Aminosavak, peptidek, fehérjék

Átírás

1 Aminosavak, peptidek, fehérjék

2 Jelentőség Protein (Berzelius: protos, proteios) ligo- és polipepitdek (hormonok) Önmagában hormon és neurotranszmitter

3 Aminosav bifunkciós vegyület Aminocsoport Karboxilcsoport 2 Acilezhető Aminosav esetén peptid lesz R C Savszármazék Észteresíthető, 2 C 3 C R R ikerion

4 Csoportosítás

5 Amino- és karboxilcsoport relatív (oxovegyületek) 2 C 3 α -alanin C 2 helyzete szerint β -alanin C R 3 R 2 (S)-β 3 (S)-β 2 2 C 2 C GABA EACA R 3 R 2 (S,S)-β 2,3 R 3 R 2 (R,S)-β 2,3

6 Kapcsolódó oldallánc típusa szerint 2 C R 2 2 S S 2 2 R R S C C R S C C R 2 C R 2 2 S S 2 2 R S C C R S C C R C 2 2 C antranilsav C

7 Előfordulás szerint proteinogén Genetikai kód ldallánc szerint: neutrális aminosavak 2 CC 2 CC C 3 2 CC C C 3 glicin, Gly, G alanin, Ala, A C 3 valin, Val, V 2 CC CC 3 C 3 leucin, Leu, L 2 CC C C 3 C 3 izoleucin, Ile, I

8 Előfordulás szerint proteinogén ldallánc szerint: neutrális aminosavak 2 CC 2 CC 2 CC fenilalanin, Phe, F tirozin, Tyr, Y triptofán, Trp, W

9 Előfordulás szerint proteinogén ldallánc szerint: neutrális aminosavak C 2 CC 2 CC C C 3 prolin, Pro, P szerin, Ser, S treonin, Thr, T 2 CC 2 CC 2 CC S cisztein, Cys, C S S 2 C C cisztin S C 3 metionin, Met, M

10 Előfordulás szerint proteinogén ldallánc szerint: bázisos aminosavak 2 CC 2 CC 2 CC 2 lizin, Lys, K C 2 arginin, Arg, R hisztidin, is,

11 Előfordulás szerint proteinogén ldallánc szerint: savas aminosavak 2 CC 2 CC C aszparaginsav, Asp, D C glutaminsav, Glu, E

12 Előfordulás szerint proteinogén ldallánc szerint: aminodikarbonsav-monoamidok Valójában semlegesek 2 CC 2 CC C 2 aszparagin, Asn, C 2 glutamin, Gln, Q

13 Előfordulás szerint ritka Szekunder módon képződnek 2 CC 2 CC 2 CC 2 CC C C 2 hidroxilizin 2 ornitin C 2 citrulin C α -aminoadipinsav 4-hidroxiprolin 2 CC 2 CC I I 3,5-dijódtirozin I I I tiroxin I

14 Aminosavak 2,,, C Amino- és karboxilcsoport egy molekulában. Csoportosítás - az amin rendűsége szerint (első, másod, harmad, negyedrendű) - az amino- és karboxil-csoportok száma szerint monoamino-monokarbonsav diamino-monokarbonsav monoamino-dikarbonsav, stb - a szénlánc szerkezete szerint nyíltláncú, gyűrűs, alifás, aromás

15 yíltláncú, alifás, monoamino-monokarbonsavak 2 C 3 C C C 3 β 2 α 2 1 Amino-ecetsav Amino-etánsav Glicin α-amino-propionsav 2-amino-propánsav Alanin 2 C 2 ( ) 5 C β-amino-propionsav 3-amino-propánsav β-alanin ε-amino kapronsav 6-amino-hexánsav

16 2 - -C Glicin (Gly) G Glycin Fehérjealkotó aminosavak R 2 C α-c-n helyettesített α-aminosavak C Prolin (Pro) P R = C 3 C 3 C 3 C 3 C 3 C 3 C 3 Alanin (Ala) A Valin (Val) V Leucin (Leu) L Izoleucin (Ile) I Isoleucin Fenilalanin (Phe) F Phenylalanin Szerin (Ser) S Serin C 3 S Cisztein (Cys) C Cystein Treonin (Thr) T Threonin S C3 Metionin (Met) M Methionin -S-S- Cisztin

17 R = Tirozin (Tyr) Y Tyrosin Aszparaginsav (Asp) D Aspartic acid 2 Triptofán (Trp) W Tryptophan 2 Glutaminsav (Glu) E Glutamic acid isztidin (is) istidin 3 Lizin (Lys) K Lysin 2 2 Arginin (Arg) R Arginin Fehérjealkotó aminosavak: glicin, alanin + 18 alaninszármazék Aszparagin (Asn) Asparagin Glutamin (Gln) Q Glutamin királisak, L konfiguráció, S(Cys R)

18

19 Fizikai tulajdonságaik

20 Ikerionosak +Cl R C C 3 Cl R C C 2 R C C 3 +a R C C 2 a + 2

21 Ikerionosak pi=6 izoelektromos pont a ekvivalens Izoelektromos pont: az a kémhatás (p érték), amelyen az aminosav nem rendelkezik formálisan töltéssel

22 Izoelektromos pont pk 2 = 9,60 A két disszociációs állandó számtani közepe pk 1 = 2,34

23 Bázisos aminosavak 3 CC 3 CC CC 2 pi: 9,59

24 Izoelektromos pont a töltéssel rendelkezik: a semleges állapotot szegélyező pk értékek átlaga

25 Savas aminosavak 3 CC 3 CC +2 C C - 2 CC C pi: 3,22

26 Térszerkezet

27 Relatív konfiguráció C C C C 2 C 2 C C 2 C 2 R R R R L-aminosav D-aminosav

28 Abszolút konfiguráció (CIP) 3 3 C C S 2 C [S ]-alanin [R]-cisztein

29 Természetben előforduló D-aminosavak C 3 R 2 4 C 2 1 C C C 2 C 2 C C D-glutaminsav S 2 S 2 4 C 3 1 C C C 2 C 2 3 C C C 3 3 C C C 3 S S D-penicillamin

30 Aminosavak kimutatása

31 inhidrin reakció 2 2 R -2 2 C R C 2 2 -RC R -C 2 R - 2 ibolya

32 Ipari szintézisek

33 DL-metionin akrolein C 3 -S 3 C S C 3 C S 3 C2 C 2 a Me S -, -C 3 2 Me S

34 DL-glutaminsav C akrilnitril C kat. C 3 C 2 C / 2 2 C C C C

35 Azlakton szintézis C Ph Ac 2 azlakton Ph Ar-C - 2 Ar Ph 2 / kat. Ar 2 Ar Ph

36 Malonészter eljárás CEt CEt a 2 Ac CEt CEt Zn/Ac Ac 2 Ac CEt CEt 1. Eta 2. R-lg 3 Cl C C R Li vagy piridin Cl/ 2 Ac C C R C a Ac CEt C R CEt C 3 C R

37 Gabriel-szintézis K + Br CEt CEt CEt CEt Eta CEt Et R-lg 3 Cl C C R Cl/ 2 C C 2 C C R C a CEt R CEt

38 Strecker-Zelinszkij-szintézis Me 3 Me C Me 2 C Me 2 C

39 Glicin szintézise 3 Cl C 2 C 3, C 2 / 2 C

40 Rezolválás

41 Frakcionált kristályosítás 3 R C 1. C 6 5 CCl a 2. Cl Ph R C enantiomer tiszta királis bázis pl. brucin Ph R C ( -)-Bázis Ph C + diasztereomerek ( 1:1) racém (±) (±) (-) (+) R ( -)-Bázis frakcionált kristályosítás Ph C Cl/ 2 Ph C ( -)-Bázis R (-) rezolvált enantiomer R (-)

42 Enzimatikus rezolválás 3 R C 1. Ac 2 a 2 C 3 2. Cl Me R C enzim pl. CAL-B 2 R C racém (±) racém (±) (+) (-) + Me R C CAL-B: Candida antarctica Lipáz-B

43 1. Sav-bázis jelleg C aminoecetsav gyakorlatilag nem létezik Kémiai tulajdonságok C glicin ikerion gyenge sav gyenge bázis pi=6 izoelektromos pont alanin pufferhatása

44 2. Karboxilcsoportra jellemző tulajdonságok savszármazékok amidok 3. Aminocsoportra jellemző tulajdonságok acilezhető α-aminosavval acilezett α-aminosav peptid 1. Kinyerés fehérje hidrolizátumból, vagy fermentléből pl. lizin (Lys) cukorgyári melaszból 2. Kémiai szintézis α-aminosavak előállítása β α c. Strecker szintézis a. ammónia b. Gabriel szintézis d. malonészter szintézis

45 a. alogénezett karbonsavból ammóniával Cl C C + 4 Cl b. Gabriel-szintézissel glicin c. Strecker-Zelinszkij szintézis aldehidből C α 4 Cl 4 C - 2 C C 2 2 C C 2 α-aminonitril DL-fenilalanin

46 d. Malonészterből α β malonsavdietilészter acetamino-malonészter malonészter DL-szerin hidroklorid

47 Peptidek peptidkötés 2 C C 2 C C C C C C R 1 α-aminosavak R 2 R 1 peptid R 2 2 C C C C C C n Q Q Q -terminus (amino láncvég) polipeptid (fehérjelánc) (a Q húszféle csoportot jelenthet!) C-terminus (karboxil láncvég) polikondenzáció, poliamid

48 C C--C-C-- -C glicil - alanil - glicin -Gly-Ala-Gly- GAG

49 Peptidek szerkezetmeghatározása 1. Aminosav összetétel: hidrolízis aminosav analízis a. papírkromatográfia, vékonyréteg-kromatográfia előhívás b. oszlopkromatogáfia - ioncserélő - RP-PLC származék képzés elválasztás után elválasztás előtt

50 2. Peptid szekvenciameghatározás R 1 R 3 a. Edman lebontás C S fenil-izotiocianát + 2 _ R 2 S R 1 R 2 R 3 + R 1 S 2-anilino-tiazolidin-5-on vizes Cl + fenil-tiokarbamoil-peptid TFA 2 R 2 R 3 S R 1 _ 2 S 3-fenil-2-tiohidantoin (PT-aminosav) feniltiokarbamoil-aminosav R 1

51 Peptidszekvencia meghatározás tömegspektrométerrel Tömegspektrométer: 1. a vizsgált molekulákat ionizálja 2. az elektromos térben felgyorsított ionokat m/z értékük szerint szétválasztja VSPTDIEEGMR a. fragmentálódás b. y fragmensek

52 + Peptidszintézis --C-C- + --C-C- + --C-C- + Q 1 Q 2 Q C-C--C-C--C-C-... Q 1 Q 2 Q 3

53 Dipeptid szintézis R 1 R védés R 2 R 2 R 1 Y védés védőcsoport eltávolítás aktíválás Y R 1 X 2 Z kapcsolás Y R 1 Z R 2 R 2 Védőcsoport: átmenetileg megszünteti egy funkciós csoport reaktivitását, legyen könnyen, jó hozammal bevihető és enyhe körülmények közt eltávolítható X = aktíváló csoport Y = amino-védőcsoport, Z = karboxil-védőcsoport

54 Val 2 CC 1 -metil-try 2 C CCl piridin védelem védelem C 3 C C C C 2 aktiválás 2 C 3 védett triptofán származék C C C 2 -védett-c-aktivált valin DCC, Cl 2 C 2 / Pd C C 3 C C C C 3 valil- 1 -metiltriptofán C C 2 + C C

55 2 R3 Y R3 Y R3 X Y R1 Z R2 2 R1 Z R2 Y R1 R2 Y R1 X R2 Z Y R1 R2 R3 Z Y R3 R1 R2 2 Z R3 2 R3 C C szelektív védőcsoport hasítás racemizáció! Tripeptid szintézis, lánchosszabbítás

56 Uretán típusú aminovédőcsoportok szénsav félamid-félészter uretán C 2 5 C 2 fluoren Z -, -karbonsav Ph --C-Cl C Ph --C-- -Ca Z = benziloxi-karbonil, Boc = terc.-butiloxi-karbonil, Fmoc = 9-fluorenilmetiloxi-karbonil

57 Karboxil védőcsoport: benzil-észter, terc.-butil-észter ldallánc védőcsoport: Asp, Glu, Lys, Cys (Arg, is, Ser, Thr, Tyr, Asn, Gln) A védőcsoportokra a szintézis végéig szükségünk van az oldalláncokon és a felépítendő molekula láncvégein (tartós védelem), a továbbépülő láncvégeken a védőcsoportot minden láchosszabbítás előtt szelektíven el kell távolítani (átmeneti védelem).

58 Aktiváló csoportok: aktív észterek p-nitrofenil-észter -hidroxi-szukcinimid- észter kondenzálószerek diciklohexil-karbodiimid (DCC) DCU

59 védőcsoportok: átmeneti: Boc tartós: Z, Cys(Bzl) C-term.- on nem kell, mert amid Peptidek az élő szervezetben: hormonok, neurotranszmitterek xitocin szintézis M. Bodánszky, V. du Vigneaud aminosav, 8 peptidkötés láncépítés: 2x7+1 reakciólépés + 1 végső védőcsop. eltáv. + 1 diszulfid képzés = 17 reakciólépés, 15 izolált intermedier

60 Szilárd fázisú peptidszintézis polimer hordozó 1. funkcionalizálás polisztirol- 0,5% DVB 2. az első védett aminosav kapcsolása 3. az átmeneti védőcsoport eltávolítása 4. a következő védett aminosav kapcsolása R R 5. a 3. és 4. lépés ismétlése szükség szerinti számban Cl R'-C 6. a peptid lehasítása a gyantáról, az összes védőcsoport eltávolítása R' R R. B. Merrifield 1963

61 nagy reagens felesleg: gyors reakció, 100% konverzió izolálás: mosással tisztítás: PLC (csak a végtermék tisztítható) miniatürizálás automatizálás hagyományos (oldatfázisú) peptidszintézis vegyszerigény kicsi nagy oldószerigény kicsi nagy szilárdfázisú hozam közepes magas (>90%) sarzsméret g-tól több kgig (>0,1g) automatizálható nem igen időigény nagy kicsi néhány mg-tól több g-ig munkaigény nagy igen kicsi intermedier izolált, tisztítható nem izolálható ezért nem tisztítható

62 Fehérjék több száz (ritkán több ezer) aminosavból álló polipeptidlánc, többnyire stabil konformáció (a felületi hurkok, oldalláncok mozgékonyak, a vázelemek is elmozdulhatnak egymás mellett) A fehérjék szerepe az élő anyagban alapvető protein (proteosz = első) proteom: egy sejt, szövet, vagy egy élőlény teljes fehérjekészlete (vö. gén genom)

63 Fehérjék molekulaszerkezete KSTITÚCIÓ 1. Elsődleges szerkezet: aminosav sorrend (szekvencia), meghatározása tömegspektrometriával, DS szekvencia alapján KFRMÁCIÓ (meghatározása Röntgen diffrakcióval, MR-rel) 2. Másodlagos szerkezet: periodikusan rendezett szakaszok 3. armadlagos szerkezet: jellemzően gombolyagszerkezet: periodikusan és nem periodikusan rendezett szakaszokból áll Szerkezeti típusok: - fonal (fibrilláris) - gombolyag (globuláris) sokszor egy láncon több gombolyag (domének) - membránfehérje, transzmembrán szakasz(ok) - eredendően rendezetlen fehérje (nincs stabilis konformációja, IDP, IUP) 4. egyedleges szerkezet: több láncból álló fehérje asszociátum szerkezete

64 1. Fehérjék molekulatömeg meghatározása tömegspektrométerrel a. Elektroporlasztásos ionizálás : a többszörösen töltött molekulaionok képződése kiterjeszti a méréshatárt, növeli a pontosságot +16 mioglobin mt: Da b. Mátrixszal segített lézerdeszorbciós ionizálás (MALDI-TF) : a lézerfénnyel gerjesztett mátrix ionizálja a mintát, repülési időből határozza meg a tömeget, fmol (10-18 mol) mintaméret

65 2. Fehérjék aminosavsorrendjének meghatározása (elsődleges szerkezet) A. a. enzimes hidrolízis b. a peptid keverék szétválasztása, a komponensek aminosavsorrendjének meghatározása (LC-MS) c. a szerkezet részletek összeillesztése átfedő szekvenciák segítségével B. a ismert a fehérjét termelő szervezet genomja, a fehérjéből nyert peptid aminosavsorrendjének segítségével azonosítható az őt kódoló gén, és ezzel a fehérje teljes aminosavsorrendje is megismerhető.

66 Fehérjekeverék komponenseinek azonosítása Előkészítés: 1.Fehérjekeverék elválasztása 2D gélelektroforézissel (izoelektromos fókuszálás + SDS-gélelktroforézis), utána enzimes hasítás 2. Enzimes hasítás, utána fordított fázisú kromatográfia (RPPLC) LC-MS Tandem tömegspektrométer (MS/MS) : elválasztás fragmentálás szekvencia meghatározás azonosítás kda 100 ioncsapda detektor szeres felbontás! (ature szerző) 30 7 p3 10 enzimes emésztésre kivett minták 2D elektroferogram Ezen az úton a vizsgált minta, több mintából a vizsgált szervezet teljes fehérje készlete (proteom) azonositható (bioinformatika, nincs szükség a teljes aminosavsorrend meghatározására!). A minta fehérjéinek rendszer szintű vizsgálata is megvalósítható.

67 umán proteom DS pre-mrs mrs fehérje fehérje átírás érés, splicing transzláció transzláció utáni módosulások ~ gén több százezer egy génből többféle mrs polipeptidek módosított polipeptidek Transzláció utáni módosulások: - diszulfid kötések Cys S-csoportok között - peptidlánc hasadás - láncvég módosulások (-terminális Glu - piroglutamil, C-terminális amid Gly lebomlásával) - acetilezés - foszforilezés - glikozilezés Ser, Thr, Asn - fém ionok, kis molekulák kapcsolódása (pl. hem) - stb. összesen ~50-féle glükóz -acetil-glükozamin mannóz galaktóz 5-acetil-neuraminsav fukóz -acetil-galaktozamin

68 a. Röntgen diffrakció: 3. A fehérjék térszerkezetének meghatározása (másod- és harmadlagos szerkezet) A Röntgen sugarak a kristályok rácsán áthatolva szóródnak. Ez a visszavert sugarak interferenciája miatt csak meghatározott irányokban észlelhető. A szóródott hullámok intenzitása (és a beeső sugárhoz viszonyított fázisa) a rácsot felépítő molekuláknak az elhelyezkedésétől függ. Értékükből a rács elemi cellájának elektronsűrűség térképe kiszámítható, ezzel a rácsot felépítő molekulák térbeli szerkezete meghatározható. b. MR spektroszkópia: A térben egymáshoz közel álló atomok közti távolságokra nyerhető MR adatokból is meg lehet határozni a fehérjék térszerkezetét. Ebben segítséget jelent, ha a hidrogén atomokon kívül más MR jelet adó atom pl. 15 is van a molekulában. Ehhez a fehérjét jelzett aminosavakat tartalmazó táptalajon baktériummal kell szintetizáltatni. A távolságadatokból több egymáshoz közel álló alternatív szerkezet nyerhető. c. Elektron mikroszkópia szinkrotron röntgensugárzással kapott diffrakciós kép

69 ~ új szerkezet/év > Fehérje és nukleinsav térszerkezetek a Fehérje Adatbankban (Protein Data Bank) február 28.

70 A fehérje konformáció meghatározói: 1. mozgási (forgási) lehetőségek (a lánc gerince, oldalláncok) 2. konformációt stabilizáló, molekulán belüli (intramolekuláris) kölcsönhatások - poláris hidrogénkötés sókötés - apoláris hidrofób kölcsönhatások a peptidlánc gerince: poláris - hidrogén donor C = hidrogén akceptor az aminosav oldalláncok: kétfélék poláris (hidrofil) D, E, K, R; S, T,, Q, Y, W apoláris (hidrofób) A, V, L, I, F, P, M nem kategorizálható G, C

71 Apoláris (hidrofób) kölcsönhatás P P dipól-dipól kölcsönhatás A P indukált dipól kölcsönhatás A A diszperziós erők A P A P A A P P AP AP AA PP 2 A fehérje konformációt nagyszámú, kisenergiájú kölcsönhatás együttesen hozza létre. Egy tagú peptidláncból akkor képződik stabilis gombolyag, ha a belsejében az apoláris oldalláncok halmozódnak és a lánc gerincének poláris csoportjai egymással le vannak kötve. Ilyenkor a vízmolekulák a gombolyag belsejéből kiszöknek.

72 A fehérjemolekula konformációját a peptidlánc gerincének konformációja határozza meg -C--C α R-C--C α R-C-- a peptidlánc gerince a gerinc görbületét az ω, φ és ψ diéderszögek értékei írják le C α C C α C C C α C C α ω φ ψ torziós v. diéder szög

73 a C- konjugáció miatt ω mentén nincs szabad forgás C α C C α ω = 180 o ω = ~ 180 o ω = ~ 0 o

74 Cα - C - ψ ψ = 180 o C C α C φ φ = 180 o

75 Φ = 180 o ψ = 180 o Φ = 0 o ψ = 180 o R =! ψ L Φ = 180 o ψ = 0 o Ramachandran diagram nincs szabad körbe forgás Φ Φ = 0 o ψ =0 o

76 lepke Φ = o ψ = +135 o ψ C Φ csavart C Φ = - 57 o ψ = - 47 o előnyös helyzetek

77 Másodlagos szerkezetek keratin dimer mikrofibrillum protofilament a hajszál szerkezete α-hélix csavart elemek egymás fölött mikrofibrillum makrof. -kötések 5,47 A = = 3,61. 1,50 A peptidlánc

78 - kötések párhuzamos láncok 6,95 A = 2. 3,47 A β-redőzött réteg váltakozó lepke elemek szalagot képeznek - kötések az R-csoportok az alsó és a felső oldalon a törésvonalakon sorokat alkotnak ellentétes láncok

79 egymásra halmozott β-rétegek GAGAGAGAGA Selyem fibroin

80 armadlagos szerkezet másodlagos szerkezetű szakaszok + összekötő szakaszok, hurkok α-szerkezetek mioglobin 153 as

81 α/β-szerkezetek aszpartát karbamoiltranszferáz flavodoxin plasztocianin

82 hidrofób csoportok hidrofil csoportok α-szénatomok hálózata olaj szappan micella citokróm c - a gombolyag belsejéből kiszorul a víz - A -donorok és akceptorok egymással vannak lekötve

83 Ámbrás cet mioglobinjának -hélixe hidrofób csoportok 18 as > 5 menet hidrofil csoportok AQGAM KAL E LFRKDI AA

84 Antiparallel β-réteg a concanavalin-a felületén a peptidláncok gerince fehér hidrofil csoportok hidrofób csoportok

85 denaturált állapot rendezetlen lánc (random coil) mozgási szabadság Felgombolyodás, összetekeredés (folding) energiatölcsér E intramolekuláris kontaktusok száma -kötések száma (szekunder struktúra) natív szerkezet felgombolyodott állapot hidrofób kontaktusok száma (apoláris kölcsönhatás) elfoglalt térfogat Az elsődleges szerkezet egyértelműen meghatározza a fehérjemolekula térszerkezetét (ez lehet rendezetlen is!). Biztosítja ebben az irányban a gyors felgombolyodást (msec!).