9. Szilárdfázisú szintézisek. oligopeptidek, oligonukleotidok

Méret: px

Mutatás kezdődik a ... oldaltól:

Download "9. Szilárdfázisú szintézisek. oligopeptidek, oligonukleotidok"

Réka Pásztorné
7 évvel ezelőtt
Látták:

1 9. Szilárdfázisú szintézisek oligopeptidek, oligonukleotidok

2 Peptidszintézis Amidkötés kialakítása R O OH + H 2 N Q R O Q N + H 2 O H R O OH + H 2 N Q R O O + H 3 N Q sav-bázis reakció már nem nukleofil

3 Amidkötés kialakítása A karbonsavat aktiválni kell R O X + H 2 N Q R O N H Q + HX X = jó távozó csoport X = klorid, anhidrid, aktív észter

4 Dipeptid szintézis

5 Védőcsoportok N-terminális és amino-védőcsoportok (a teljesség igénye nélkül)

6 Védőcsoportok C-terminális és karboxil-védőcsoportok OH tercier-butil-észter (tbu) savra érzékeny pl. trifluorecet sav (TFA) OH benzil-észter (Bn) H 2 / Pd / C

7 Védőcsoportok Egyéb, oldallánc-védőcsoportok (Cys, Tyr, Ser, Thr, Lys)

8 -COOH aktiválás Aktív észterré alakítás (in situ)

9 -COOH aktiválás Aktív észterré alakítás (in situ) Átészterezés hidroxibenztriazolokkal (kevesebb racemizáció)

10 Aktiválás a gyakorlatban karbodiimid + triazol együtt DCC DIC EDC (EDAC)

11 Szilárd hordozók (gyanták) Két fő technika (Fmoc/tBu; Boc/Bn) Boc/Bn : Merrifield gyanta (polisztirol / divinil benzol) Fmoc/tBu : Wang gyanta (p-hidroxibenzil alkohol / polisztirol) egyéb gyanták : amid végű, hasíthatóság stb.

12 Szilárd hordozók (gyanták) Stabil legyen, kémiailag ellenálló Duzzadóképesség, jól átjárható legyen Az első aminosavat rá lehessen kapcsolni A szintézis végén le lehessen hasítani

13 Az első aminosav kapcsolása Eltér a többitől A COOH-csoporton keresztül történik A szilárdfázisú peptidszintézis során C felé haladunk! A szintézis végén le lehessen hasítani N

14 Szintézis első aminosav felkapcsolása N-védett elsõ aminosav O gyanta BocHN CH 2 C OH HO KF O BocHN CH 2 C O

15 Szilárd-fázisú szintézis

16 Védőcsoport eltolítás (Nterminális) O BocHN CH 2 C O 1. védõcsoport eltávolítás (TFA) O H 2 N CH 2 C O szabaddá váló N-terminális

17 Második aminosav felkapcsolása Gly-gyanta O H 2 N CH 2 C O O BocHN CH C CH 3 OH 2. Második, N-terminálisán védett aminosav (Boc-Ala)+ aktiválószer (DIC / HOBt) BocHN O CH C O H N CH 2 C O CH 3 Boc-Ala-Gly-gyanta

18 1. Védőcsoport eltávolítás 2. Boc-aminosav kapcsolása 3. Egy-egy kapcsolás hatékonysága ~99% 4. Csak 20 aminosav után nő meg a rövidebb peptidek száma jelentősen 5. Kapcsolások hatákonysága színreakcióval ellenőrizhető Lánchosszabítás BocHN BocHN BocHN BocHN Lys Val Val Ala Asp Lys Val Ala Gly 1. TFA 2. Boc-Val Gly 1. TFA 2. Boc-Lys Ala Ala Gly 1. TFA 2. Boc-Asp Gly

19 Kaiser teszt kapcsolás ellenőrzése Primer amino csoport (a-nh 2 ) Ha van szabad amino csoport (kék), meg kell ismételni a kapcsolást Prolinhoz izatin teszt

20 Kész peptid a gyantán Boc/Bn stratégia a kész peptid lehasítása a gyantáról és az összes védőcsoport eltávolítása (TFMSA, HF speciális berendezés) Fmoc/tBu stratégia: N-terminális Fmoc lehasítása utána a peptid és a többi oldallánc védőcsoport lehasítása egyben TFA-val Gyökfogók használata (víz, szilil, fenol stb) A kész peptid tisztítása HPLC-vel, (HPLC-MS) Hosszabb peptidek szintézise fragmeskondenzációval (rövidebb szakaszok szilárd fázison, majd ezeket oldatban kapcsolják össze megfelelő védőcsoportok kombinációja szükséges)

21 Oldatfázisú vs. Szilárdfázisú szintézis oldat Olcsóbb Homogén Nagyobb mennyiségekre, rövidebb peptidekre Lassú Nem automatizálható szilárd Drága, pazarló Heterogén Kisebb mennyiségre, hosszabb szekvenciákra Gyors Könnyű tisztítás automatizálható

22 Nem természetes aminosavak 22

23 Oligopeptidek módosításai Zsírsavakat kapcsolhatunk hozzá (lipoproteinek, lipopeptidek) Biotint kapcsolhatunk hozzá Gyógyszerhatóanyagot Szerves csoportokat pl. fémionokat komplexáló ligandumokat (PET jelzés) Ciklizálás (akár gyantán is, crgd-k) Automatizálás

24 Peptidek felhasználása Membránfehérjék modellezése (lipopeptidekkel) Assay készítés (biotinilált peptidek) Szállítópeptidek (gyógyszerek irányított célbajuttatása) Gyógyszerhatóanyagok szintézise (epitópok) Kombinatorikus szintézis polihis tag, microarray

25 Kombinatorikus peptidszintézis Furka Árpád (ELTE)

26 Kombinatorikus peptidszintézis 3 ciklus 4 ciklus Furka Árpád (ELTE)

27 Oligonukleotidok szintézise A nukleozid 3 / 5 foszfátok nem eléggé reaktívak 3 -O-foszforamidit származékok A többi funkciós csoportot inaktiválni kell (védőcsoportok) A származékok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők

28 Védőcsoportok 5 -hidroxil csoport dimetoxi tritil (DMT) savérzékeny T (U) nem igényel védőcsoportot A, da aminocsoportját Bz védőcsoporttal C, dc aminocsoportját Bz, vagy Ac védőcsoporttal G, dg, aminocsoportját izobutiril csoporttal védik A foszfit csoportot cianoetillel védik A DMT kivételével bázisra érzékenyek A származékok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők

29 Védőcsoportok

30 Védőcsoportok

31 Szintetikus ciklus 5 -véghez kapcsolódik a következő nukleotid 5 -DMT csoport eltávolítása, az 5 OH szabaddá válik A következő, 5 O-DMT nukleotid kapcsolása (tetrazol reagenssel) A kevés (<1%) elreagálatlan 5-OH t deaktiválják (capping) Ac 2 O-val Az új foszfit-triésztert (P(III)) oxidálni kell (nem stabil), meg nem is ez van a nukleinsavakban pl. I 2 /víz Hordozó: polisztirol (makropórusos), vagy üveg (controlled pore glass, CPG)

32 Nukleotidok összekapcsolása

33 Szintetikus ciklus

34 OLIGONUKLEOTIDOK UTÓKEZELÉSE Védőcsoportok eltávolítása, hordozóról való lehasítás A lúg hatására lehasad: - védőcsoportok a bázisokról - -cianoetil csoport a fosztátról - oligo a hordozóról - Liofilizálás, sómentesítés - Tisztítás: HPLC (méret szerint, ioncsere)

35 OLIGONUKLEOTIDOK: FELHASZNÁLÁSI TERÜLETEK - primerek: DNS, RNS szekvenálás, PCR, mutagenezis - linkerek: mesterséges hasítóhelyek bevitele - adapterek: különböző (nem-kompatibilis) ragadós DNS végek összekötése, esetleg hasítóhely bevitelével - hibridizációs próbák, DNS diagnosztika - géndarabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb.

36 Oligonukleotid módosítások - primer, FISH-próba - azid / acetilén linkert tartalmazó (klikk-kémia) - tiol-linker (pl. arany felszínhez) - biotin linker - fluoreszcens módosítások (pl. molecular beaconhez) - géndarabok - egyéb, pl. DNS affinitásoszlopok készítése, stb. - nem természetes nukleotidok beépítése

37 Energiatranszfer (FRET) rendszerek Két fluorofór (Donor, akceptor) A donort gerjesztve az akceptor világít F 1 * + F 2 F 1 + F 2 * F 1 * + Q F 1 + Q A donor emissziós spektruma átfed az akceptor gerjesztési spektrumával

Energiatranszfer (FRET) rendszerek Távolságfüggő (10-100 Å) Képalkotó technikák (időbeli

38 Energiatranszfer (FRET) rendszerek Távolságfüggő ( Å) Képalkotó technikák (időbeli követés) Stokes-eltolódás változás Kinetikai mérések, konformációs változások, komplexálás stb

39 Molecular Beacon

40 Enzimhidrolízis - FRET

41 Membránfúzió

42 Alkímia Ma, január 8.

43 Oligonukleotid módosítások I / a.u DNA C 40 C 60 C 65 C 70 C 80 C 90 C / nm

44 Oligonukleotid módosítások exc = 430 nm Kettősen jelölt primer. (zöld-piros) RT-PCR

Hasonló dokumentumok

9. Szilárdfázisú szintézisek. oligopeptidek, oligonukleotidok

9. Szilárdfázisú szintézisek. oligopeptidek, oligonukleotidok 9. Szilárdfázisú szintézisek oligopeptidek, oligonukleotidok Peptidszintézis Amidkötés kialakítása R H + H 2 Q R Q + H 2 H R H + H 2 Q R + H 3 Q sav-bázis reakció már nem nukleofil Amidkötés kialakítása