DOKTORI ÉRTEKEZÉS (Ph.D.) TÉZISEI GLIOMÁK KEZELÉSE CITOKINEKET TERMELO TUMORSEJT VAKCINÁCIÓVAL ÉS GYÓGYSZER- ÉRZÉKENYÍTO GÉNTERÁPIÁVAL EGÉR TUMOR MODELLEN DR. DÉSAKNAI SZILVIA Programvezeto: Prof. Dr. Falus András Témavezeto: Dr. Sáfrány Géza Készült a Humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai c. Ph.D. program keretében Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Budapest 2002
I. Bevezetés A malignus agydaganatok közé tartozó gliomák prognózisa a hagyományos kezelési módszerek mellett rendkívül rossz, az ötéves túlélés mindössze 5-6%. A sebészi és kemoterápiás kezelés korlátai miatt nagy jelentosége van új terápiás eljárások kidolgozásának. Jelen munkánk során kétfajta génterápiás módszert vizsgáltunk a gliomák kezelésében: részben a citokineket termelo daganatsejt vakcinák, részben pedig a gyógyszerérzékenyíto génterápia hatását tanulmányoztuk. Kísérleteinket in vitro körülmények közt, valamint egér tumor modellen végeztük, vektorként adenovírusokat alkalmaztunk. A citokinek az immunrendszer tumorellenes aktivációját idézik elo, hatásukat feltehetoleg az antigén prezentáló sejtek stimulálásával fejtik ki. A vakcinációs módszer lényege, hogy a beteg mutéti úton eltávolított daganatsejtjeibol sejtkultúrát állítanak elo, az in vitro növo sejteket genetikailag módosítják citokineket kódoló génekkel, majd besugarazzák a további sejtosztódás leállítása céljából és e sejtekkel szubkután vakcinálják a beteget. A vakcináció hatására aktiválódik az immunrendszer, amely elpusztíthatja mind a mutét után visszamaradt daganatsejteket, mind a metasztázisokat. A citokinek közül az IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GM-CSF, LIF, LT és a TNF-a terápiás hatását elemeztük. A kemoterápiás kezelés eredményességét gyakran csökkenti a daganatsejtek citosztatikumok iránti rezisztenciája. A génterápia gyógyszerérzékenyíto génekkel ígéretes új módszert kínál a rezisztencia legyozésére és a nem kívánt mellékhatások csökkentésére. Az eljárás során a tumorsejtekbe olyan enzimeket kódoló géneket juttatnak be, amelyek elosegítik egyes citosztatikumok, vagy antivirális szerek átalakulását. Ezt követoen a megfelelo 1
gyógyszerekkel végzett kezelés a daganatsejtek szelektív pusztulásához vezet. Vizsgálataink során az uracil-foszforibozil-transzferáz és a timidin-kináz enzimeket kódoló géneket alkalmaztuk. Az elobbi az 5-fluorouracil, az utóbbi pedig a ganciklovir metabolizmusában vesz részt. A daganatok kezelésekor célszeru az új génterápiás eljárásokat a régi, már bevált módszerekkel, így pl. lokális besugárzással kombinálni. A besugárzás hatására megkisebbedett tumor ellen az immunrendszer nagyobb hatásfokkal tudja felvenni a küzdelmet, másrészt a besugázástól nekrotizált tumorsejtekbol nagy mennyiségben szabadulnak fel immunogén molekulák, melyek fokozzák az immunrendszer aktivációját. A gyógyszer-érzékenyíto génterápiánál alkalmazott 5-fluorouracil pedig sugárérzékenyíto hatással is rendelkezik. Kísérleteink során mindkét génterápiás eljárást lokális besugárzással kombináltuk. II. Célkituzések I. Kezelés citokineket termelo daganatsejt vakcinákkal 1. Elsoként vizsgálni kívántuk, hogy adenovírus vektorokkal megfelelo hatékonyságú génbevitel érheto-e el, valamint a vírus/sejt arány változtatása hogyan befolyásolja a citokin koncentrációt. 2. Következo célkituzésünk a különbözo citokineket (IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GM-CSF, LIF, LT, TNF-a) termelo vakcinák, illetve kombinációjuk (IL-4+GMCSF) daganatellenes hatásának tanulmányozása volt kísérletes egér agytumoroknál. 3. Elemezni kívántuk a citokinek immunrendszert aktiváló hatásának mechanizmusát is, ugyanis az irodalomban nem egységesek az adatok a CD4+ és CD8+ sejtek szerepével kapcsolatban a citokinek által indukált 2
daganatellenes válaszreakcióban. 4. Végül kísérleteinket a hagyományos kezelési módszerek közé tartozó lokális sugárterápiával is kombináltuk. II. Kezelés gyógyszer-érzékenyíto génterápiával 1. Eloször in vitro körülmények közt kívántuk tanulmányozni a két rendszerbol (timidin-kináz/ganciklovir és az uracil-foszforibozil-transzferáz/5- fluorouracil) álló génterápia hatását. Ezt a kombinációt eddig még nem alkalmazták. 2. Következokben kísérleteinket egér tumor modellen folytattuk. Szintén két rendszerbol álló kombinált génterápiát alkalmaztunk. Ennek során vizsgáltuk az ún. bystander hatást, ami azt jelenti, hogy a génterápia során nem szükséges minden daganatsejtnek hordoznia a gyógyszer-érzékenyíto géneket, az ezeket nem tartalmazó tumorsejtek is elpusztulhatnak a toxikus metabolitok diffúziója következtében. 3. Következo célunk a lokális sugárterápiával történo kombináció tanulmányozása volt. 4. Végül elemezni kívántuk két különbözo génterápiás rendszer: a citokineket termelo daganatsejt vakcinák és a gyógyszer-érzékenyíto génterápia kombinációjának hatását. III. Módszerek 1. Citokineket termelo daganatsejt vakcináció: 1. Adenovírusokkal történo vírus fertozésés hatékonyságának ellenorzése ß-galaktozidáz enzimet kódoló adenovírus vektort jutattunk glioma 261 3
(Gl261) egér agytumor sejtekbe különbözo vírus/sejt arányban, majd megmértük a lacz+ sejtek arányát. 2. Agytumoros egerek kezelése citokineket termelo daganatsejt vakcinákkal Az agydaganatok létrehozása során C57Bl egerekre 1-2x10 4 Gl261 sejtet oltottunk a fissura petrosquamosa -n keresztül a jobb agyféltekébe. A vakcinációt 3 nappal a tumorok transzplantációja után végeztük. A citokin termelo vakcinák eloállításához sejtkultúrában növo Gl261 sejteket fertoztünk különbözo vírus/sejt arányban citokineket (IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, GM- CSF, LIF, LT, TNF-a) kódoló adenovírus vektorral. A citokinek szintjét ELISA kit segítségével határoztuk meg a sejtkultúra felülúszójából 48 órával a fertozést követoen, a sejteket pedig 20 Gy 60 Co-? besugárzással kezeltük a további sejtosztódás leállítása céljából. A sejtek begyujtését követoen az agydaganatos állatokat szubkután vakcináltuk (10 6 sejt/állat). 3. Agytumoros egerek kezelése citokineket termelo daganatsejt vakcinákkal és lokális besugárzással A vakcinációt lokális sugárterápiával is kombináltuk. Az állatok 6 Gy lokális feji röntgen besugárzásban részesültek. A besugárzás 3 nappal a tumor oltás után történt, egy órával a vakcináció elott. 4. Immunrendszeri aktiváció mechanizmusának vizsgálata A citotoxikus T-limfociták aktivitásának vizsgálához egészséges egereket vakcináltunk besugarazott Gl261 sejtekkel, vagy IL-4-et, ill. GM-CSF-et termelo Gl261 sejtekkel. Az állatok lépébol izolált limfocitákat 51 Cr-al jelölt Gl261 sejtekkel kevertük különbözo effektor és célsejt arányban. A limfocita aktivitást a sejtkultúra felülúszójából mért radioaktivitás alapján határoztuk 4
meg. A CD4+ és CD8+ limfociták jelenlétének kimutatására agydaganatos egereket vakcináltunk IL-2-t, IL-4-t, IL-12-t és GM-CSF-et termelo Gl261 sejtekkel. Tíz nap múlva az elölt állatok agyát eltávolítottuk, és a tumorokból immunhisztokémiai reakció történt poliklonális CD4+ és CD8+ ellenes antitestek segítségével. Tanulmányoztuk a CD4+ és CD8+ sejtek depléciójának hatását is. Az állatokat anti-cd4+ és/vagy anti-cd8+ ellenanyagokkal kezeltük, majd agydaganatokat hoztunk létre és az egereket a tumor indukció után 3 nap múlva GM-CSF-et termelo Gl261 sejtekkel vakcináltuk. 2. Gyógyszer-érzékenyíto génterápia 1. In vitro 5-fluorouracil, ganciklovir kezelés és besugárzás hatása gyógyszerérzékenyíto géneket tartalmazó Gl261 sejtekre In vitro növo Gl261 sejteket fertoztünk az uracil-foszforibozil-transzferáz és a timidin-kináz enzimeket kódoló géneket tartalmazó Adex-CAUPTK vírussal. Öt napon keresztül 5-fluorouracillal (5-FU) és/vagy ganciklovirral kezeltük a sejteket különbözo (0,001-10 µm) koncentrációkban. A gyógyszer-érzékenyíto génterápia és az ionizáló sugárzás kombinációjának vizsgálatára a sejtek egy része 2 Gy 60 Co-? besugárzásban is részesült. A fertozés után 5 nappal meghatároztuk a túlélo sejtek arányát. 2. Gyógyszer-érzékenyíto géneket tartalmazó agy-, ill. szubkután daganatok kezelése 5-fluorouracillal és/vagy ganciklovirral 57Bl/6 egerekre szubkután, ill. agytumorokat transzplantáltunk vad típusú Gl261 sejtek, vagy Adex-CAUPTK-val fertozött Gl261 sejtek oltásával. Az ezt követo 3. naptól kezdve az állatokat 10 napig 5-FU (10 mg/kg) és ganciklovir 5
(5 mg/kg) intraperitoneális injekcióival kezeltük. A gyógyszer-érzékenyíto génterápiánál észlelheto bystander hatás vizsgálatára az agydaganatokat Adex-CAUPTK-val fertozött, ill. nem fertozött Gl261 sejtek különbözo arányú keverékével hoztuk létre. 3. Gyógyszer-érzékenyíto géneket tartalmazó agy-, ill. szubkután daganatok kezelése 5-fluorouracillal, ganciklovirral, valamint lokális besugárzással A lokális tumor irradiáció során az anesztetizált állatok feje 4 Gy-el lett besugarazva. A besugárzás 3 nappal a daganat transzplantációja után, 1 órával az elso 5-FU/ganciklovir kezelés elott történt. 4. Gyógyszer-érzékenyíto géneket tartalmazó agytumorok kezelése 5- fluorouracil és ganciklovir kezelés, valamint citokin termelo daganatsejt vakcináció kombinálásával Három nappal a gyógyszer-érzékenyíto géneket tartalmazó daganatsejtek oltása után GM-CSF-et termelo tumorsejtekkel vakcináltuk az állatokat és 5- FU-al, ganciklovirral kezeltük az elozokben leírtak alapján. 5. Daganatok utólagos kezelése gyógyszer-érzékenyíto génterápiával és besugárzással Szubkután tumorokat hoztunk létre érzékenyíto géneket nem tartalmazó Gl261 sejtek (5x10 5 sejt/állat) jobb hátsó végtagba történo oltásával. Az ezt követo 3. naptól az egereket 5-FU-al és ganciklovirral, lokális besugárzással (2 Gy), valamint Adex-CAUPTK (10 9 partikulum/állat) közvetlen tumorba oltásával kezeltük. 6
6. Statisztikai analízis Az eredmények kiértékelését számítógépes program (BMDP4F Statistical Software, Inc., Los Angeles, CA, USA) segítségével Mantel-Cox, illetve Mann- Whitney analízissel végeztük. A P<0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. IV. Eredmények I. Terápia citokineket termelo daganatsejt vakcinákkal 1. Adenovírus vektorokkal nagy hatékonyságú génbevitel érheto el. Tíz vírus/sejt aránynál a sejtek 50-70%-a megfertozodött, 100 vírus/sejt értéknél pedig valamennyi sejtben kimutatható volt a vírus. Szintén kedvezo tulajdonsága az adenovírus vektoroknak, hogy magas vírus/sejt aránynál egy sejtbe egyszerre több vírus is bejuthat. 2. A citokin szint lineárisan változott a vírus/sejt arány növelésével a vizsgált tartományban. Ebbol következoen adenovírus vektorok használatával könnyen változtatható a genetikailag módosított daganatsejtek által termelt citokinek koncentrációja. 3. A terápiás hatás szorosan összefügött a citokinek fajtájával. A vizsgált citokinek közül csak az IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF voltak képesek növelni a túlélési idoket, illetve meggyógyítani az állatokat (20-40%-os túlélés). 4. A túlélést döntoen befolyásolta a citokin koncentráció is. Az optimálistól 7
eltéro szint esetében lényegesen kisebb terápiás hatást észleltünk. Az optimális koncentráció citokinenként különbözo volt. 5. Nem sikerült igazolni a kombinált, egyidejuleg több citokinnel történo vakcináció fokozott hatását, GM-CSF és IL-4 együttes alkalmazásakor hasonló eredményt észleltünk, mint a GM-CSF monoterápiánál. Nem zárható azonban ki, hogy amennyiben a citokin koncentráció a szuboptimális tartományba esik, kedvezo hatása lehet a kettos citokin szekréciónak. 6. Az immunrendszer citokinek által kiváltott akivációjában fontos szerepe van a CD4+ limfocitáknak, GM-CSF-nél lényegesek a CD8+ sejtek is. IL-4-nél és GM-CSF-nél kimutattuk a citotoxikus T-limfociták aktivációját is. 7. Kísérletes agytumoroknál a citokineket termelo autológ daganatsejtekkel végzett vakcináció rendkívül hatékonyan kombinálható lokális besugárzással. A citokin termelo vakcinák az agytumoros egerek mintegy 20-40%-át gyógyították meg. A lokális besugárzás önmagában csak mérsékelten nyújtotta meg az élettartamot. A két módszer kombinációja viszont 80-100%-ra növelte a túlélést. II. Terápia gyógyszerérzékenyíto génekkel 1. Vizsgálatainkkal sikerült igazolni a két rendszerbol álló gyógyszerérzékenyíto génterápia fokozott tumorellenes hatását: In vitro körülmények közt lényegesen nagyobb citotoxicitás jelentkezett a mindkét gyógyszerrel (5-FU+ganciklovir) történo kezelés hatására, mint monoterápiánál. 8
2. Hasonlóan, az in vivo kísérleteknél a kombinált 5-FU, ganciklovir kezelés sokkal nagyobb mértékben növelte az agydaganatos állatok túlélését (60-80%), mint az 5-FU (10-20%), vagy a ganciklovir (40-50%) önmagában. 3. A két rendszerbol álló gyógyszer-érzékenyíto génterápiánál nagymértéku bystander hatás jelentkezett: Az agytumoros állatok 30-40%-a akkor is meggyógyult, ha a tumorsejteknek csak 10%-a tartalmazott érzékenyíto géneket. 4. A gyógyszer-érzékenyíto génterápia és a GM-CSF-et termelo tumorsejt vakcina kombinációjakor nem észleltünk fokozott daganatellenes hatást. Ebben esetlegesen szerepet játszhat az 5-FU immunszuppresszív hatása, mely gátolhatta az immunrendszer aktivációját. 5. A gyógyszer-érzékenyíto génterápia különösen hatékonyan muködött lokális besugárzással kombinálva. In vitro körülmények közt az érzékenyíto géneket tartalmazó tumorsejtek 5-FU és ganciklovir kezelése besugárzással kombinálva 3 nagyságrenddel fokozta a citotoxicitást. Az agydaganatos egereknél a kombinált kezelés szintén nagy mértékben növelte a túlélést, ebben az esetben valamennyi állat meggyógyult. 6. A besugárzással történo kombináció képes fokozni a bystander hatást is. Az agytumoros állatok túlélése akkor is megnott a kombinált kezelés hatására (40-50%), ha a daganatok csak 10%-a tartalmazott érzékenyíto géneket. 9
V. Eredmények gyakorlati vonatkozása Mivel számos malignus daganat prognózisa a hagyományos kezelés ellenére rendkívül rossz, nagy jelentosége van új terápiás eljárások kidolgozásának. Munkánk során két génterápiás módszer hatékonyságát tanulmányoztuk in vitro körülménynek közt és egér modellen. Az állatkísérletekbol nyert adatok és következtetések nélkülözhetetlenek a génterápia humán alkalmazása elott. A citokin termelo vakcinák esetében lényeges eredmény, hogy a szekretált citokin szint döntoen befolyásolta a vakcinák tumorellenes hatását. Ez magyarázhatja egyúttal az eddigi klinikai kipróbálások mérsékelt eredményeit. Ebbol következoen a jövoben zajló klinikai kipróbálásoknál célszeru lenne a figyelmet az optimális citokin koncentrációra irányítani. Lehetséges, hogy a szintet a betegek egyedi szükségletei szerint kell majd beállítani. A gyógyszerérzékenyíto génterápiánál kimutattuk, hogy két különbözo rendszer kombinációja lényegesen nagyobb daganatellenes hatással rendelkezik, mint a monoterápia, amit szintén lényeges szem elott tartani a daganatos betegek kezelésekor. Legfontosabb eredményünk pedig, hogy mindkét génterápiás eljárás kombinálása lokális sugárterápiával nagy mértékben fokozza a génterápia hatékonyságát. Kutatásainkat összegezve a génterápiás módszerek, kombinálva a hagyományos kezelésekkel, új utat nyithatnak a malignus daganatok kezelésében. 10
V. Az értekezésben feldolgozott saját közlemények jegyzéke 1. Désaknai Sz, Lumniczky K, Hidvégi EJ, Hamada H, Sáfrány G. Brain tumor treatment with IL-2 and IL-12 producing autologous cancer cell vaccines. Adv Exp Med Biol 2001; 495: 369-372 2. Désaknai Sz, Lumniczky K, Esik O, Hamada H, Safrany G. Local tumour irradiation enhances the anti-tumour effect of a double.suicide gene therapy system in a murine glioma model. J Gene Med 2003; (megjelenés alatt) 3. Lumniczky K, Désaknai Sz, Mangel L, Szende B, Hamada H, Hidvégi EJ,a Sáfrány G. Local tumor irradiation augments the anti-tumor effect of cytokine producing autologous cancer cell vaccines in a murine glioma model. Cancer Gene Ther 2002; 9: 44-52. 11