Az élettudományi-klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 ELLENANYAGOK ÉS SZÁRMAZÉKAIK 9. előadás PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM ÁLTALÁNOS ORVOSTUDOMÁNYI KAR GYÓGYSZERÉSZI BIOTECHNOLÓGIA TANSZÉK
ANTIGÉN
MI AZ ANTIGÉN? Az az anyag, ami immunválaszt indukál és ellenanyagtermelést indít meg Az epitóp az antigén determináns Az ellenanyag lehet fehérje, szénhidrát vagy egyéb természetű Antigén: haptén (5-10 kd >) carrier natív vagy módosított molekulák, sejtek
AZ ANTIGÉN KLÓNOZÁSA Plazmid DNS Beillesztett DNS A plazmid DNS szekvencia felnyitása endonukleázzal A DNS szekvencia beillesztése, ligálása A plazmid a baktériumban felszaporodik Baktériumban transzformálás Baktérium kolóniák Számos DNS kópia Fehérjetermelés és tisztítás immunizáláshoz
IMMUNIZÁLÁS
AZ ANTIGÉN ADMINISZTRÁLÁSI MÓDJÁNAK KIVÁLASZTÁSA TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Intraperitoneális (hasba) Intravénás (vénás érbe) Intramuszkuláris (izomba) Szubkután (bőr alá) Intrakután (bőrbe) Per os (szájon át)
ADJUVÁNSOK Az adjuvánsok lassítják az antigén felszívódását és az immunrendszer nem specifikus stimulációja révén fokozzák az ellenanyag termelést. Leggyakoribb típusaik: Ásványolaj-alapú, inkomplett adjuvánsok (pl.: inkomplett Freund) Komplett Freund: ásványolaj keverékben szuszpendált, hővel elölt Mycobacterium tuberculosis Aluminium-hidroxid gél Muramil-dipeptid (Mycobacterium tbc.) Bakt. vakcinák egyidejű adása fokozza az immunogénekkel szembeni antitest termelést. Pl.: Bordetella pertussis Liposzóma
AZ ELLENANYAG TÍPUSÁHOZ A TERMELŐ ÉLŐLÉNY KIVÁLASZTÁSA IS SZÜKSÉGES TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 Monoklonális antitesthez: egér hörcsög vagy patkány Poliklonális antitest (leggyakoribbak): nyúl birka kecske, stb.
POLIKLONÁLIS ELLENANYAG
POLIKLONÁLIS ELLENANYAG I. Egy antigén felületén számos epitóp, azaz antigén determináns található, amely immunválasz kiváltására képes Az antigén determinánsok ellen egyenként egyegy B-sejt kezd el ellenanyagot termelni Az élő szervezetben egy antigén ellen az ellenanyagok keveréke található, amely számos B-sejtből, B-sejtek sok klónjából származik
POLIKLONÁLIS ELLENANYAG II. több, eltérő specificitású ellenanyag keveréke több B-sejt klón termékei egy adott antigén eltérő epitópjait ismerik fel
POLIKLONÁLIS ELLENANYAG III. Antigén Epitóp 1. Epitóp 2. Epitóp 3. B-sejt 1. B-sejt 2. B-sejt 3.
MONOKLONÁLIS ELLENANYAGOK
MONOKLONÁLIS ELLENANYAG Egyetlen B-sejtből származó sejtvonal (sejtklón) termeli Egyetlen epitóp felismerésére képesek
HOGYAN LEHETSÉGES A MONOKLÓN ELŐÁLLÍTÁSA? A normál immunválasz poliklonális, azaz több B- sejtből származó sejtvonal (sejtklón) termeli, amely klónok mind más epitópot ismernek fel. Egyetlen epitóp (epitóp 1) felismerésére képes B-sejteket ki kell válogatni a más epitópot (epitóp 2, 3, 4, stb) felismerő B-sejtek közül.
HIBRIDÓMA TECHNIKA Kiválasztott antigénnel aktivált immunsejtek (plazmasejtek) Tumorsejtek Aktivált B/plazma-sejtek és tumorsejtek in vitro fúziója A korlátozott osztódási képességű, de specifikus ellenanyagot termelő sejt korlátlan ideig fenntartható in vitro
HIBRIDÓMA TECHNIKA Myeloma sejt Plazmasejt Korlátlan osztódás Ellenanyag termelés Hybridoma sejt Korlátlan osztódás és ellenanyag termelés
MONOKLONÁLIS ELLENANYAG Az egér immunizálása Z ellenanyaggal Egér lép sejtek keveréke; Egyes sejtek ( ) ellenanyagot termelnek az antigén epitópjai (Z2, Z3) ellen Mutáns egér myeloma sejtek (nem képesek HAT médiumban növekedni) Z3 A A sejtek összekeverése és fúzionáltatása HAT médiumban tenyésztés A sejteket egyenként (!), tenyésztjük tovább A nem fúzionált sejtek ( ) elpusztulnak A fúzionált sejtek ( ) osztódnak A A Z3 A Z2 Z3 A Z3 A Z2 Z3 A Az ellenanyagtermelést (minőség, mennyiség, specificitás) egyenként teszteljük
ELLENANYAGOK TISZTÍTÁSA
OSZLOP KROMATOGRÁFIA Minta Az oldószert folyamatosan adagoljuk az oszlopra egy megfelelő méretű tartályból Idő A szétválasztott molekulák frakcióit eluáljuk és összegyűjtjük
ION-CSERÉLŐ KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás Pozitívan töltött gyöngyök Gyöngyhöz kötődő negatív töltésű molekula Szabadon áramló pozitívan töltött molekulák
GÉL SZŰRÉSES KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás Lyukacsos gyöngyök Lelassított kismolekulák Gyorsan átfolyó nagymolekulák
AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA Oldószer áramlás Gyöngyök, melyekhez kovalens kötéssel kapcsolt szubsztrát található Szubsztráthoz kötődött enzim molekula A szubsztrátra nem specifikus fehérjék átfolynak az oszlopon
FLUORESZCENSEN VAGY ENZIMATIKUSAN JELZETT ELLENANYAGOK
ELLENANYAG KONJUGÁLÁSA Fluroeszcens festék pl.: FITC (zöld) Enzim pl.: HRPO Biotin Radioaktív sugárzók Toxin (pl ricin)
TERÁPIÁS ELLENANYAGOK
TERÁPIÁS, ENGEDÉLYEZETT ELLENANYAGOK Termék neve Specificitása Típusa Alkalmazási terület Év Orthoclone OKT3 CD3 egér Transzplantátum rejekció 1986 ReoPro GpIIb/gpIIa kiméra Fab Kardiovaszkuláris betegségek 1994 Rituxan (mabthera) CD20 kiméra Non-Hodgkin lymphoma 1997 Zenapax CD25 humanizált Transzplantátum rejekció 1997 Remicade TNFα kiméra Crohn betegség, rheumatoid arthritis 1998 Simulect CD25 kiméra Transzplantátum rejekció 1998 Synagis RSV humanizált Respiratorikus synctitium vírusfertőzés 1998 Herceptin Her-2 humanizált Metasztatikus emlőrák 1998 Mylotarg CD33 humanizált Akut myeloid leukémia (AML) 2000 Campath CD52 huamnizált B sejtes krónikus limfoid leukémia (B-CLL) 2001 Zevalin CD20 egér B sejtes non-hodgkin-lymphoma 2002 Erbitux EGFR kiméra Colorectális carcinoma (EGFR+ tumorok?) 2004 Avastin VEGF humanizált Colorectális carcinoma 2004 Tysabri α4β1/7 integrin humanizált Sclerosis multiplex 2004
KIMÉRA ANTITESTEK A kiválasztott rágcsáló monoklonális antitest Fv régióját kódoló gének hozzákapcsolása humán antitest Fc régióját kódoló génhez A kiméra antitestek kb. 75%-a emberi fehérje Az antigén specificitása azonos az eredeti rágcsáló antitestével Az in vivo féléletideje és az effektor funkciói az emberi antitestével azonosak DE: Immunugének!
HUMANIZÁLT ANTITESTEK A kiválasztott rágcsáló monoklonális antitestjének CDR régiója humán antitest génbe klónozva A humanizált antitestek > 90%-a emberi Az antigén specificitása azonos az eredeti rágcsáló antitestével Az in vivo féléletideje és az effektor funkciói az emberi antitestével azonosak
AZ ELLENANYAGOK ELNEVEZÉSE mab xi zu li tu ci u o Monoklonális antitest Kiméra antitest Humanizált antitest Immunomoduláns antitest Tumor ellenes antitest Kardiovaszkuláris betegségben használható antitest Humán Rágcsáló
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET JELEN MUNKA AZ EURÓPAI UNIÓ TÁMOGATÁSÁVAL, AZ EURÓPAI SZOCIÁLIS ALAP TÁRSFINANSZÍROZÁSÁVAL VALÓSUL MEG, AZ ÉLETTUDOMÁNYI-KLINIKAI FELSŐOKTATÁS GYAKORLATORIENTÁLT ÉS HALLGATÓBARÁT KORSZERŰSÍTÉSE A VIDÉKI KÉPZŐHELYEK NEMZETKÖZI VERSENYKÉPESSÉGÉNEK ERŐSÍTÉSÉRE CÍMŰ, TÁMOP-4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 AZONOSÍTÓSZÁMÚ PROJEKT KERETÉBEN.