Aminosavak, peptidek, fehérjék

Átírás

1 Aminosavak, peptidek, fehérjék

2 Aminosavak NH 2, NH, N, N C Amino- és karboxilcsoport egy molekulában. H Csoportosítás - az amin rendűsége szerint (első, másod, harmad, negyedrendű) - az amino- és karboxil-csoportok száma szerint monoamino-monokarbonsav diamino-monokarbonsav monoamino-dikarbonsav, stb - a szénlánc szerkezete szerint nyíltláncú, gyűrűs, alifás, aromás

3 Nyíltláncú, alifás, monoamino-monokarbonsavak H 2 N CH 2 CH H 3 C CH CH 3 β 2 α NH 2 1 Amino-ecetsav Amino-etánsav Glicin α-amino-propionsav 2-amino-propánsav Alanin H 2 N CH 2 CH 2 CH H 2 N (CH 2 ) 5 CH β-amino-propionsav 3-amino-propánsav β-alanin ε-amino kapronsav 6-amino-hexánsav

4 H 2 N-CH 2 -CH Glicin (Gly) G Glycin Fehérjealkotó aminosavak R H H 2 N CH α-c-n helyettesített α-aminosavak N CH H Prolin (Pro) P R = CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 Alanin (Ala) A Valin (Val) V Leucin (Leu) L Izoleucin (Ile) I Isoleucin Fenilalanin (Phe) F Phenylalanin H Szerin (Ser) S Serin CH 3 H SH Cisztein (Cys) C Cystein Treonin (Thr) T Threonin S CH3 Metionin (Met) M Methionin -S-S- Cisztin

5 R = H Tirozin (Tyr) Y Tyrosin H Aszparaginsav (Asp) D Aspartic acid NH 2 N H Triptofán (Trp) W Tryptophan NH 2 H Glutaminsav (Glu) E Glutamic acid N N H Hisztidin (His) H Histidin N H NH 3 Lizin (Lys) K Lysin NH 2 NH 2 Arginin (Arg) R Arginin Fehérjealkotó aminosavak: glicin, alanin + 18 alaninszármazék Aszparagin (Asn) N Asparagin Glutamin (Gln) Q Glutamin királisak, L konfiguráció, S(Cys R)

6

7 1. Sav-bázis jelleg H N CH 2 C H H aminoecetsav gyakorlatilag nem létezik Kémiai tulajdonságok H H N CH 2 C H glicin ikerion gyenge sav gyenge bázis pi=6 izoelektromos pont alanin pufferhatása

8 2. Karboxilcsoportra jellemző tulajdonságok savszármazékok amidok 3. Aminocsoportra jellemző tulajdonságok acilezhető α-aminosavval acilezett α-aminosav peptid α-aminosavak előállítása: 1. Kinyerés fehérje hidrolizátumból, vagy fermentléből pl. lizin (Lys) cukorgyári melaszból 2. Kémiai szintézis β α c. Strecker szintézis a. ammónia b. Gabriel szintézis d. malonészter szintézis

9 a. Halogénezett karbonsavból ammóniával Cl CH 2 CH + NH 3 H 2 N CH 2 CH + NH 4 Cl b. Gabriel-szintézissel glicin c. Strecker-Zelinszkij szintézis aldehidből CH 2 C α H NH 4 Cl NH 4 CN -H 2 CH 2 CH CN H H 2 NH 2 CH 2 CH CH NH 2 α-aminonitril DL-fenilalanin

10 d. Malonészterből α β malonsavdietilészter acetamino-malonészter malonészter DL-szerin hidroklorid

11 Peptidek peptidkötés H 2 N CH CH H 2 N CH CH -H 2 H 2 N CH C NH CH CH R 1 α-aminosavak R 2 R 1 peptid R 2 H 2 N CH C NH CH C NH CH CH n Q Q Q N-terminus (amino láncvég) polipeptid (fehérjelánc) (a Q húszféle csoportot jelenthet!) C-terminus (karboxil láncvég) polikondenzáció, poliamid

12 CH 3 H 2 N-CH 2 -C-NH-CH-C-NH-CH 2 -CH glicil - alanil - glicin H-Gly-Ala-Gly-H GAG

13 Peptidek szerkezetmeghatározása 1. Aminosav összetétel: hidrolízis aminosav analízis a. papírkromatográfia, vékonyréteg-kromatográfia előhívás b. oszlopkromatogáfia - ioncserélő - RP-HPLC származék képzés elválasztás után elválasztás előtt

14 2. Peptid szekvenciameghatározás R 1 R 3 a. Edman lebontás N C S fenil-izotiocianát + H 2 N _ H NH R 2 NH NH S NH R 1 NH R 2 NH R 3 H + R 1 N NH S 2-anilino-tiazolidin-5-on vizes HCl H + fenil-tiokarbamoil-peptid TFA H 2 N NH R 2 R 3 NH S NH R 1 H _ H2 NH S 3-fenil-2-tiohidantoin (PTH-aminosav) NH feniltiokarbamoil-aminosav R 1

15 Peptidszekvencia meghatározás tömegspektrométerrel Tömegspektrométer: 1. a vizsgált molekulákat ionizálja 2. az elektromos térben felgyorsított ionokat m/z értékük szerint szétválasztja VSPTDIEEGMR a. fragmentálódás b. y fragmensek

16 + Peptidszintézis H H H H-N-CH-C-H + H-N-CH-C-H + H-N-CH-C-H + Q 1 Q 2 Q 3... H H H... - N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-... Q 1 Q 2 Q 3

17 Dipeptid szintézis R 1 R 1 N H 2 H N H 2 H N H 2 NH H védés R 2 R 2 R 1 YHN H védés védőcsoport eltávolítás aktíválás YHN R 1 X N H 2 Z kapcsolás YHN R 1 NH Z R 2 R 2 Védőcsoport: átmenetileg megszünteti egy funkciós csoport reaktivitását, legyen könnyen, jó hozammal bevihető és enyhe körülmények közt eltávolítható X = aktíváló csoport Y = amino-védőcsoport, Z = karboxil-védőcsoport

18 N H 2 H R3 YNH H R3 YNH R3 X YNH R1 N H Z R2 N H 2 R1 N H Z R2 YNH R1 N H H R2 YNH R1 N H X R2 Z YNH R1 N H R2 N H R3 Z YNH R3 N H R1 N H R2 N H 2 Z R3 N H 2 H R3 C N N C szelektív védőcsoport hasítás racemizáció! Tripeptid szintézis, lánchosszabbítás

19 Uretán típusú aminovédőcsoportok szénsav félamid-félészter uretán C 2 H 5 CNH 2 fluoren Z -, N-karbonsav PhCH 2 --C-Cl + H 2 N-CH 2 -CH PhCH 2 --C-NH-CH 2 -CNa Z = benziloxi-karbonil, Boc = terc.-butiloxi-karbonil, Fmoc = 9-fluorenilmetiloxi-karbonil

20 Karboxil védőcsoport: benzil-észter, terc.-butil-észter ldallánc védőcsoport: Asp, Glu, Lys, Cys (Arg, His, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln) A védőcsoportokra a szintézis végéig szükségünk van az oldalláncokon és a felépítendő molekula láncvégein (tartós védelem), a továbbépülő láncvégeken a védőcsoportot minden láchosszabbítás előtt szelektíven el kell távolítani (átmeneti védelem).

21 Aktiváló csoportok: aktív észterek p-nitrofenil-észter N-hidroxi-szukcinimid- észter kondenzálószerek diciklohexil-karbodiimid (DCC) DCU

22 védőcsoportok: átmeneti: Boc tartós: Z, Cys(Bzl) C-term.- on nem kell, mert amid Peptidek az élő szervezetben: hormonok, neurotranszmitterek xitocin szintézis M. Bodánszky, V. du Vigneaud aminosav, 8 peptidkötés láncépítés: 2x7+1 reakciólépés + 1 végső védőcsop. eltáv. + 1 diszulfid képzés = 17 reakciólépés, 15 izolált intermedier

23 Szilárd fázisú peptidszintézis polimer hordozó 1. funkcionalizálás polisztirol- 0,5% DVB 2. az első védett aminosav kapcsolása 3. az átmeneti védőcsoport eltávolítása 4. a következő védett aminosav kapcsolása R R 5. a 3. és 4. lépés ismétlése szükség szerinti számban Cl R'-CH 6. a peptid lehasítása a gyantáról, az összes védőcsoport eltávolítása R' R R. B. Merrifield 1963

24 nagy reagens felesleg: gyors reakció, 100% konverzió izolálás: mosással tisztítás: HPLC (csak a végtermék tisztítható) miniatürizálás automatizálás hagyományos (oldatfázisú) peptidszintézis vegyszerigény kicsi nagy oldószerigény kicsi nagy szilárdfázisú hozam közepes magas (>90%) sarzsméret g-tól több kgig (>0,1g) automatizálható nem igen időigény nagy kicsi néhány mg-tól több g-ig munkaigény nagy igen kicsi intermedier izolált, tisztítható nem izolálható ezért nem tisztítható

25 Fehérjék több száz (ritkán több ezer) aminosavból álló polipeptidlánc, többnyire stabil konformáció (a felületi hurkok, oldalláncok mozgékonyak, a vázelemek is elmozdulhatnak egymás mellett) A fehérjék szerepe az élő anyagban alapvető protein (proteosz = első) proteom: egy sejt, szövet, vagy egy élőlény teljes fehérjekészlete (vö. gén genom)

26 Fehérjék molekulaszerkezete KNSTITÚCIÓ 1. Elsődleges szerkezet: aminosav sorrend (szekvencia), meghatározása tömegspektrometriával, DNS szekvencia alapján KNFRMÁCIÓ (meghatározása Röntgen diffrakcióval, NMR-rel) 2. Másodlagos szerkezet: periodikusan rendezett szakaszok 3. Harmadlagos szerkezet: jellemzően gombolyagszerkezet: periodikusan és nem periodikusan rendezett szakaszokból áll Szerkezeti típusok: - fonal (fibrilláris) - gombolyag (globuláris) sokszor egy láncon több gombolyag (domének) - membránfehérje, transzmembrán szakasz(ok) - eredendően rendezetlen fehérje (nincs stabilis konformációja, IDP, IUP) 4. Negyedleges szerkezet: több láncból álló fehérje asszociátum szerkezete

27 1. Fehérjék molekulatömeg meghatározása tömegspektrométerrel a. Elektroporlasztásos ionizálás : a többszörösen töltött molekulaionok képződése kiterjeszti a méréshatárt, növeli a pontosságot +16 mioglobin mt: Da b. Mátrixszal segített lézerdeszorbciós ionizálás (MALDI-TF) : a lézerfénnyel gerjesztett mátrix ionizálja a mintát, repülési időből határozza meg a tömeget, fmol (10-18 mol) mintaméret

28 2. Fehérjék aminosavsorrendjének meghatározása (elsődleges szerkezet) A. a. enzimes hidrolízis b. a peptid keverék szétválasztása, a komponensek aminosavsorrendjének meghatározása (LC-MS) c. a szerkezet részletek összeillesztése átfedő szekvenciák segítségével B. Ha ismert a fehérjét termelő szervezet genomja, a fehérjéből nyert peptid aminosavsorrendjének segítségével azonosítható az őt kódoló gén, és ezzel a fehérje teljes aminosavsorrendje is megismerhető.

29 Fehérjekeverék komponenseinek azonosítása Előkészítés: 1.Fehérjekeverék elválasztása 2D gélelektroforézissel (izoelektromos fókuszálás + SDS-gélelktroforézis), utána enzimes hasítás 2. Enzimes hasítás, utána fordított fázisú kromatográfia (RPHPLC) LC-MS Tandem tömegspektrométer (MS/MS) : elválasztás fragmentálás szekvencia meghatározás azonosítás kda 100 ioncsapda detektor szeres felbontás! (Nature szerző) 30 7 ph3 10 enzimes emésztésre kivett minták 2D elektroferogram Ezen az úton a vizsgált minta, több mintából a vizsgált szervezet teljes fehérje készlete (proteom) azonositható (bioinformatika, nincs szükség a teljes aminosavsorrend meghatározására!). A minta fehérjéinek rendszer szintű vizsgálata is megvalósítható.

30 Humán proteom DNS pre-mrns mrns fehérje fehérje átírás érés, splicing transzláció transzláció utáni módosulások ~ gén több százezer egy génből többféle mrns polipeptidek módosított polipeptidek Transzláció utáni módosulások: - diszulfid kötések Cys SH-csoportok között - peptidlánc hasadás - láncvég módosulások (N-terminális Glu - piroglutamil, C-terminális amid Gly lebomlásával) - acetilezés - foszforilezés - glikozilezés Ser, Thr, Asn - fém ionok, kis molekulák kapcsolódása (pl. hem) - stb. összesen ~50-féle glükóz N-acetil-glükozamin mannóz galaktóz 5-acetil-neuraminsav fukóz N-acetil-galaktozamin

31 a. Röntgen diffrakció: 3. A fehérjék térszerkezetének meghatározása (másod- és harmadlagos szerkezet) A Röntgen sugarak a kristályok rácsán áthatolva szóródnak. Ez a visszavert sugarak interferenciája miatt csak meghatározott irányokban észlelhető. A szóródott hullámok intenzitása (és a beeső sugárhoz viszonyított fázisa) a rácsot felépítő molekuláknak az elhelyezkedésétől függ. Értékükből a rács elemi cellájának elektronsűrűség térképe kiszámítható, ezzel a rácsot felépítő molekulák térbeli szerkezete meghatározható. b. NMR spektroszkópia: A térben egymáshoz közel álló atomok közti távolságokra nyerhető NMR adatokból is meg lehet határozni a fehérjék térszerkezetét. Ebben segítséget jelent, ha a hidrogén atomokon kívül más NMR jelet adó atom pl. 15 N is van a molekulában. Ehhez a fehérjét jelzett aminosavakat tartalmazó táptalajon baktériummal kell szintetizáltatni. A távolságadatokból több egymáshoz közel álló alternatív szerkezet nyerhető. c. Elektron mikroszkópia szinkrotron röntgensugárzással kapott diffrakciós kép

32 ~ új szerkezet/év > Fehérje és nukleinsav térszerkezetek a Fehérje Adatbankban (Protein Data Bank) február 28.

33 A fehérje konformáció meghatározói: 1. mozgási (forgási) lehetőségek (a lánc gerince, oldalláncok) 2. konformációt stabilizáló, molekulán belüli (intramolekuláris) kölcsönhatások - poláris hidrogénkötés sókötés - apoláris hidrofób kölcsönhatások a peptidlánc gerince: poláris N - H hidrogén donor C = hidrogén akceptor az aminosav oldalláncok: kétfélék poláris (hidrofil) D, E, K, R; S, T, N, Q, Y, W apoláris (hidrofób) A, V, L, I, F, P, M nem kategorizálható G, C

34 Apoláris (hidrofób) kölcsönhatás P P dipól-dipól kölcsönhatás A P indukált dipól kölcsönhatás A A diszperziós erők A P A P A A P P AP AP AA PP H 2 A fehérje konformációt nagyszámú, kisenergiájú kölcsönhatás együttesen hozza létre. Egy tagú peptidláncból akkor képződik stabilis gombolyag, ha a belsejében az apoláris oldalláncok halmozódnak és a lánc gerincének poláris csoportjai egymással le vannak kötve. Ilyenkor a vízmolekulák a gombolyag belsejéből kiszöknek.

35 A fehérjemolekula konformációját a peptidlánc gerincének konformációja határozza meg -C-NH-C α HR-C-NH-C α HR-C-NH- a peptidlánc gerince a gerinc görbületét az ω, φ és ψ diéderszögek értékei írják le C α NH C C α NH C C C α NH C C α ω φ ψ NH torziós v. diéder szög

36 a C-NH konjugáció miatt ω mentén nincs szabad forgás C α C N C α ω = 180 o ω = ~ 180 o ω = ~ 0 o

37 N Cα - C - N ψ ψ = 180 o C N C α C φ φ = 180 o

38 Φ = 180 o ψ = 180 o Φ = 0 o ψ = 180 o R = H! ψ L Φ = 180 o ψ = 0 o Ramachandran diagram nincs szabad körbe forgás Φ Φ = 0 o ψ =0 o

39 lepke Φ = o ψ = +135 o ψ NH C Φ csavart NH C Φ = - 57 o ψ = - 47 o előnyös helyzetek

40 Másodlagos szerkezetek keratin dimer mikrofibrillum protofilament a hajszál szerkezete α-hélix csavart elemek egymás fölött mikrofibrillum makrof. H-kötések 5,47 A = = 3,61. 1,50 A peptidlánc

41 H- kötések párhuzamos láncok 6,95 A = 2. 3,47 A β-redőzött réteg váltakozó lepke elemek szalagot képeznek H- kötések az R-csoportok az alsó és a felső oldalon a törésvonalakon sorokat alkotnak ellentétes láncok

42 egymásra halmozott β-rétegek GAGAGAGAGA Selyem fibroin

43 Harmadlagos szerkezet másodlagos szerkezetű szakaszok + összekötő szakaszok, hurkok α-szerkezetek mioglobin 153 as

44 α/β-szerkezetek aszpartát karbamoiltranszferáz flavodoxin plasztocianin

45 hidrofób csoportok hidrofil csoportok α-szénatomok hálózata olaj szappan micella citokróm c - a gombolyag belsejéből kiszorul a víz - A H-donorok és akceptorok egymással vannak lekötve

46 Ámbrás cet mioglobinjának H-hélixe hidrofób csoportok 18 as > 5 menet hidrofil csoportok AQGAM NKAL E LFRKDI AA

47 Antiparallel β-réteg a concanavalin-a felületén a peptidláncok gerince fehér hidrofil csoportok hidrofób csoportok

48 denaturált állapot rendezetlen lánc (random coil) mozgási szabadság Felgombolyodás, összetekeredés (folding) energiatölcsér E intramolekuláris kontaktusok száma H-kötések száma (szekunder struktúra) natív szerkezet felgombolyodott állapot hidrofób kontaktusok száma (apoláris kölcsönhatás) elfoglalt térfogat Az elsődleges szerkezet egyértelműen meghatározza a fehérjemolekula térszerkezetét (ez lehet rendezetlen is!). Biztosítja ebben az irányban a gyors felgombolyodást (msec!).

49 Negyedleges szerkezet fehérje asszociátumok hemoglobin

50 Fehérjék működés közben kovalens szerkezet? térszerkezet? funkció 1. HIV proteáz (homodimer) enzim-szubsztrát komplex oldallánc zsebek hasadó kötés