Ragyogó molekulák: dióhéjban a fluoreszcenciáról és biológiai alkalmazásairól Kele Péter egyetemi adjunktus
Lumineszcencia jelenségek Biolumineszcencia (biológiai folyamat, pl. luciferin-luciferáz) Kemilumineszcencia (kémiai reakció, pl. luminol- H 2 O 2 ) Fotolumineszcencia (fénnyel való gerjesztés) Fluoreszcencia Foszforeszcencia
Fotolumineszcens folyamatok Jablonszki-diagram
Gerjesztési, emissziós spektrum
A fluoreszcencia tulajdonságai Könnyű észlelhetőség (fluoriméter, mikroszkóp, szabad szem stb.) Érzékeny észlelés (femtomol, 1 molekula) Jó felbontóképesség (idő-, térbeli)
Fluoreszcens anyagok Természetes vegyületek (pl. GFP származékok) Mesterséges vegyületek (pl. aromás vegyületek) Félvezető nanorészecskék (pl. CdSe nanorészecskék) Upconverting nanorészecskék (Er, Yr, Eb)
Fluoreszcens jelzővegyületek Festékek (stains, probes, labels) Intenzív fluoreszcencia ( fényesség ) Hullámhossz (szín) Fluoreszcens molekuláris szenzorok (jelfogó, jeladó, vendégmolekula-gazdamolekula hostguest- kölcsönhatás)
Fluoreszcens festékek, indikátorok Jelzővegyületek bevitele Géntechnológia (GFPk-nél) Kémiai módosítás (megfelelő, reaktív funkciós csoportok -COOH, -SH, -NH 2 ) Bioortogonalitás (biológiailag semleges, egymással szelektíven, kvantitatíve reagáló funkciós csoportok alkalmazása, pl. N 3, acetilén, foszfin)
Jelzővegyületek I.- természetes fluorofórok (GFP származékok) Beépíthető más fehérjékbe Eredeti funkció sértetlen Fehérjék érési folyamatai Transzportfolyamatok Szerkezet jelölés (imaging) Konformációs változások
GFP származékok
Jelzővegyületek II.- mesterséges fluorofórok Szerves vegyületek Szabályozható fotofizikai paraméterek (gerjesztési, emissziós hullámhossz) Kémiai reaktivitás szabályozható (célvegyületre specifikus) Kvantitatív reakció Fiziológiás körülmények Stabil termékek
Fluorofór O N Enzim-SH Enzim S O O N O Fluorofór Fluorofór O O O N Biomolekula-NH 2 Biomolekula NH O O Fluorofór Fluorofór N C S Biomolekula-NH 2 Biomolekula NH S NH Fluorofór Fluorofór N N N Biomolekula Cu(I) Biomolekula N N N Fluorofór
Jelzővegyületek III. félvezető nanorészecskék (Quantum Dots, QD) II-VI, III-V főcsoportbeli elemekből (CdSe, CdS, CdTe, ZnS, HgS ) Széles gerjesztési, keskeny emissziós sáv Intenzív fluoreszcencia Az emissziós hullámhossz a részecske méretének a függvénye (2-10 nm)
CdSe nanorészecskék (CdSe QD)
Molekuláris szenzorok Fluoreszcens, szerves vegyületek Jelzőrész (fluorofór) A fluoreszcencia érzékeny a külső hatásokra (intenzitás, vagy szín) Jelfogó (receptor) Adott vendégmolekulára érzékeny
Molekuláris szenzorok I. Cd 2+
Molekuláris szenzorok II. Hg 2+
Molekuláris szenzorok III. Ag +
Membránfúzió dimer-monomer
Energiatranszfer (FRET) rendszerek Két fluorofór (Donor, akceptor) A donort gerjesztve az akceptor világít F 1 * + F 2 F 1 + F 2 * F 1 * + Q F 1 + Q A donor emissziós spektruma átfed az akceptor gerjesztési spektrumával
Energiatranszfer (FRET) rendszerek Távolságfüggő (10-100 Å) Képalkotó technikák (időbeli követés) Kinetikai mérések, konformációs változások, komplexálás stb
Molecular Beacon
Enzimhidrolízis - FRET
Membránfúzió FRET I.
Membránfúzió FRET II.
Upconverting nanorészecskék Ritka földfémekből (Yb 3+, Y 2 O 3 :Er 3+ ) Két kis energiájú fotonnal gerjesztés Egy nagyobb energiájú foton emissziója IR (NIR) látható (Anti-Stokes) Nincs autofluoreszcencia Mélyebbre lehet besugározni (IR, NIR)
Összefoglalás Fluorofórok (természetes, szintetikus szerves, szervetlen) Festékek, képalkotó technikák Szenzorok (ionok, szerves vegyületek) Energiatranszfer rendszerek (kinetika, konformációs változások, membránfúzió) Upconverting nanorészecskék
Hasznos linkek www.invitrogen.com Probes.invitrogen.com/handbook Fluorophore.org Kelep.web.elte.hu