS SZÍVNAGYOBBODÁSSAL JÁRÓ KÓRESETEK SZÍVRITMUS ZAVAROK

50 SAJÁT BIOFARMING EREDMÉNYEINK MEZŐGAZDASÁGI BIOTECHNOLÓGIAI KUTATÓKÖZPONT GÖDÖLLŐ TRANSZGENIKUS NYÚLTEJBEN TERMELT FEHÉRJÉK HUMAN VIII VÉRALVADÁSI FACTOR /Hiripi et al. DNA and Cell Biology / HUMAN SZÖVETI NEM SPECIFIKUS ALKALIKUS FOSZFATÁZ (TNAP) /Bodrogi et al. Transgenic Research / FENILALANIN MENTES KAPPA KAZEIN /Baranyi et al. J. Biotechnology /

51 FONTOS WEB HELYEK BioProtein Technologies tr nyúlon alapuló ellenanyag, peptid, fehérje vakcina termelés PHARMING humán C1 inhibitor Örökletes Angioödéma- III fázisú klinikai kísérletek GFP Bunny transzgenikus állatok ihlette művészeti alkotások