!HU000003218T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 003 218 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 723 (22) A bejelentés napja: 03. 03. 21. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 0723 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1487466 A1 03.. 09. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1487466 B1 08. 01. 09. (1) Int. Cl.: A61K 3/74 (06.01) A23L 1/03 (06.01) A61P 1/00 (06.01) A61P 29/00 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 0827 PCT/FR 03/000903 () Elsõbbségi adatok: 0003891 02. 03. 28. FR (72) Feltalálók: FIORAMONTI, Jean, F-311 ROQUETTES (FR); BUENO, Lionel, F-318 AUSSONNE (FR); THEODOROU, Vassilia, F-311 PORTET-SUR-GARONNE (FR); LAMINE, Florence, F-310 TOULOUSE (FR) (73) Jogosult: INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE (INRA), 7007 Paris Cédex 07 (FR) (74) Képviselõ: dr. Svingor Ádám, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda KFt., Budapest (4) Lactobacillus farciminis alkalmazása emésztési rendellenességek megelõzésére vagy kezelésére (7) Kivonat A találmány tárgyát képezi Lactobacillus farciminis fajba tartozó tejsavbaktériumok alkalmazása az emésztõcsõ rendellenességeinek, elõnyösen a bél akut és krónikus gyulladásos kórképeinek a kezelésére és megelõzésére. HU 003 218 T2 A leírás terjedelme oldal (ezen belül 3 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
A találmány tárgyát képezi Lactobacillus farciminis alkalmazása emésztési rendellenességek, elõnyösen funkcionális vagy gyulladásos rendellenességek megelõzésére vagy kezelésére. Az emésztõcsõ és elsõsorban a bél számos rendellenessége kisebb-nagyobb mértékben gyulladásos jelenségekkel függ össze. Ilyen rendellenességek közé tartoznak az alábbiak: a belek krónikus gyulladásos betegségei, amelyek közül a Crohn-betegség és a hemorrhagiás rectocolitis alacsony prevalenciájú rendellenességeknek számítanak, amelyek gyakorisága azonban emelkedõben van. Ezeket a súlyos elesettséget okozó betegségeket változó súlyosságú, néha elnyújtott remissziós fázissal járó gyulladásos rohamok jellemzik. A jelenlegi terápia elsõsorban fõleg kortikoidok és ¹ASA (¹amino-szalicilsav) adagolásán, a legsúlyosabb esetekben sebészeti beavatkozáson alapul. Javasoltak bizonyos citokinekkel történõ kezelést, azonban ezek kísérleti stádiumban vannak és költségesek; funkcionális emésztési rendellenességek (FER troubles fonctionnels digestifs, TFD), amelyek alacsony morbiditású rendellenességnek számítanak, prevalenciájuk azonban nagyon magas. A fõ tünet zsigeri fájdalom, azonban gyakran jár együtt más emésztési (hasmenés, székrekedés vagy a kettõ váltakozása) és nem emésztési (fáradékonyság) tünetekkel. Kórélettanuk nem pontosan ismert (gastrointestinalis motilitás megváltozása, pszichoszociális faktorok, emésztõszervi gyulladások és sebészeti beavatkozások utóhatásai), azonban a kórképek legfõbb jellemzõje az emésztõcsõ falának a disztenziójára jelentkezõ fájdalmas túlérzékenység. E túlérzékenység eredete nem ismert, bár gyulladásos eredetet feltételeznek, mert a FER hónapokig elhúzódik akut gastroenteritisben szenvedõ betegek nagy részében, és mert gyulladásos utóhatásokat (hízósejtek hiperpláziája) mutatnak ki FER-betegek emésztõszervi nyálkahártyájában. Számos munkacsoport számolt be probiotikus mikroorganizmusok hatásáról összefüggésben az emésztõcsõ ezen rendellenességeinek a kezelésével. Probiotikum elnevezés alatt különbözõ családhoz, rendhez és fajhoz tartozó, élõ mikroorganizmusok csoportját értik, amelyeket megfelelõ számban fogyasztva, egészségre pozitív hatást fejtenek ki, a szokásos táplálóhatáson túl. Probiotikumok kísérletes emésztõszervi gyulladások kezelésére való hatékonyságát mutató vizsgálatokat végeztek Lactobacillus reuteri [Fabia és munkatársai: Scand. J. Gastroenterol. 28, 1 162. (1993); Holma és munkatársai: Scand. J. Gastroenterol. 36, 6 63. (01) és Lactobacillus plantarum [Mao és munkatársai: Gastroenterology 111, 334 344. (1996)] organizmusokkal. A közelmúltban, embereken végzett vizsgálat mutatta ki Saccharomyces boulardii hatékonyságát Crohn-betegség megelõzésében és kiújulásában [Guslandi és munkatársai: Dig. Dis. Sci. 4, (00)]. További probiotikumok mutattak hatékonyságot hemorrhagiás rectocolitis esetében: Escherichia coli Nissle [Kruis és munkatársai: Aliment. Pharmacol. 1 2 3 4 0 Ther. 11, 83 88. (1997); Rembracken és munkatársai: Lancet 34, 63 639. (1999)], Bifidobacterium, Lactobacillus és Streptococcus törzsek kombinációja [Venturi és munkatársai: Aliment. Pharmacol. Ther. 13, 13 18. (1999)] és Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve és Lactobacillus acidophilus kombinációja [Ishikawa és munkatársai: Gastroenterology 118, 4171. (00)]. Ami a funkcionális rendellenességeket és az irritábilisvastagbél-szindrómát illeti, az eredmények kevésbé meggyõzõek: egy tanulmány kimutatta, hogy Saccharomyces boulardii mérsékelte a funkcionális emésztõszervi rendellenességekhez társuló hasmenést, azonban nem befolyásolta az egyéb tüneteket [Maupas és munkatársai: Méd. Chir. Dig. 12, 77 79. (1983)], és egy másik tanulmány Lactobacillus és Escherichia coli törzsek kombinációjának hatástalanságát ismerteti nem ulceráló dispepsia kezelésében [Hentschel és munkatársai: Gastroenterology 112, suppl. 1, A146 (1997)]; megfigyelték a Lactobacillus plantarum pozitív hatását az irritábilisvastagbél-szindróma számos tünetére (szélszorulás, hasi fájdalom), azonban ezek a hatások a hasifájdalom-kritériumok esetében a placebóéhoz hasonlítottak [Nobaek és munkatársai: Am. J. Gastroenterol. 9, 1231 1238. (00)]; egy további, az irritábilisvastagbél-szindróma három tünetével (fájdalom, székletsürgõsség, felfúvódás) foglalkozó tanulmány Lactobacillus casei CG hatásának a hiányáról számol be [O Sullivan és munkatársai: Dig. Liver Dis. 32, 294 1. (00)]. Úgy tûnik tehát, hogy probiotikus mikroorganizmusok alkalmazása az emésztõcsõ gyulladásos rendellenességeinek a kezelésére bíztató megközelítés, amelynek hatékonysága azonban változó, egyrészt az alkalmazott mikroorganizmus szerint, másrészt a vizsgált kórkép vagy kóros tünet szerint. Igény mutatkozik tehát erre a célra alkalmazható, további mikroorganizmusok azonosítására, hogy szélesítsük a terápiás lehetõségek skáláját. Felfedeztük, hogy a Lactobacillus nemzetségbe tartozó farciminis faj tejsavbaktériumai aktivitást mutattak in vivo az emésztõcsõ, elsõsorban a vastagbél gyulladására és a zsigeri fájdalomra. Megállapítottuk, hogy a Lactobacillus farciminis gyulladás elleni aktivitása a baktérium által az emésztõcsõ lumenében in situ termelt nitrogén-monoxidnak (NO) tulajdonítható. A Lactobacillus farciminis a Lactobacillus nemzetség (szigorúan homofermentor) I¹es csoportjába tartozik. Gyakran fordul elõ különbözõ élelmiszertermékekben, például húskészítményekben, elsõsorban kolbászféleségekben, valamint élesztõben [De Rossard és Luquet: Bactéries lactiques, I. kötet: Aspects fondamentaux et technologiques, Lorica, (1998)]. Nitrogénmonoxidnak Lactobacillus farciminis által, tenyészetben történõ termelõdésérõl Wolf és munkatársai számoltak be [Int. J. Food Microbiol., 323 329. (1990)]. Számos megfigyelés vetette fel a nitrogén-monoxid lehetséges szerepét az emésztési funkciók szabályozásában és/vagy az emésztõrendszer nyálkahártyájának a védelmében. Ismeretes, hogy az intestinalis epit- 2
1 2 3 4 0 helium néhány sejtje képes nitrogén-monoxid termelésére bizonyos progyulladásos citokinekkel és/vagy enteroinvazív baktériumok lipopoliszacharid (LPS) toxinjaival történõ indukciót követõen [Witthoft és munkatársai: Am. J. Physiol. 27, G64 71. (1998)]. Errõl az endogén nitrogén-monoxidról feltételezik, hogy antimikrobiális tulajdonságai révén részt vesz patogén mikroorganizmusok elleni védelemben. Feltételezik továbbá, hogy alacsony mennyiségben termelõdve, részt vesz az intestinalis nyálkahártya védelmében. Feltételezik azonban, hogy nagyobb mennyiségben hozzájárul a krónikus gyulladásos állapot kiváltásában és fenntartásában [Alican és Kubes: Am. J. Physiol. 270, G22 337. (1996); Tepperman és munkatársai: J. Pharmacol. Exp Ther. 271, (1994)]. Ami az exogén nitrogén-monoxidot illeti (azaz amit táplálékkal vagy gyógyhatású készítménnyel viszünk be), a megfigyelt hatások szintén ellentmondóak; megfigyelték NO¹donorok átmeneti védõhatását a gyomornyálkahártyán etanollal kiváltott léziókkal szemben [Mac Naughton és munkatársai: Life Sci. 4, 1869 1876. (1989)], valamint védõhatását sósavval kiváltott léziókkal szemben [Kitagawa és munkatársai: J. Pharmacol. Exp. Ther. 23, 1133 1137. (1990)]. További vizsgálatok kimutatták, hogy NO¹donorok lokális intraartériás infundálása eltérõ hatásokat okozhatnak a gyomornyálkahártya hemorrhagiás károsodására: védõhatást, hatás hiányát vagy káros hatást figyeltek meg a NO¹donortól és az alkalmazott dózistól függõen [Lopez-Belmonte és munkatársai: Br. J. Pharmacol. 8, 73 78. (1993)]. Jelenleg ismerünk néhány probiotikus mikroorganizmust, amelyek hatásukat, legalább részben, az endogén NO¹termelés befolyásolása révén fejtik ki. A PCT WO 00/28943 számú nemzetközi közzétételi irat ismerteti, hogy néhány tejsavbaktérium-törzs, elsõsorban Lactobacillus casei törzsek, gyulladásellenes hatást fejtenek ki azáltal, hogy fokozzák progyulladásos citokinek által aktivált enterociták NO¹termelését, és ezzel szemben csökkentik a progyulladásos citokinek és bakteriális lipopoliszacharidok által aktivált enterociták NO¹termelését. Korhonen és munkatársai [Inflammation 2, 223 232. (01)] kimutatták, hogy a Lactobacillus rhamnosus GG törzs, amely aktivitást mutat vírus által vagy antibiotikum által kiváltott hasmenésben, fokozhatja az intestinalis epithelsejtek által, vagy progyulladásos citokinek által aktivált makrofágok NO¹termelését, és utal arra, hogy ez a NO¹termelésre gyakorolt hatás a Lactobacillus rhamnosus aktivitásának tulajdonítható. A NO¹t közvetlenül termelõ mikroorganizmusok lehetséges probiotikus hatását eddig igen korlátozott mértékben vizsgálták. A PCT WO 98/27991 számú nemzetközi közzétételi irat Propionobacter nemzetségbe tartozó, NO¹t termelõ baktériumok alkalmazását javasolja olyan készítmény elõállítására, amely élettani szempontból jelentõs mennyiségû NO¹t termel az emésztõcsõben, és a készítmény intestinalis motilitásra gyakorolt hatásáról számol be. Ez a dokumentum ismerteti a Lactobacillus farciminis baktériumot is, azonban az alkalmazásból kizárja azon kísérletes tenyésztési vizsgálatok alapján, amelyek szerint a Lactobacillus farciminis által termelt NO mennyisége túl kevés ahhoz, hogy jelentõséggel bírjon. Szemben a WO 98/27991 számú nemzetközi közzétételi iratban ismertetettekkel, megállapítottuk, hogy a Lactobacillus farciminis az emésztõcsõben elegendõ NO¹t termel ahhoz, hogy terápiás hatást, elõnyösen gyulladás elleni hatást és zsigeri disztenzióval összefüggõ fájdalomra gyakorolt hatást tegyen lehetõvé. A találmány tárgyát képezi Lactobacillus farciminis fajhoz tartozó tejsavbaktérium alkalmazása olyan készítmény elõállításához, amely alkalmas az emésztõcsõ kóros folyamainak a kezelésére és megelõzésére. A Lactobacillus farciminis típustörzs, amelyet a találmányhoz vezetõ vizsgálataink során alkalmaztunk, önmagában jól ismert és számos gyûjteményben megtalálható; megtalálhatók például az alábbi nyilvántartási számok alatt: CIP-3 136T, ATCC 29 644, DSM 184, JCM 97, LMG 90, NCDO 23, NCIB 11 717 és IMET 11 462. A találmány megvalósításához alkalmazhatók továbbá a baktériumot tartalmazó élelmiszertermékekbõl izolált Lactobacillus farciminis törzsek. A találmány egyik elõnyös megvalósítási módja szerint, a fenti készítmény alkalmas az emésztõcsõ, elõnyösen a belek akut és krónikus gyulladásos rendellenességeinek a kezelésére. A találmány további elõnyös megvalósítási módja szerint, a fenti készítmény alkalmas zsigeri fájdalom kezelésére és megelõzésére. A találmány szerint kezelhetõ kórképek közé tartoznak például colitis, enteritis, Crohn-betegség, hemorrhagiás rectocolitis, funkcionális emésztési problémák (irritábilisvastagbél-szindróma és nem ulceráló dispepsia) és mások. Elõnyösen, a fenti készítmény orális beadás céljára alkalmas. A készítmény tartalmazhat egy vagy több Lactobacillus farciminis törzset, bármely olyan kiszerelésben, amely a baktériumokat életben tartja a csomagolás és tárolás különbözõ lépései során, és lenyelésüket követõen, amíg elérik hatásuk helyét az emésztõcsõben. Adott esetben a készítmény tartalmazhat még további, probiotikus vagy nem probiotikus tulajdonságú tejsavbaktériumokat, laktococcusokat és bifidobaktériumokat és/vagy más probiotikus mikroorganizmusokat, mint például élesztõket. A találmány vonatkozásában, a Lactobacillus farciminis baktériumot tartalmazó készítmények beadhatók élelmiszer formájában. Az élelmiszer lehet például fermentált termék, például tejtermék; ebben az esetben a Lactobacillus farciminis lehet alkotórésze a termék elõállításához alkalmazott fermentálóelegynek, vagy más megoldás szerint hozzáadható az elegyhez a fermentálást követõen. Beadhatók továbbá élelmiszer-kiegészítõk formájában, amelyeket élelmiszerhez kell elegyíteni, vagy fogyaszthatók közvetlenül. Elõnyösen, csomagolhatók a kívánt mennyiségû Lactobacillus farciminis baktériumot tartalmazó, egyedi adagok formájában. 3
A találmány megvalósításához a Lactobacillus farciminis baktériumot elõnyösen legalább 6 UFC ( unités formant colonie )/nap adagban, elõnyösebben 8 UFC/nap adagban és még elõnyösebben UFC/nap adagban adjuk be, egyszeri vagy osztott adagban. A találmány jobban érthetõ az alábbi ismertetés segítségével, amely a korlátozás szándéka nélkül mutat be példákat, amelyek egy adott Lactobacillus farciminis törzs tulajdonságait illusztrálják vastagbélgyulladás és disztenzióeredetû zsigeri fájdalom vonatkozásában. 1. példa Lactobacillus farciminis-kezelés hatása TNSB/etanol által kiváltott vastagbélgyulladásra A vastagbél gyulladása (colitis) kiváltható kísérletesen trinitro-benzénszulfonsavval (TNSB), amely a leggyakrabban alkalmazott és legjobban validált kísérletes colitismodell [Morris és munkatársai: Gastroenterology 96, 79 803. (1989)]. Az ilyen colitist mieloperoxidáz (MPO)-aktivitás fokozódása jellemzi, amely a polinukleáris neutrofilsejteknek a vastagbél-nyálkahártyában mutatott infiltrációja fokának a markere, jellemzi továbbá a makroszkóposlézió-pontszám ( score lésionnel macroscopique, SLM) emelkedése, amely a megjelenõ makroszkópos léziók súlyosságát és kiterjedését, a letapadások jelenlétét és súlyosságát és hasmenés jelenlétét vagy hiányát veszi figyelembe. Nátrium-nitrocianid ( nitroprusszid-nátrium, NPN) NO¹donor vagy Lactobacillus farciminis-kezelés hatásait hasonlítottuk össze patkányokban TNBS által kiváltott colitismodellen. Ezen túlmenõen, értékeltük az exogén NO ezen hatásokban játszott tényleges szerepét úgy, hogy NO¹csapdaként hemoglobint (Hb) alkalmaztunk. NPN hatásának a vizsgálata céljából, 0 g testtömegû Wistar-patkányok 7 csoportját altatás alatt vastagbélbe vezetett katéterrel láttuk el (a caeco-colon junkciótól +2 cm¹re), amelyet a dorsoscapuraris régió szintjében kivezettünk. A. napon a patkányoknak intracolonalis úton 80 mg/kg/nap adagban TNBS/etanol oldatot (4 7. csoport) vagy 0,9%¹os NaCl-oldatot (1 3. csoport) csepegtettünk be. Négy órával a becsepegtetést követõen, az állatokat 1 mg/kg/nap adagban NPNoldattal (2. és. csoport), vagy 0 mg/kg/nap adagban Hb¹oldattal (3. és 7. csoport), vagy NPN+Hb elegyével (6. csoport), vagy 0,9%¹os NaCl-oldattal (1. és 4. csoport) infundáltuk, l/óra átfolyási sebesség mellett, 4 napon át. Lactobacillus farciminis hatásának a vizsgálata céljából 0 g testtömegû hím Wistar-patkányok egyedbõl álló, csoportjának szájon át 12 UFC/nap adagban Lactobacillus farciminis baktériumot (2., 4. és. csoport), vagy 0,9%¹os NaCl-oldatot (1. és 3. csoport) adtunk be, 19 napon át. A. napon az állatokat vastagbélbe vezetett katéterrel láttuk el, a fent ismertetettek szerint. A 1. napon az állatok intracolonalis úton, 80 mg/nap adagban TNBS/etanol (3. csoport) oldatot, vagy 0,9%¹os NaCl-oldatot (1. és 2. csoport) kaptak. Négy órával a becsepegtetést követõen, az állatok 0 mg/kg/nap adagban Hb¹ (. csoport), 1 2 3 4 0 vagy 0,9%¹os NaCl-oldatot (1 4. csoport) kaptak, vastagbélbe adott perfúzió formájában, 4 napon át. A 19. napon minden patkányt feláldoztunk, és az izolált vastagbélmintákon értékeltük a vastagbél fala gyulladásának az intenzitását mieloperoxidáz (MPO)-aktivitás és makroszkóposlézió-pontszám (SLM) alapján. I. Mieloperoxidáz-aktivitás (MPO) Az izolált vastagbélmintákon a mieloperoxidáz-aktivitást Bradley és munkatársai által ismertetett eljárással [J. Invest. Dermatol. 78, 6 9. (1982)] határoztuk meg. Az eljárást az alábbiak szerint foglaljuk össze: Az (egy cm hosszúságú) vastagbélszegmenseket foszfátpufferbe (0 mmol/l, ph=6) merítettük. Polytron homogenizátor alkalmazásával, jégen történõ lizálást követõen, 3 ciklus fagyasztást (folyékony nitrogénben, 1 percen át) és olvasztást (37 C¹os vízfürdõben, percen át) végeztünk. Centrifugálást ( 000 rpm, 1 percen át, 4 C¹on) követõen az üledéket 0,%¹os hexadecil-trimetil-ammónium-bromidban (HTAB) vettük fel. Az üledéket ultrahangkezelésnek vetettük alá, mielõtt újra centrifugáltuk. A felülúszót MPO-aktivitás és összfehérje-meghatározás céljára összegyûjtöttük. Az MPO-aktivitást spektrofotometriás eljárással határoztuk meg. A mintát O¹dianizidin-dihidrokloridot (0,167 mg/ml) és 0,000% hidrogén-peroxidot tartalmazó foszfátpufferrel érintkeztettük. Az abszorbanciaváltozásokat ( nm, 2 C¹on) 2 perces kinetikus spektrofotometriás eljárással határoztuk meg, az MPO által katalizált enzimatikus reakció MPO:H 2 O 2 +Cl =H 2 O+HOCl (narancs szín) képlete szerint, és MPO-egységekben (E) adtuk meg. Egy MPO-aktivitás-egység (E) azon MPO-mennyiségként definiálható, amely percenként és milliliterenként 1 M hidrogén-peroxidot degradál 2 C¹on. A proteinek koncentrációját (gramm/ml) kereskedelmi forgalomban kapható reagenskészlet (Detergent Compatible Assay, Bio Rad, Ivry/Seine, Franciaország) alkalmazásával határoztuk meg. 1. kezelés NPN-nel Az eredményeket az 1. ábra mutatja. Az 1. ábra felírásai Abszcisszán: =nem kezelt patkányok (1. csoport) =NPN-nel kezelt patkányok (2. csoport) =Hb-vel kezelt patkányok (3. csoport) =TNBS/etanollal kezelt patkányok (4. csoport) =TNBS/etanol+NPN-nel kezelt patkányok (. csoport) =TNBS/etanol+NPN+Hb-vel kezelt patkányok (6. csoport) =TNBS/etanol+Hb-vel kezelt patkányok (7. csoport) Ordinátán=MPO-aktivitás (E MPO/g protein) *: szignifikáns különbség (P<0,01) a kontrollcsoporthoz képest (1. csoport) +: szignifikáns különbség (P<0,01) a TNBS/etanol csoporthoz képest (4. csoport) 4
A colon falának az MPO-aktivitása TNBS/etanol becsepegtetés nélkül, a kontrollokban (1. csoport) és az NPN-nel (2. csoport) vagy Hb¹vel (3. csoport) kezelt állatokban, ebben a sorrendben 263±3, 31±88 és 426±117 E MPO/g protein volt. Ezek az értékek egymáshoz képest nem mutattak szignifikáns különbséget. A TNBS/etanol becsepegtetése szignifikáns mértékben megemelte az MPO-aktivitást a kontrollokhoz képest (346±714 E MPO/g protein). A TNBS/etanollal becsepegtetett patkányokban az NPN-perfundálás (. csoport) szignifikáns mértékben csökkentette az MPOaktivitást (2619±447 E MPO/g protein) azon állatokhoz képest, amelyek kizárólag TNBS/etanol becsepegtetést kaptak. NPN és Hb együttes perfundálása TNBS/etanol becsepegtetést kapott patkányokban (6. csoport) eltörli az NPN által kiváltott csökkenést (47±64 E MPO/g protein), és nem mutatkozik semmilyen szignifikáns különbség a csak TNBS/etanollal becsepegtetett állatokhoz képest (4. csoport; 346±714 E MPO/g protein). 2. kezelés Lactobacillus farciminis baktériummal Az eredményeket a 2. ábra mutatja. A 2. ábra felírásai Abszcisszán: =nem kezelt patkányok (1. csoport) =Lactobacillus farciminis baktériummal kezelt patkányok (2. csoport) =TNBS/etanollal kezelt patkányok (3. csoport) =Lactobacillus farciminis+tnbs/etanollal kezelt patkányok (4. csoport) =Lactobacillus farciminis+tnbs/etanol+hb-vel kezelt patkányok (. csoport) Ordinátán=MPO-aktivitás (E MPO/g protein) *: szignifikáns különbség (P<0,01) a kontrollcsoporthoz képest (1. csoport) +: szignifikáns különbség (P<0,01) a TNBS/etanol csoporthoz képest (3. csoport) A nem kezelt, kontrollpatkányok 237±3 E MPO/g protein MPO-aktivitást mutattak. A TNBS/etanol becsepegtetés colitist vált ki, amelyet MPO-aktivitás emelkedése jellemez (3. csoport; 3900±39 E MPO/g protein). A Lactobacillus farciminis baktériummal történõ kezelésnek nincs hatása a fiziológiás konyhasóoldattal becsepegtetett patkányok MPOaktivitására (2. csoport; 26±31 E MPO/g protein). Ezzel szemben, a TNBS/etanollal becsepegtetett patkányokban, a Lactobacillus farciminis-kezelés szignifikáns mértékben csökkenti az MPO-aktivitást (4. csoport; 90±211 E MPO/g protein). A hemoglobinnal történõ perfundálás eltörli a gyulladás Lactobacillus farciminis által kiváltott csökkenését a TNBS/etanollal becsepegtetett patkányokban (. csoport; 2246±66 E MPO/g protein) II. Makroszkóposlézió-pontszám Az izolált vastagbélmintákon a makroszkóposléziópontszámot Wallace és munkatársai [Gastroenterology 2, 18 27. (1992)] által ismertetett eljárással határoztuk meg, az alábbi értékelõtáblázat szerint. 1 2 3 4 0 Paraméter Pontszám Fekély Normálmegjelenés 0 Fokális hiperaemia fekély nélkül 1 Fekélyesedés hiperaemia nélkül vagy 2 a nyálkahártya megvastagodása Fekélyesedés 1 gyulladásos helyen 3 Fekélyesedés 2 gyulladásos helyen 4 Egy cm¹nél nagyobb kiterjedésû, számos gyulladásos hely Két cm¹nél nagyobb felszínû gyulladásos terület, a pontszám minden feké- 6 lyes cm esetében 1¹gyel növekszik Adhézió Nincs adhézió 0 Enyhe adhézió 1 Erõs adhézió Hasmenés Nincs 0 Van 1 Összes pontszám 1. kezelés NPN-nel Az eredményeket a 3. ábra mutatja. A 3. ábra felírásai Abszcisszán: =TNBS/etanollal kezelt patkányok (4. csoport) =TNBS/etanol+NPN-nel kezelt patkányok (. csoport) =TNBS/etanol+NPN+Hb-vel kezelt patkányok (6. csoport) =TNBS/etanol+Hb-vel kezelt patkányok (7. csoport) Ordinátán=MPO-aktivitás (E MPO/g protein) *: szignifikáns különbség (P<0,01) a kontrollcsoportokhoz képest (1 3. csoport) Négy nappal a TBS/etanol becsepegtetést követõen, a vastagbél nyálkahártyáját szabályos gyulladással járó, lényeges fekélyesedés és a vastagbél falának a megvastagodása jellemezte, amely 6,9±1,7 SLM-értéknek felelt meg (4. csoport). A naponta végzett NPNkezelés szignifikáns mértékben csökkentette a vastagbél lézióinak a kiterjedését, az SLM-értéket 2,±0,6¹ra csökkentve (. csoport), míg a naponta végzett NPN+Hb kezelésnek és a kizárólagos Hb¹kezelésnek nem volt hatása ezen paraméterre, sorrendben,0±1,1 (6. csoport) és,8±1,3 (7. csoport) SLM-értékekkel. 2. kezelés Lactobacillus farciminis baktériummal Az eredményeket a 3. ábra mutatja. A 3. ábra felírásai Abszcisszán: :TNBS/etanollal kezelt patkányok (3. csoport) =Lactobacillus farciminis+tnsb/etanollal kezelt patkányok (4. csoport)
=Lactobacillus farciminis+tnsb/etanol+hb-vel kezelt patkányok (. csoport) Ordinátán=makroszkóposlézió-pontszámok *: szignifikáns különbség (P<0,01) a kontrollcsoportokhoz képest (1. és 2. csoport) A makroszkópos lézióktól mentesnek tekintett kontrollpatkányokkal (1. és 2. csoport) összehasonlítva, a TNSB/etanol makroszkópos léziókkal (3. csoport;,7±0,7) jellemzett colitist vált ki. A TNSB/etanollal becsepegtetett patkányokban, a Lactobacillus farciminis baktériummal végzett kezelés szignifikáns mértékben csökkentette a léziópontszámot (4. csoport; 2,6±0,9). Ez a hatás nem nyilvánult meg akkor, ha a Lactobacillus farciminis-kezelést Hb¹nek a vastagbélbe történõ perfundálásával társítottuk (. csoport; 4,6±0,). III. Következtetés A Lactobacillus farciminis orális beadása, hasonlóan az NPN-kezeléshez, csökkenti a mieloperoxidázaktivitást és a léziópontszámot TNBS/etanollal kezelt patkányokban. Ezt a gyulladásellenes hatást hemoglobin vastagbélbe történõ perfundálása eltörli, ami azt mutatja, hogy a gyulladásellenes hatás NO¹termelésnek tulajdonítható. 2. példa Lactobacillus farciminis gyógyító hatása TNBS/etanol által kiváltott colitisre Vizsgáltuk orális Lactobacillus farciminis gyógyító kezelés hatásait attól a perctõl, hogy TNBS/etanollal colitist váltottunk ki. Kétszáz-kétszázötven gramm testtömegû, hím Wistar-patkányok egyedbõl álló négy csoportját altatás alatt vastagbélbe vezetett katéterrel láttunk el, amint azt az 1. példában ismertettük. Az. napon a patkányok intracolonalis úton 80 mg/kg TNBS/etanol (1. és 2. csoport) vagy 0,9% NaCl-oldat- (3. és 4. csoport) becsepegtetést kaptak. A Lactobacillus farciminis baktériummal végzett kezelést a gyulladás kiváltását követõen 4 óra elteltével kezdtük. A patkányok orális úton 12 UFC/nap Lactobacillus farciminis baktériumot (1. és 3. csoport) vagy 0,9% NaCl-oldatot (2. és 4. csoport) kaptak, 4 napon át. A 4. napon az állatokat feláldoztuk és a vastagbél fala gyulladásának az intenzitását izolált vastagbélmintákon végzett mieloperoxidáz (MPO)-aktivitás mérésével jellemeztük, amint azt az 1. példában ismertettük. Az eredményeket az. példa szemlélteti. Az. ábra felírásai Abszcisszán: =kezeletlen patkányok (4. csoport) =Lactobacillus farciminis baktériummal kezelt patkányok (3. csoport) =TNBS/etanollal kezelt patkányok (2. csoport) =Lactobacillus farciminis+tnbs/etanollal kezelt patkányok (1. csoport) Ordinátán=MPO-aktivitás (E MPO/g protein) 1 2 3 4 0 *: szignifikáns különbség (P<0,01) a kontrollcsoporthoz képest (4. csoport) +: szignifikáns különbség (P<0,01) a TNBS/etanol csoporthoz képest (2. csoport) A mieloperoxidáz-aktivitás erõsen megemelkedett a TNBS/etanollal kezelt patkányokban (2. csoport; 8184±1946 E MPO/g protein) a nem kezelt kontrollokhoz képest (4. csoport; 76±16 E MPO/g protein). A Lactobacillus farciminis-kezelés a fiziológiás konyhasóoldattal becsepegtetett patkányokban nem emeli meg az MPO-aktivitást (3. csoport; 128±48 E MPO/g protein). Ezzel szemben, a TNBS/etanollal becsepegtetett patkányokban a Lactobacillus farciminis-kezelés szignifikáns mértékben csökkenti a mieloperoxidáz-aktivitást (1. csoport; 84±299 E MPO/g protein. 3. példa Lactobacillus farciminis-kezelés hatása colorectalis disztenzió által kiváltott fájdalomra Vizsgáltuk Lactobacillus farciminis-kezelésnek colorectalis disztenzió által kiváltott fájdalomra gyakorolt hatásait. A vizsgálatot egészséges patkányokon (alapkörülmények), vagy colitis révén kiváltott hiperalgéziás körülmények között (gyulladásos körülmények), vagy korlátozott stressz (stresszkörülmények) mellett végeztük. A disztenzió által kiváltott fájdalom a hasizmok összehúzódásai számának az emelkedésében nyilvánul meg [Morteau és munkatársai: Dig. Dis. Sci. 39, 1239 1248. (1994)]. Kétszáz-kétszázötven gramm testtömegû, hím Wistar-patkányok egyenként egyedbõl álló, 7 csoportjának 21 napon át orális úton 12 UFC/nap Lactobacillus farciminis baktériumot (2., 4. és 7. csoport) vagy 0,9%¹os NaCl-oldatot (1., 3.,. és 6. csoport) adtunk. A 7. napon a patkányokat altatás alatt vastagbélbe vezetett katéterrel láttuk el (a caecocolon junkciótól +2 cm¹re) és három csoportban három NiCr-elektródát ültettünk be mindkét oldali külsõ ferde hasizomba, éppen a lágyéki ligamentum fölé. A katéter és az elektródák kívülrõl a dorsoscapularis régióban voltak hozzáférhetõek, és azokat bõrhöz rögzített üvegcsõ védte. I. Lactobacillus farciminis-kezelés hatása alapkörülmények mellett A 1. napon colorectalis disztenziót váltottunk ki, rectalis úton a végbélnyílástól cm¹re behelyezett ballon alkalmazásával, amelyet az állat farkánál rögzítettünk. A ballont 0¹tól Hgmm¹ig fújtuk fel fokozatosan, 1 Hgmm¹es lépésekben úgy, hogy minden lépés percen át tartott. A hasizmok összehúzódásait elektroenkefalográfiás eljárással regisztráltuk abból a célból, hogy láthatóvá tegyük a zsigeri érzékenységet. Az eredményeket a 6. ábra szemlélteti. A 6. ábra felírásai Abszcisszán=disztenziós nyomás (Hgmm) Ordinátán=hasi görcsök száma/ perc *: szignifikáns eltérés (P<0,0) a kontrollhoz (1. csoport) képest. 6
Alkalmazott patkánycsoportok =Kezeletlen patkányok (1. csoport) =Lactobacillus farciminis baktériummal kezelt patkányok (2. csoport) A progresszív colorectalis disztenzió a disztenzió térfogata függvényében emelte a hasizmok összehúzódásainak a számát, függetlenül attól, hogy az állatokat kezeltük Lactobacillus farciminis baktériumokkal (2. csoport), vagy nem (1. csoport). Azonban, a disztenziós térfogattól függetlenül, a hasizmok összehúzódásának a száma csökkent a Lactobacillus farciminis baktériumokkal kezelt patkányokban (2. csoport), a nem kezelt állatokhoz képest (1. csoport). II. Lactobacillus farciminis-kezelés hatása gyulladásos körülmények mellett A 17. napon a patkányok intracolonalis úton 80 mg/kg TNBS/etanol (3. és 4. csoport) vagy 0,9%¹os NaCl-oldat- (1. csoport) becsepegtetést kaptak. A 21. napon, azaz 4 nappal a vastagbélbe történõ becsepegtetést követõen, új colorectalis disztenziót váltottunk ki a fent ismertetettek szerint. A hasizmok összehúzódásait elektroenkefalográfiás eljárással regisztráltuk abból a célból, hogy láthatóvá tegyük a zsigeri érzékenységet. Az eredményeket a 7. ábra szemlélteti. A 7. ábra felírásai Abszcisszán=disztenziós nyomás (Hgmm) Ordinátán=abdominális görcsök száma/ perc *: szignifikáns eltérés (P<0,0) a kontrollokhoz (1. és 3. csoportok) képest. Alkalmazott patkánycsoportok =Kezeletlen patkányok (1. csoport) =TNBS/etanollal kezelt patkányok (3. csoport) =Lactobacillus farciminis+tnbs/etanollal kezelt patkányok (4. csoport) A hasizmok összehúzódásainak a száma 4 nappal a TNBS/etanol becsepegtetést követõen szignifikáns mértékben emelkedett a Lactobacillus farciminis baktériummal nem kezelt (3. csoport) patkányokban a kontroll- (1. csoport) állatokhoz képest. A hasizmok összehúzódásainak a száma 4 nappal a TNBS/etanol becsepegtetést követõen szignifikáns mértékben csökkent a Lactobacillus farciminis baktériummal kezelt (4. csoport) patkányokban azokhoz az állatokhoz képest, amelyek TNBS/etanolt kaptak (4. csoport), de Lactobacillus farciminis-kezelést nem (3. csoport), és nem tért el szignifikáns mértékben a kontrollcsoportétól (1. csoport). III. Lactobacillus farciminis-kezelés hatása stresszkörülmények mellett A 1. napon a patkányokat korlátozott stresszkörülményeknek tettük ki (6. és 7. csoport). Felületes éteres bódítás mellett a patkányok mellkasát és elülsõ végtagjait ragasztószalaggal vettük körbe, hogy mozgásukat korlátozzuk. A állatokat ebben a helyzetben tartottuk 2 órán át. A kontrollállatokat csak éteres bódításnak vetettük alá (. csoport). 1 2 3 4 0 A korlátozott stresszkörülményeket követõen perc elteltével, colorectalis disztenziót váltottunk ki a fent ismertetettek szerint. A hasizmok összehúzódásait elektroenkefalográfiás eljárással regisztráltuk abból a célból, hogy láthatóvá tegyük a zsigeri érzékenységet. Az eredményeket a 8. ábra szemlélteti. A 8. ábra felírásai Abszcisszán=disztenziós nyomás (Hgmm) Ordinátán=hasi görcsök száma/ perc *: szignifikáns eltérés (P<0,0) a kontrollhoz (. csoport) képest. Alkalmazott patkánycsoportok =Nem kezelt és stressznek ki nem tett patkányok (. csoport) =Nem kezelt és stresszált patkányok (6. csoport) =Lactobacillus farciminis-kezelt és stressznek kietett patkányok (7. csoport) A 4 és Hgmm¹es colorectalis disztenzióknak megfelelõ hasizom-összehúzódások száma a stresszt követõen szignifikáns mértékben emelkedett a Lactobacillus farciminis baktériummal nem kezelt (6. csoport) patkányokban, a kontrollállatokhoz (. csoport) képest. Negyvenöt és Hgmm nyomásoknál a hasizom-összehúzódások száma szignifikáns mértékben csökkent a Lactobacillus farciminis baktériummal kezelt és stressznek kitett patkányokban (7. csoport), a nem kezelt és stressznek kitett (6. csoport) állatokhoz képest, és nem különbözött szignifikáns mértékben a nem kezelt és stressznek ki nem tett kontroll- (. csoport) állatokhoz viszonyítva. IV. Következtetés Eredményeink azt mutatják, hogy Lactobacillus farciminis baktériummal történõ kezelés, alapkörülmények mellett, vagy colitis vagy kényszerstressz által kiváltott hiperalgézia mellett, csökkenti a hasizom-összehúzódások számát, ami zsigeri fájdalom csökkenésére utal. SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. Lactobacillus farciminis fajba tartozó baktérium alkalmazása emésztõcsõ rendellenességének kezelésére vagy megelõzésére alkalmas készítmény elõállítására. 2. Az 1. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a fenti rendellenesség a bél akut vagy krónikus gyulladásos rendellenessége. 3. Az 1. vagy 2. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a fenti rendellenesség zsigeri fájdalomban nyilvánul meg. 4. Az 1 3. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a fenti készítmény élelmiszer vagy élelmiszer-kiegészítõ formájában van.. Az emésztõcsõ rendellenességeinek kezelésére alkalmas készítmény, azzal jellemezve, hogy Lactobacillus farciminis fajhoz tartozó tejsavbaktériumokat tartalmaz. 7
HU 003 218 T2 Int. Cl.: A61K 3/74 8
HU 003 218 T2 Int. Cl.: A61K 3/74 9
HU 003 218 T2 Int. Cl.: A61K 3/74 Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest A kiadásért felel: Törõcsik Zsuzsanna fõosztályvezetõ-helyettes Windor Bt., Budapest