Proteinchip technológia - alkalmazások

Átírás

1 Proteinchip technológia - alkalmazások Fehérje felfedezés Fehérje tisztítás Fehérje azonosítás peptidtérképezés, bio / betegség markerek Fehérje karakterizálás (epitóp térképezés, foszforilációs, glikolizációs analízis) Assay fejlesztés, pl. fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálatára

2 Fehérje felfedezés, biomarker keresés 2 szérum minta cseppentése, (beteg-egészséges / kezeltkezeletlen) mosás, leolvasás B kivonása A-ból szoftver segítségével Egyedi fehérje azonosítása

3 Fehérje tisztítás Mikroliternyi mennyiség Mikrokromatográfiás előtisztítás Egyre erőteljesebb mosás a csipen Homogén tisztaság pikomól mennyiségben Néhány óra hónapok helyett

4 Ellenanyag kötése a csip felszínére In situ emésztés Nemkötődött fragmensek mosása Kötődött fragmensek leolvasása Epitóp térképezés

5 Fehérje-fehérje kölcsönhatások 12,938 pont Minden pötty ~ 30 fg-50 pg proteint tartalmaz Különböző fehérje minták nyomtatva a felszínre (A fehérjéket megtoldották GSTpoli-His-taggal, majd Ni 2+ -en át a felülethez kötötték)

6 P-P interakciók elemzése microarray-jel Array+biotinilált kalmodulin Új kalmodulin-kötő fehérjék felfedezése Új inozitol-foszfát-kötő fehérjék felfedezése

7 Metabolomika Metabolomika: egy szervezet összes metabolitjának egyidejű összehasonlító vizsgálata, mennyiségi változások követése Metabolom: a szervezet anyagcseréjében részt vevő összes kismolekula Metabolitok: az anyagcserefolyamatok köztes-, vagy végtermékei (zsírok, aminosavak, cukrok, antibiotikumok, pigmentek stb)

8 Metabolomika elválasztás Gázkromatográfia(GC) Kapillárelektroforézis (CE) Nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC) Ultrahatékony folyadékkromatográfia (UPLC) GC-MS HPLC-MS Detektálási módszerek NMR, MS

9 Metabolomika elválasztás Adatok értékelése összehasonlítás, differencia analízis stb. Alkalmazások - Kábítószer azonosítás (igazságügyi orvos, vegyész) - Klinikai toxikológia - Táplálkozásgenetika - Funkcionális genomika

10 Biológiai útlevél Sportolóknál, doppingvizsgálatoknál alkalmazzák Biomarkerek segítségével építenek fel egy, a sportolóra jellemző hematológiai és szteroid profilt: A sportoló így önmaga referenciaértéke is egyben saját határértékeket állapítanak meg, ami rá jellemző A gyanús változások orvosi vagy dopping eredetét tisztázzák, ha tudják

11 Bölömbika

12 8. A kémiai biológia alapfogalmai Bioortogonalitás. Jelölési technikák (fluoreszcens, PET, MRI)

13 8. Kémiai biológia Szintetikus Kémia N N N N OAc Fluorofórok Kémiai biológia N 3 SO 2 R HOH HO HO H H H OH OH OH Bioortogonalitás Biokémia

14 Kémiai biológia Természetes, vagy mesterségesen előállított biopolimerek módosítása kis szerves vegyületekkel (Bio)konjugáció (tesztek, szenzorok, képalkotó technikák) Biológiai képletek jelölése (fluoreszcens, radioaktív, MRI) Természetes / mesterséges jelzővegyületek (biokémiai/kémiai módosítás)

15 Bioortogonalitás Bio = biokompatibilis (nem toxikus, nem invazív) Ortogonális = kizárólag a komplementer funkcióval lép reakcióba nincs keresztreakció, szervezetidegen funkciók Gyors, kvázi kvantitatív ( klikk -reakciók) - Stabil kovalens kötést hoz létre, moduláris, minimális ártalmatlan melléktermék, vizes közeg, fiziológiásan stabil, termodinamikusan kedvezményezett, sztereospecifikus

16 Bioortogonális modulok Célvegyület (biomolekula) Kémiai hírvivő bifunkciós, biokompatibilis mesterséges vegyület, amelyhez szelektíven kapcsolható a cél- és a jelzővegyület is. (metabolizmus, egyedi motívumok, géntechnológia) Jelzővegyület (fluoreszcens, radioaktív, NMR aktív)

17 Bioortogonális reakciók Fotoindukált cikloaddíció (tetrazol + olefin) Staudinger ligáció (azid + foszfin) Azid-alkin cikloaddíció Cu(I) katalizált / Cu mentes Diels-Alder reakció (tetrazin + transz ciklooktén)

18 Fotoindukált 1,3 dipoláris cikloaddíció Gyors Szelektív Fluoreszcens termék (nincs háttérfluoreszcencia) UV fény

19 Biokompatibilis Lassú Spontán foszfin oxidáció Staudinger ligáció

20 Staudinger ligáció

21 Azid-alkin 1,3-dipoláris cikloaddíció, Huisgen reakció magas hőmérséklet regioizomerek (1,4 és 1,5)

22 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Szerves oldószerek, vizes közeg, ph: 3-10 ~100 % Nagyon gyors, regiospecifikus Cu toxicitás

23 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Cu(I) generálás (Cu(II) + C-vitamin) Cu(I) stabilitás (C-vitamin is komplexszál, vagy egyéb adalélok (TBTA) TBTA

24 24 Cu(I) katalizált azid-alkin 1,3- dipoláris cikloaddíció Glikoproteid jelölés Metabolikus módosítás (Ac 4 ManAz)

25 Vörös, közeli IR, mega Stokes klikk festékek λ max /λ em 523/630 nm 544/680 nm 588/744 nm

26 Nem citosztatikusak CHO sejtek jelölése: A, B, C: azidomannozaminnal nem kezelt sejtek festés után D, E, F: azidomannozaminnal kezelt sejtek festés után G, H, I: azidomannozaminnal kezelt sejtek a festés után 5, 25 és 60 perccel

27 Cu(I) mentes klikk reakció R 1 R 1 + R 2 N 3 R 1 r.t. N N N R 2 + N N N R 2 1,4 triazol 1,5 triazol -C(sp 3 )-C(sp)- = ~75,3 kj/mol gyűrűfeszültség Nem szükséges Cu(I) Lassabb, bonyolult reagensek

28 28 Ciklooktin reagensek F F R DIFO DIBO R R endo/exo BCN DIFBO F F N R O BARAC CO 2 Me COMBO 0.08 [a] 0.05 [a] 0.14 / 0.11 [b] 0.22 [a] 0.96 [a] 0.24 [a] 0.29 / 0.19 [c] 0.80 [d] c logp = 4,8 c logp = 1,9 [a] acetonitril [b] víz-acetonitril (1:3 v/v) [c] víz-acetonitril (2:1 v/v) [d] víz-acetonitril (3:4 v/v)

29 Koncentrációfüggés / szelektivitás O N N O HO O O COMBO-Flu U937 sejtek, FACS B. R. Varga. M. Kállay, K. Hegyi, Sz. Béni, P. Kele (2011) Chem. Eur. J. in press. 29

30 Membrán glikoproteid festés (ManNAz) 12.5 µm COMBO-Flu A-C ManNAz + D-E ManNAz 30 min 45 min 60 min A B C Magfesték (Hoechst 33342) Mosás nélkül!! 30 min 60 min D E

31 Diels-Alder reakció Biokompatibilis Gyors Bonyolult reagensek (transz-ciklooktén)

32 Diels-Alder reakció

33 Kémiai hírvivők Kötődés a célterülethez - Ritka funkciós csoportokon át kémiai úton - Metabolizmus segítségével (módosított metabolittal) - Bioortogonalizált építőelemek genetikai bevitele (STOP kodonhoz kötődő trns-en át) Reakció a jelzővegyülettel (bioortogonális reakcióval)

34 Jelzés bevitele Előre jelzett kémiai hírvivő (egylépéses jelzés) - Kémiai funkció módosulhat - Lipofilitás túl nagy lehet (penetrációs tulajdonságok) - Háttérzaj (pl. háttérfluoreszcencia) rosszabb jel/zaj arány

35 Kétlépéses (szekvenciális) jelzés - Először a kémiai hírvivő, majd a jelzés Jelzés bevitele - Kisebb módosítás, kevésbé befolyásolja a tulajdonságokat, könnyebb bevinni - Fluoreszcens jelzésnél lehet pl. fluorogén jelzést alkalmazni (nincs háttérfluoreszcencia)

36 Fluoreszcens jelzés Jelzések - Fluoreszcens, fluorogén (nem fluoreszcens, csak a kapcsolás (ligáció) után válik azzá) - Nagyon érzékeny (femtomól) - Jó felbontás (subnanométeres térbeli, submikroszekundumos időbeli) - Olcsó - Korlátok: - mélység (UV legrosszabb, NIR nagyon jó) - Nem túl jó kontraszt

37 Jelzések Pozitron jelzés (PET) - Radioaktív nuklidok, melyek pozitront emittálnak (pl. 18 F) - Érzékeny, jó kontraszt, jó felbontás, nagy áthatolóképesség - Korlátok: Izotópok előállítása, stabilitása, drága, egészségre káros

38 Jelzések NMR aktív nuklid (MRI) - pl. Gd 3+ komplexek, mágneses nanorészecskék - jó kontraszt, nagy áthatolóképesség - Korlátok: - NMR aktív nuklidok, drága, kevésbé érzékeny

39 Jelzések Kombinált jelzések NIR fluorofór + PET Jó kontraszt + érzékeny detektálás

40 Példa: halembrió glikolizációja

41 Glikolizáció vizsgálata időben és térben Három különböző színű ciklooktin Három különböző időben adott Ac 4 GalNAz