1 A feladatra legalkalmasabb készülék kiválasztásának szempontjai Szabó Pál MTA TTK
Szempontok 2 Feladat Ionizáció Analizátor Felbontás Tandem funkció Tömegtartomány Sebesség/kromatográfia Optikai detektorok Beépített egységek Dinamikus tartomány Szelektivitás Komponensszám Spektrumkönyvtár Érzékenység Robusztusság Szerviz/Szupport
3 Köszönöm a figyelmet
Feladat 4 Mit akarunk mérni: Illékony/nem illékony Kis móltömegű/nagy móltömegű Azonosítás/mennyiségi meghatározás
Ionizáció 5 Elektronionizáció (EI) Légköri nyomású (API) Elektroporlasztás (ESI), nanospray Légköri nyomású kémiai ionizáció (APCI) Fotoionizáció (APPI) MALDI
Analizátor 6 Szektor (E,B) Kvadrupol (Q) Ioncsapda (Trap) Lineáris ioncsapda (QTrap) Repülési idő (TOF) Fourier transzformációs (FT-ICR) Orbitrap (OT)
Felbontás 7 10 % völgy m Felbontás: R = m m Full Width at Half Mass m (50% magasságnál) m 10 % m
Felbontás 8 szektor (E,B) nagy >10,000 kvadrupol (Q) egységnyi ioncsapda (trap) nagy (tömegpontosság) repülési idő (TOF) nagy >10,000 lineáris ioncsapda (LIT) közepes <10,000 orbitrap nagy > 200,000 FT-ICR nagy!!! >1,000,000
Az FT-ICR felbontása 9 11 779.6097 R=1,040,000!!! 779.5187 779.7009 779.4282 779.7924 779.3482 779.8840 779.9759
Tandem funkció 10
Single/Tandem 11 2000 1500 Több száz vegyület rendelkezik 250 körüli móltömeggel. 1000 500 200 400 600 800 1000 molecular weight
Tandem tömegspektrometria 12 Célok Szerkezeti információ nyerése Érzékenység növelése Szelektivitás növelése Megvalósítás Szektor (EBE, BEBE) Kvadrupol (QqQ) Ioncsapda (MS n ) Repülési idő (TOF/TOF) Hibrid (QTrap, QTof)
Tömegtartomány 13 Alsó érték: 0-5 Felső érték: Teres analizátorok: néhány ezer TOF: >10 000 LMR/HMR: 1250/2000
Tömegtartomány 14 Recombinant Antibody Spectrum, 148.2 kd 147900 deoxyhexose 148000 148350 Hexose 148200 Hexose Hexose =35 ppm 148500 Hexose
Tömegtartomány 15 Hybrid complex Dimer α 7 β 7 β 7 α 7
Sebesség/kromatográfia 16 GC, HPLC, UHPLC Dwell time Ciklusidő Komponensszám
Optikai detektorok 17 UV/VIS DAD Vegyük figyelembe az érzékenységbeli különbségeket!
Beépített egységek 18 Fecskendőpumpa (optimáláshoz) Váltószelep (Injektor/diverter mód)
Dinamikus tartomány 19
1000.0 2000.0 3000.0 4000.0 5000.0 6000.0 7000.0 8000.0 9000.0 1.0e4 0.0 Concentration,ng/mL Dinamikus tartomány 20 8.3e6 8.0e6 0,1-10 000 ppb 7.5e6 7.0e6 6.5e6 6.0e6 5.5e6 5.0e6 4.5e6 4.0e6 3.5e6 3.0e6 2.5e6 2.0e6 1.5e6 1.0e6 5.0e5 0.0
Dinamikus tartomány 21 Várt Analyte Area / IS Area Tapasztalt 0 100 200 300 400 500 Analyte (pg/ul) / IS (pg/ul)
Spektrumkönyvtár 22 Mi szükséges egy LCMS spektrumkönyvtárhoz? Hármas kvadrupol alapú MSMS (fragmensekben gazdag) Gyors MSMS scan Nagy érzékenység Ez pont a QTrap!!!
Spektrumkönyvtár 23
Komponensszám 24 Tipikus csúcsszélesség egy HPLC futás során ~ 21 sec Minimálisan szükséges adatpontok száma ~10 Minimális dwell time / ion ~ 5msec Minimális pause time az MRM átmenetek között ~ 2msec MRM átmenetek maximális száma: = 21 sec/csúcs 10pont/csúcs 7 msec/pont = 300
Komponensszám 25 Ajánlás 2002/657/EG SIM és MRM (4 azonosítási pont) MS anyaion 1.0 MS 2 fragmens 1.5 2 MRMs = 4 (megfelelő ionarány) Full scan spektrum (spektrumkönyvtár) Nagyfelbontású MS (>10 000)
Komponensszám 05e6 26 11.79 00e6 QqQ:150 QTrap: 300 950e5 900e5 850e5 800e5 750e5 700e5 650e5 600e5 550e5 500e5 50e5 00e5 350e5 300e5 50e5 00e5 50e5 00e5 500e4 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Tim e,m in 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
Komponensszám 27 0.58 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 Time, min XICof MRM(150pairs):167.2/85.1amuExpectedRT:0.6ID:Cyromazine1fromSample2(Std10)ofDatarealsamplesMRM_fast.wif. Max.3.6e5cps. QTrap: Scheduled MRM: akár 1000 komponens!
Komponensszám 28
Szelektivitás/komponensszám 29 Komp/inj Érzékenység Szelektivitás Retrospektív Q SIM <100 - - Nem QqQ MRM 150 Nem QTrap MS 3 <100 Nem QTrap MRM/EPI 300 Nem QTrap smrm 1000 Nem TOF MS Korlátlan Igen TOF MSMS <1000 Nem TOF MSMS SWATH Korlátlan Igen
Érzékenység 30 Ionizáció (ESI, APCI, APPI, etc.) Készülékparaméterek lencsefeszültségek ütközési energia (MS/MS) felbontásbeállítás Minta koncentrációja Injektált térfogat Minta/mátrix tulajdonsága (friss, régi, ph) LC oldószer, gradiens áramlási sebesség Detector fajtája Matematikai algoritmusok a S/N számolásakor
Érzékenység 31 Módszer: API 4000 QqQ Agilent 1200 ACN/víz 70:30 2mM NH4OFA Injektált térfogat: 5uL (50 pg on column) Változtatott paraméterek: S/N számítási módszer Peak-to-peak,1SD, 3SD Zaj kiválasztása LC áramlási sebesség: 200ul/perc től 1ml/percig
Érzékenység 32 S/N = 2214 S/N 3 x Std Dev no smoothing S/N = 13592 S/N 1 x Std Dev single Gaussian smooth Hatszoros növekedés csupán azzal, hogy Gaussian smooth és1x Std Dev
Érzékenység 33 Egy másik apró trükk: a zajt a csendesebb régióból véve 40x jobb a S/N S/N = 42160 S/N 1 x Std Dev single Gaussian Smooth selective choice of noise Gain of factor 40
Érzékenység 34 Peak - Peak 3 XSD 2 X SD 1 X SD 1 X SD noise selection No Smooth 1939.5 2214.4 3321.6 6765.7 - Single Smooth 3831.4 4104.8-12092.2 - Single Gaussian Smooth 4371.7 - - 13592.3 42160.4 Double Smooth 4421.5 4654.3-15934.9 - Triple Smooth 4628 5101.2-17558.6 - Quadriple Smooth 4868 5485.6-15276.7-200 µl/min 1939.5 - - - - 800 µl/min 7670.5 - - 30983.8 (1x Gauss. smooth) 357870.7 (1x Gauss smooth)
Érzékenység 35 Eladó: Vevő: Eladó: Mennyit tetszik kérni? 1939,5-öt! 357 870,7 lett! Maradhat?
Érzékenység 36 deflector Digital pulse counting detector C o u n t s x10 1 2 1.75 1.5 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0-0.25 4.74 5.41 4 4.5 5 5.5 The effect of the noise discrimination threshold used with analog detectors C o u n t s x10 1 2 1.75 1.5 1.25 1 0.75 0.5 0.25 0-0.25 4.74 5.41 4 4.5 5 5.5
Robusztusság 37 légköri nyomás CUR DP SK vákuum Q0 FP N 2
Robusztusság 38
Robusztusság 39 2.00E05 1.80E05 1.60E05 1.40E05 Methomyl 3.1% Carbaryl 3.3% Aldicarbsulfone 3.6% Aldicarb 3.6% Response 1.20E05 1.00E05 8.00E04 6.00E04 4.00E04 2.00E04 0.00E00 0 200 400 600 800 1000 1200 Injection Number Szpájkolt talajminta (50ng/mL); 1200 injektálás (3.5nap)
Szerviz/Szupport 40 Előkészítés Installálás Verifikálás Hibakeresés Javítás Karbantartás Képzés Betanítás Tréning Alkalmazások Segítségnyújtás www.perforum.hu
Pénz 41 A legjobb MS-t vegyük, ami kijön! Utólag az LC mindig fejleszthető!
Most legyünk okosak! 42