Molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a biológiai környezeti kármentesítésben Dr. Kovács Tamás, Kovács Árpád László Kármentesítés Aktuális Kérdései 2013 Budapest, 2013.03.21-22
Bioremediáció során felmerülő kérdések 1. 2. Jelen vannak- e az ado; szennyezőanyag degradációjáért felelős természetes vagy inokulált mikroorganizmusok, ha igen, akkor megközelítőleg milyen arányban? Szükség van- e mikroorganizmusok inokulálására és/vagy tápanyag- utánpótlásra? 3. Milyen mértékben toxikus az ado; szennyezőanyag a mikroflórára? Olyan irányban folyik- e a 4. kármentesítési folyamat, mint amilyenben szükséges?
A molekuláris biológia definíciója A molekuláris biológia az élőlényekben található makromolekulákat és makromolekuláris mechanizmusokat tanulmányozza. (Stanford Encyclopedia of Philosophy, 2009). Nem technika, hanem inkább megközelítés (Astbury, Nature, 1961).
MFC Diagn Galváncella működési elve e - Zn Proton szelek^v membrán Cu ZnSO 4 Anód cella + CuSO 4 Katód cella
MFC Diagn MFC működési elve e- metabolizmus Grafit Proton szelek^v membrán Grafit + Anód cella Katód cella : mediátor
MFC Diagn Az áramerősség μa- es (általában 1-4 μa) tartományban mérhető. 0,004 0,003 0,0035 0,0025 0,003 0,0025 0,002 0,002 0,0015 0,0015 0,001 0,001 0,0005 0 Acinetobacter baumannii 1 162 323 484 645 806 967 1128 1289 1450 1611 1772 1933 2094 2255 2416 2577 2738 2899 3060 3221 3382 3543 3704 3865 4026 4187 0,0005 0 1 154 Escherichia 307 460 613 766 919 1072 1225 1378 1531 1684 1837 1990 2143 2296 2449 2602 2755 2908 coli 3061 3214 3367 3520 3673 3826 3979 4132 0,004 0,003 0,0035 0,0025 0,003 0,0025 0,002 0,002 0,0015 0,0015 0,001 0,001 0,0005 0,0005 0 1 229 457 685 913 1141 1369 1597 1825 2053 2281 2509 2737 2965 3193 3421 3649 3877 4105 4333 4561 4789 5017 5245 5473 5701 5929 Salmonella Typhimurium 0 1 164 327 490 653 816 979 1142 1305 1468 1631 1794 1957 2120 2283 2446 2609 2772 2935 3098 3261 3424 3587 3750 3913 4076 4239 Streptococcus pneumoniae
MFC Diagn 0,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 Nem toxikus E. coli gyep 0,001 0,0005 0 1 206 411 616 821 1026 1231 1436 1641 1846 2051 2256 2461 2666 2871 3076 3281 3486 3691 3896 4101 4306 4511 4716 4921 5126 5331 5536 5741 5946 6151 6356 0,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 Enyhén toxikus 0,001 0,0005 0 1 212 423 634 845 1056 1267 1478 1689 1900 2111 2322 2533 2744 2955 3166 3377 3588 3799 4010 4221 4432 4643 4854 5065 5276 5487 0,004 0,0035 0,003 0,0025 0,002 0,0015 0,001 Toxikus 0,0005 0 2 óra 6 óra 1 219 437 655 873 1091 1309 1527 1745 1963 2181 2399 2617 2835 3053 3271 3489 3707 3925 4143 4361 4579 4797 5015 5233 5451 5669 24 óra
Gyakorlati alkalmazás A műszaki beavatkozási terv készítésénél megvizsgálhatjuk, hogy az ado; szennyezés toxikus- e a mikroflórára, azaz van- e esélye annak, hogy a bioremediáció sikerre vezet.
Metagenom-szekvenálás Célja: egy ado; (környezeg) mintában meghatározni a mikroflóra összetételét Többféle megközelítés (shotgun, rrns) lehetséges Leggyakrabban a 16S rrns- t kódoló gén szekvenciája alapján történik
PCR reakció Primertervezés: nagyon lényeges, csak validált primert használjunk (Primerek: rövid DNS szakaszok, melyek komplementerek a felszaporítandó DNS valamely szakaszával. A primerpár 2 tagja közé eső szakaszt amplifikáljuka PCR során). Az általunk alkalmazo; validált primerpárokat egy bioinformagkusok és matemagkusok által fejleszte; célszoiverrel tervezzük, melyet egy együ;működés keretében használunk.
PCR elve Ábra forrása: Hajósné Dr. Novák Márta: Genegkai variabilitás a növénynemesítésben
PCR reakció Primertervezés: nagyon lényeges, csak validált primert használjunk (Primerek: rövid DNS szakaszok, melyek komplementerek a felszaporítandó DNS valamely szakaszával. A primerpár 2 tagja közé eső szakaszt amplifikáljuka PCR során). Az általunk alkalmazo; validált primerpárokat egy bioinformagkusok és matemagkusok által fejleszte; célszoiverrel tervezzük, melyet egy együ;működés keretében használunk.
Primertervező szoftver
DNS szekvenálás Leolvassuk az amplifikált DNS bázissorrendjét Lényeges: a read- hossz. Read: az ado; szekvenálási technológia által megszakítás nélkül leolvaso;, egymást követő nukleogdok száma. Példa: következő dia
DNS szekvenálás: read-hossz Megint elmúlt 2 év és Szövetségünk ismét megrendezi hagyományos konferenciáját KÁRMENTESÍTÉS témakörben. 104 karakter 25 karakterenként olvasva: Megint elmúlt 2 év és Szö megrendezi hagyományos ko Szövetségünk ismét megren és így tovább 104 vagy több karakterenként olvasva: Megint elmúlt 2 év és Szövetségünk ismét megrendezi hagyományos konferenciáját KÁRMENTESÍTÉS témakörben.
DNS szekvenálás: read-hossz Rövid read Hosszú read
DNS szekvenálás: read-hossz Rövid read- nél illeszteni kell, ekkor fennáll a tévedés lehetősége: nagyon hasonló szekvenciájú DNS molekulák keverékének szekvenálása történik. Hosszú readnél fizikailag kapcsolva van a variábilis régió egésze. Rövid readnél törzs vagy osztály szintű, hosszú readnél genus, de akár faj szintű azonosítás is lehetséges.
DNS szekvenálás: read-hossz Leghosszabb readdel a Roche 454 technológia rendelkezik. Bioinformatikai kiértékelés Nagyon lényeges pont, egymástól nagyban eltérő eredményeket kaphatunk.
Bioinformatikai kiértékelés Automata, nyilvános szerverek. Leggyakrabban használt: MG- Rast
Bioinformatikai kiértékelés Együ;működő partnereinkkel történt bioinformagkai kiértékelés során a Bacillus anthracis jelenlétét kizárha;uk a mintából. Eredmény A minta mikroflóra- összetétele faj vagy genus szinten, %- os összetételben
Gyakorlati alkalmazás Meghatározhatjuk az ado; területen a mikroflóra összetételét, ezáltal dönthetünk arról, hogy szükség van- e külső inokulum injektálására, vagy a lebontáshoz szükséges baktériumok a területen rendelkezésre állnak.
qpcr Megválaszolandó kérdés: egy ado; baktériumfaj jelen van- e a mintában, ha igen, milyen mennyiségben. A módszer előnye: gyors, nyomnyi mennyiségű baktérium kimutatására is alkalmas. Hátránya: sok esetben nehéz a PCR gátló anyagoktól megszabadulni, validálni kell.
PCR elve Ábra forrása: Hajósné Dr. Novák Márta: Genegkai variabilitás a növénynemesítésben
qpcr elve
CP 45 40 35 30 25 20 15 10 5 qpcr - kalibráció y = -1.833ln(x) + 52.936 R² = 0.98891 0 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 1.00E+09 1.00E+10 Titer (PFU/ml)
qpcr CP értékek
qpcr melting curve analízis
Baktériumfajok meghatározása P. Feladat: Talajvíz mintákból kelle; kimutatnunk Paenobacillus macerans és Achromobacter denitrificans jelenlétét. A megrendelő nem igényelte az aktuális sejtszám meghatározását, hanem az egyes mintákban lévő baktériumok rela^v aránya elegendő v o l t számára. macerans A. denitri- ficans Vizsgált minták száma 34 32 Pozi^v minták száma 18 29 Rela^v érték 1-445,7 3,2-724,1 Rela^v érték: a detektálási minimumot 1- nek véve, az ehhez viszonyíto; sejtszám- érték. A módszer rela^v géngyakoriság meghatározására is alkalmas!
Gyakorlati alkalmazás A qpcr- el a kármentesítés során nyomonkövethetjük, hogy az ado; szennyezőanyag bontásához szükséges baktériumok vagy enzimek génjei jelen vannak- e, ha igen, akkor milyen mennyiségben.
ÖSSZEFOGLALÁS Az ismertete; módszerek alkalmazásával a kármentesítés folyamata nyito;á, átláthatóvá válik, a szükséges beavatkozásokat időben meg tudjuk tenni. A kármentesítés időtartama jól tervezhetővé válik. Ezzel segítjük a kármentesítés kivitelezőjének és műszaki ellenőrének munkáját.
Kérdések? További információk? biotechnologia.enviroinvest.hu kovacst@enviroinvest.hu Enviroinvest Zrt 7632 Pécs, Kertváros u. 2.
KÖSZÖNJÜK A FIGYELMET!