Folyadékkromatográfiás detektorok

Átírás

1 Folyadékkromatográfiás detektorok Jelzett vegyületek elválasztástechnikája Dr. Szikra Dezső Debreceni Egyetem Orvos- és Egészségtudományi Centrum Nukleáris Medicina Intézet Ideális kromatográfiás detektorral szembeni elvárások Érzékeny legyen Minden komponenst detektáljon Ne befolyásolja a hőmérséklet vagy az áramlási sebesség változása Az eluensösszetétel ne befolyásolja Ne járuljon hozzá a kolonnán kívüli csúcsszélesedéshez Megbízható és kényelmes legyen A válaszjel lineárisan változzon a mérendő komponens koncentrációjával Ne károsítsa a mintát Adjon minőségi információt a detektált csúcsról

2 Detektorok csoportosítása makroszkópos tulajdonságot mérő detektorok mindenre ad jelet, nem specifikus, alacsony érzékenység, pl: RI, fényszórás Minta specifikus detektorok a minta komponenseire ad válaszjelet, pl: UV, FL, vezetőképességi, elektrokémiai, RA Euenst módosító detektorok az eluenst megváltoztatva a mintakomponensek tulajdonságait is megváltoztatják, pl: származékképzés, CAD, MS, ELSD Csatolt technikák független analitikai műszer és HPLC összekapcsolásával létrehozott technika, pl: MS, IR, NMR Detektorzaj Short-term noise: 1 percnél jóval rövidebb ciklusidejű alapvonal zavar Peak-to-peak noise: az alapvonal szélsőértékeinek távolsága a megfelelő mértékegységben (Au, mv) Zajcsökkentés Hálózati kábel zajmentesítése: zavarszűrős elosztó Adatkábel zajmentesítése: árnyékolsá, megfelelő időállandójú RC tag Adatgyűjtési frekvencia csökkentése (de min. 20 pont/csúcs!) Long-term noise: az alapvonal hosszú távú ingadozása, elektromos zajszűréssel nem csökkenthető, oka: kosz Baseline drift: az alapvonal fokozatos eltolódása, eluensösszetétel, hőmérséklet változás okozza

3 jel/zaj arány Jel/zaj arányból adódó pontatlanság: LOD: S/N=3, 16% RSD LOQ: S/N=10, 5% RSD RSD% = 50 S/N Növelése: Detektálási hullámhossz változtatás Származékképzés Detektor típus változtatás Minta tömeg növelés Csúcsszélesség csökkentés (kolonna átmérő, retenció csökkentés) Jelsimítás Pontosabb termosztálás Tisztább eluensek Hatékonyabb minta tisztítás Hatékony eluens keverés (nagyobb dwellvolume) Csúcsszélesítő hatás Korai (2<k) csúcsok kis térfogatban eluálódnak a kolonnáról (csúcstérfogat = alapvonali csúcsszélesség * térfogat áramlási sebesség) A detektorcella térfogata a vizsgálandó csúcs térfogat tizedénél kisebb legyen k=2

4 UV-látható detektorok nm tartomány Lambert-Beer törvény Linearitás: kb. 2 Au-ig Zaj: kb. 10-5Au HPLC méret: 1cm fényút, 1mm átmérő, 8ul térfogat >3um, 100 x 4,6mm kolonnához való Törésmutató változások miatt 1mm alatti átmérő nem jó I A = log 0 = εcl I Eluensek fényelnyelése víz TOC < 50 ppb oldott oxigén eltávolítása nm tartományban harmadával csökkenti az abszorbanciát

5 Fix hullámhosszú detektorok Olcsó Kicsi Levegő referencia Higanygőz lámpa (254nm) Változtatható hullámhosszú detektorok UV: deutérium lámpa Látható: wolfram lámpa Detektálás hullámhosszon egyszerre Stopped-flow spektrumfelvétel

6 Diódasoros detektorok dióda Folyamatos spektrum felvétel: csúcsazonosításra alkalmas Nem elváló csúcsok különböző hullámhosszakon kvantitálhatók Csúcstisztaságvizsgálat Bandwidth megadja, hogy hány dióda jelét átlagolja a detektor egy adott hullámhosszhoz a sávszélesség növelése csökkenti a zajt, rontja a spektrumot

7 Slit width Kis résszélesség magas felbontású spektrumot ad, mely alkalmas lehet csúcsazonosításra spektrumkönyvtár segítségével de zajos alapvonal Reference wavelength A referencia hullámhossz használata a lámpa fényerejének változásait és az eluens törésmutatójából adódó változásokat kompenzálja (drift) Ha túl közel van a detektálási hullámhosszhoz, a csúcsmagasságok csökkennek

8 csúcstisztaság vizsgálat: TUV Csúcstisztaság vizsgálat: PDA

9 Hibalehetőségek Nem megfelelően gázmentesített eluensből buborékok keletkezhetnek a detektorcellában - back pressure regulator Lámpaélettartam véges h garantált Rendszeresen ellenőrizni kell a lámpaenergiát pl: 230nm-en Fluoreszcens detektorok Nagy érzékenység fluoreszkáló anyagokra Származékképzéssel sok anyag vizsgálható Széles spektrumú lámpa (deutérium) vagy xenon villanólámpa Gerjesztési- és detektálási hullámhossz külön-külön választható szűrő vagy monokromátor segítségével Emissziós hullámhossz mindíg magasabb, mint a gerjesztési Gyakran 100x érzékenység UV-hoz képest kb. 104 dinamikus tartomány, de kisebb lineáris taromány (néha csak 1 nagyságrend) Gradienssel használható, ha az eluensek tiszták A mintamátrix, vagy az oldott oxigén kioltást eredményezhet

10 Amperometriás detektorok Egy polarizált és egy referencia elektród közötti áramerősséget méri az alkalmazott feszültség függvényében Az áramerősség arányos a vizsgált anyag koncentrációjával Elektromosan vezető eluens szükséges Finomhangolással nagyon szelektívvé tehető A legérzékenyebb HPLC-s detektor de nagyon tiszta eluenst igényel Glassy carbon vagy arany munkaelektród oxidácó fenolok oximok merkaptánok peroxidok aromás aminok purinok heterociklusos vegyületek redukció ketonok aldehidek oximok konjugált savak konjugált észterek konjugált nitrilek aktivált halogenidek aromás halogenidek nitro vegyületek heterociklusos vegyületek nem detektálható éterek alkánok alkoholok karbonsavak Vezetőképességi detektorok Elsősorban szervetlen ionok és szerves savak meghatározására Puffert tartalmazó eluensek a magas háttér vezetőképesség miatt csökkentik az érzékenységet Ion szupresszor kolonnával csökkenthető az effluens vezetőképessége

11 Törésmutató detektorok Ék alakú dupla flow cell: referencia és minta ág A minta ágban érkező eltérő törésmutatójú anyagok eltérítik a fényt megváltozik a fotodiódákat érő fény aránya A mintától jelentősen eltérő törésmutatójú eluens esetén nagyobb érzékenység (így is maximum 0,1%-os koncentrációig használható) Gradienssel nem használhatóak (on-line keverés is kerülendő) Precíz termosztálás nagyon fontos (1-2 óra melegedés) Eluenst nem töltünk után mérés közben! Evaporative Light-Scattering Detector (ELSD) Az eluens elpárologtatása után a nem illékony komponens részecskék fényszórásának méri Illékony anyagokra alacsony érzékenység Gradiens elúcióval alkalmazható, hőmérsékletre nem érzékeny Illékony eluenst kell alkalmazni 1-2 nagyságrend lineáris tartomány, de magasabb dinamikus tartomány RI-nél 1-2 nagyságrenddel érzékenyebb

12 Condensation Nucleation Light-Scattering detector (CNLSD) Magasabb érzékenység (10-100x) Szélesebb lineáris (103) és dinamikus (105) tartomány Az eluens bepárlása után telített oldószergőzt kevernek a részecskékhez, melyeken kondenzálódik Laser Light-Scattering Detectors (LLSD) Fényszórás mérés elpárologtatás nélkül Lézer fény szóródását mérik 3-18 különböző irányban Anyagmennyiség meghatározására alkalmas kalibráció nélkül Polimerek molekulatömegének meghatározása Da tartományban

13 Corona-Discharge Detector (CAD) Az eluenst elpárologtatva korona kisüléssel ionizált nitrogén gázzal keveri és a képződött ionokat elektrométerrel méri Az eluensnél alacsonyabb illékonyságú komponensek mérhetőek Széles dinamikus tartomány (104) Érzékeny, akár 0,05% szennyező is mérhető a főkomponens mellett MS detektorok Analizátor MS MS/MS TOF Q-TOF Iontrap Interfész ESI APCI APPI

14 Kolonna előtti származékképzés ninhidrin Aminosav analízis

15 Kolonna utáni származékképzés Ryuji Nakaoa, Takehito Itoa, Masatoshi Yamaguchi, Kazutoshi Suzuki, Improved quality control of [18F]FDG by HPLC with UV detection, Nuclear Medicine and Biology 32 (2005) Inertsil NH2 kolonna, 90%ACN 100 oc, 10m 0,5mm PTFE reaktor

16 Hibaelhárítás Rendszeres ellenőrzés System suitability tesztek: felbontás, tányérszám, csúcsaszimmetria System performance tesztek Megelőző karbantartás Javítás

17 Gradiens teszt A: víz B: 0,1% aceton Det: 265nm Flow: 1ml/min 1m 0,1mm PEEK cső 20 perc gradiens idő Egyenest kell kapnunk Lépcső teszt %B lépcsők 3 percenként

18 Gradiens keverőszelep teszt System performance

19 Megelőző karbantartás Folyadékszállítás Buborékmentesítés: metanol Eluens szabad áramlás: min 10x flow Golyósszelep tisztítás: UH metanolban Csatlakozók: meghúzás, újra csatlakoztatás, csere

20 Tisztaság szellemcsúcsok elkerülése HPLC minőségű oldószerek és sók az eluenskészítéshez Milli-Q víz: 0,22um szűrés, ioncsere, aktív szén, UV oxidáció Minden oldatot szűrni kell (0,45um, 0,22um) Eluenstartó edényeket mosogatás után 10x öblíteni TFA tisztán bomlékony ampullázottat érdemes venni Keresztszennyezések 1. Térfogati keresztszennyezés: állandó arányú szennyezés tűmosás, csatlakozások, rotor seal 2. Adszorpciós keresztszennyezés: lassan csökkenő mértékű szennyezés Minta oldat és mosófolyadék szerves oldószertartalmának növelése 3. Részleges elúció: izokratikus elválasztásnál, nagy csúcsszélesség

21 Hibaelhárítási szabályok Oszd meg és uralkodj, pl: módszer vagy készülék Könnyű hatásos, pl: áramlási sebesség vagy eluens Egyszerre csak egyet Csak az hiba, ami kétszer előfordul Moduláris csere Tedd vissza