2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-1 2.6.7. MIKOPLAZMÁK 01/2008:20607 javított 6.1 Ahol a mikoplazmák vizsgálatát törzs-sejtbank, szaporító sejtbank, vírus oltócsíratétel vagy kontrollsejtek vizsgálatára írják elő, a tenyésztéses módszert és az indikátorsejt-tenyésztéses módszert egyaránt használhatjuk. Amennyiben a mikoplazmák vizsgálatát vírus aratásra, letöltés előtti késztermék vakcinára vagy kész gyártási tételre írják elő, a tenyésztéses módszert alkalmazzuk. Az indikátorsejt-tenyésztéses módszert, ha szükséges, táptalajok kiválasztásához is alkalmazhatjuk. Az egyik vagy mindkét módszer alternatívájaként megfelelő validációt követően nukleinsav-amplifikációs módszert (NAT) is alkalmazhatunk. TENYÉSZTÉSES MÓDSZER A TÁPTALAJ KIVÁLASZTÁSA A vizsgálat során elegendő számú szilárd és folyékony táptalajt használunk annak érdekében, hogy a vizsgálandó termékben esetleg jelenlevő kisszámú mikoplazma növekedését biztosítsuk a választott inkubációs körülmények között. A folyékony táptalajoknak fenolvöröst kell tartalmazniuk. A választott táptalajoknak legalább az alábbiakban felsorolt mikroorganizmusokat illetően megfelelő mértékű mikroorganizmusnövekedést elősegítő képességgel kell rendelkezniük. Az alábbiakban felsorolt mikroorganizmusokra vonatkozó mikroorganizmusnövekedést elősegítő képességet a táptalaj minden új gyártási tételére külön igazolni kell. Amikor a terméket mikoplazmákra vizsgáljuk, a következő fajok közül legalább egyet pozitív kontrollként be kell vonni a vizsgálatba: Acholeplasma laidlawii (ember- és állatgyógyászati felhasználásra szánt vakcinák esetén, ha az előállítás folyamán antibiotikumot használtak); Mycoplasma gallisepticum (ha az előállítás folyamán madár eredetű anyagot használtak, vagy ha a vakcinát szárnyasok oltására szánják); Mycoplasma hyorhinis (nem-avian állatgyógyászati felhasználásra szánt vakcinák esetén); Mycoplasma orale (ember- és állatgyógyászati felhasználásra szánt vakcinák esetén); Mycoplasma pneumoniae vagy más megfelelő D-glükóz fermentáló faj, pl. Mycoplasma fermentans (embergyógyászati felhasználásra szánt vakcinák esetén);
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-2 Mycoplasma synoviae (ha az előállítás folyamán madár eredetű anyagot használtak, vagy ha a vakcinát szárnyasok oltására szánják). A vizsgálati törzseket természetes környezetből izolálják és korlátozott számú, legfeljebb tizenötszöri átoltás után fagyasztva vagy fagyasztva szárítva tárolják. Klónozás után a törzseket pl. az alábbiakban felsorolt típusok tenyészeteivel történő összehasonlítás útján azonosítani kell: A. laidlawi NCTC 10116 CIP 75.27 ATCC 23206 M. gallisepticum NCTC 10115 CIP 104967 ATCC 19610 M. fermentans NCTC 10117 CIP 105680 ATCC 19989 M. hyorhinis NCTC 10130 CIP 104968 ATCC 17981 M. orale NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714 M. pneumoniae NCTC 10119 CIP 103766 ATCC 15531 M. synoviae NCTC 10124 CIP 104970 ATCC 25204 A BRP Acholeplasma laidlawii, BRP Mycoplasma fermentans, BRP Mycoplasma hyorhinis, BRP Mycoplasma orale és BRP Mycoplasma synoviae megfelelőek alacsony passzázsszámú referenciatörzsekként történő alkalmazásra. AZ INKUBÁLÁS KÖRÜLMÉNYEI A folyékony táptalajokat szorosan lezárt tartályokban 35 38 C hőmérsékleten inkubáljuk. A szilárd táptalajokat mikroaerofil körülmények (5-10% széndioxidot tartalmazó nitrogén és megfelelő, az agarfelület kiszáradását megakadályozó nedvességtartalom) között 35 38 C hőmérsékleten inkubáljuk. MIKROORGANIZMUSOK NÖVEKEDÉSÉT ELŐSEGÍTŐ KÉPESSÉG A mikroorganizmusok növekedését elősegítő képesség vizsgálatát a táptalaj minden új gyártási tételével el kell végezni. A választott táptalajokat beoltjuk a megfelelő teszt-mikroorganizmusokkal; egy 60 mm átmérőjű, 9 ml szilárd táptalajt tartalmazó lemez, illetve egy megfelelő folyékony táptalajt tartalmazó 100 ml-es tartály beoltásához legfeljebb 100 CFU-t (telepképző egységet) használunk. Mindegyik mikroorganizmusfajhoz külön lemezt, illetve tartályt alkalmazunk. A táptalajokat inkubáljuk és megadott időközönként átoltást végzünk 0,2 ml folyékony táptalajjal szilárd táptalajra (lásd alább, A vizsgálandó termék vizsgálata mikoplazmákra című részt). A szilárd táptalaj megfelel a vizsgálat követelményének, ha minden teszt-mikroorganizmus teljesen megfelelő növekedést mutat (a kapott növekedés az inokulumra számított értéktől nem különbözik ötszörösnél nagyobb mértékben). A folyékony táptalaj megfelel a vizsgálat követelményének, ha a folyékony táptalajból átoltott agar-lemezeken minden egyes mikroorganizmus legalább egy átoltása szaporodást eredményez. GÁTLÓ HATÁSÚ ANYAGOK
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-3 A gátló hatású anyagokra való vizsgálatot egy adott termék esetében egyszer végezzük el. Amennyiben a gyártási eljárásban olyan változás következik be, amely befolyásolhatja a mikoplazmák kimutatását, a vizsgálatot meg kell ismételni. Gátló hatású anyagok távollétének bizonyítása céljából elvégezzük a szaporodást elősegítő képesség vizsgálatát a termék jelenlétében és távollétében is. Ha egy teszt-mikroorganizmus szaporodása a vizsgálandó termék távollétében több, mint egy átoltással előbb jelenik meg, mint a termék jelenlétében, vagy ha a vizsgálandó termékkel közvetlenül beoltott lemezeken a megjelenő mikroorganizmus-telepek száma kevesebb, mint ötödrésze a be nem oltott lemezeken megjelenőknek, akkor gátló hatású anyagok vannak jelen. Ezeket semlegesíteni kell vagy egyéb módszerrel pl. gátló hatású anyagot nem tartalmazó anyagba történő átoltással vagy a vizsgálatot megelőzően a táptalaj nagyobb térfogatra hígításával kell kiküszöbölni. Ha higítást alkalmazunk, nagyobb táptalaj-térfogatokat használhatunk, vagy az inokulumot több 100 ml-es lombikba oszthatjuk szét. A semlegesítés vagy az egyéb alkalmazott eljárás hatékonyságát úgy ellenőrizzük, hogy az eljárást követően megismételjük a gátló hatású anyagokra előírt vizsgálatot. A VIZSGÁLANDÓ TERMÉK VIZSGÁLATA MIKOPLAZMÁKRA Az egyes folyékony táptalajok 100 ml-ét beoltjuk a vizsgálandó termék 10 ml-ével. Amennyiben a termék hozzáadására a ph jelentős mértékű változása figyelhető meg, az eredeti ph-t nátrium-hidroxid vagy sósav segítségével újra beállítjuk. Az egyes táptalajlemezekre 0,2-0,2 ml vizsgálandó terméket oltunk. A folyékony táptalajokat 20-21 napig inkubáljuk. A szilárd táptalajok esetén az inkubáció időtartama legalább 14 nap, kivéve a 20-21. napi átoltásnak megfelelőket, amelyeknél az inkubálási idő 7 nap. Egyidejűleg negatív kontrollként valamennyi folyékony táptalaj 100 ml-ét és az agar táptalajlemezeket is inkubáljuk be nem oltott formában. A beoltást követő 2 4. napon valamennyi folyékony táptalajból 0,2 ml inokulumot oltunk mindegyik szilárd táptalaj legalább egy-egy lemezére. Ezt a műveletet a vizsgálat 6. és 8., 13. és 15., illetve 19. és 21. napja között is elvégezzük. A folyékony táptalajokat 2 3 naponta megfigyeljük, és amennyiben színváltozást észlelünk, átoltást végzünk. Amennyiben egy folyékony táptalajon baktérium- vagy gombaszennyezés fordul elő, a vizsgálat nem értékelhető. Értékelhető a vizsgálat, ha táptalajonként és beoltási naponként legalább egy lemez leolvasható. Legalább egy teszt-mikroorganizmus legfeljebb 100 CFU mennyiségének agar táptalajra vagy folyékony táptalajba oltásával a vizsgálatba pozitív kontrollt is beiktatunk. Ahol a mikoplazma-vizsgálatot rendszeresen végzik, és ahol lehetséges, ott ajánlatos a teszt-mikroorganizmusokat szabályos rotációs rendszerben alkalmazni. A használatos teszt-mikroorganizmusokat a Táptalaj kiválasztása pont tartalmazza. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-4 Az előírt inkubációs idő elteltével minden beoltott szilárd táptalajon mikroszkóp alatt vizsgáljuk a mikoplazmatelepek megjelenését. A termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha tipikus mikoplazma telepek nem jelentek meg. Ha bármelyik szilárd táptalajon mikoplazmatelepek figyelhetők meg, a termék nem felel meg a vizsgálat követelményének. A vizsgálat érvénytelen, amennyiben egy vagy több pozitív kontroll nem eredményez mikoplazma-növekedést legalább egy átoltáslemezen. A vizsgálat akkor is érvénytelen, ha a negatív kontrollok közül egy vagy több mikoplazma-növekedést eredményez. Ha gyanús telepek figyelhetők meg, megfelelő validált módszert kell használni annak megállapítására, hogy ezek mikoplazmáktól erednek-e. A következő rész tájékoztató jellegű. A TENYÉSZTÉSES MÓDSZERHEZ AJÁNLOTT TÁPTALAJOK A következő táptalajok használata ajánlott. Más táptalaj is használható, feltéve, hogy minden egyes gyártási tétele bizonyítottan képes fenntartani a mikoplazmák szaporodását, a vizsgálandó termék jelenlétében és távollétében egyaránt. HAYFLICK TÁPTALAJOK (A MIKOPLAZMÁK ÁLTALÁNOS KIMUTATÁSÁRA AJÁNLOTT) Folyékony táptalaj Szarvasmarhaszív-bouillon (1) Lószérum (nem melegített) Élesztőkivonat (250 g/l) Fenolvörös (0,6 g/l töménységű oldat) Penicillin (20 000 NE/ml) Dezoxiribonukleinsav (2 g/l töménységű oldat) A táptalaj ph-ját 7,8-re állítjuk be. 90,0 ml 20,0 ml 10,0 ml 5,0 ml 0,25 ml 1,2 ml Szilárd táptalaj A fenti előirat szerint készítjük, azzal az eltéréssel, hogy szarvasmarhaszív bouillon helyett literenként 15 g agart tartalmazó szarvasmarhaszív bouillon-agart alkalmazunk. FREY-TÁPTALAJOK (M. SYNOVIAE KIMUTATÁSÁRA AJÁNLOTT) Folyékony táptalaj Szarvasmarhaszív-bouillon (1) Esszenciális vitaminok (2) Glükóz-monohidrát (500 g/l töménységű oldat) 90,0 ml 0,025 ml 2,0 ml
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-5 Sertésszérum (56 C-on 30 perc alatt inaktivált) 12,0 ml β-nikotinamid-adenin-dinukleotid (10 g/l töménységű oldat) 1,0 ml Cisztein-hidroklorid (10 g/l töménységű oldat) 1,0 ml Fenolvörös (0,6 g/l töménységű oldat) 5,0 ml Penicillin (20 000 NE/ml) 0,25 ml A β-nikotinamid-adenin-dinukleotid és a cisztein-hidroklorid oldatait összekeverjük és 10 perc elteltével adjuk a többi összetevőhöz. A táptalaj ph-ját 7,8-re állítjuk be. Szilárd táptalaj Szarvasmarhaszív-bouillon (1) 90,0 ml Tisztított agar (3) 1,4 g A ph-t 7,8-re beállítjuk, majd autoklávban történő sterilezést követően a következő összetevőket adjuk a keverékhez. Esszenciális vitaminok (2) 0,025 ml Glükóz-monohidrát (500 g/l töménységű oldat) 2,0 ml Sertésszérum (nem hőkezelt) 12,0 ml β-nikotinamid-adenin-dinukleotid (10 g/l töménységű oldat) 1,0 ml Cisztein-hidroklorid (10 g/l töménységű oldat) 1,0 ml Fenolvörös (0,6 g/l töménységű oldat) 5,0 ml Penicillin (20 000 NE/ml) 0,25 ml FRIIS TÁPTALAJ (NEM MADÁR EREDETŰ MIKOPLAZMÁK KIMUTATÁSÁRA AJÁNLOTT) Folyékony táptalaj Hanks-féle kiegyenlített sóoldat (módosított) (4) Desztillált víz Agyvelő-szív-főzet (5) PPLO-bouillon (6) Élesztő-kivonat (170 g/l) Bacitracin Meticillin Fenolvörös (5 g/l töménységű oldat) Lószérum Sertésszérum A táptalaj ph-ját 7,4 7,45 értékre állítjuk be. 800 ml 67 ml 135 ml 248 ml 60 ml 250 mg 250 mg 4,5 ml 165 ml 165 ml Szilárd táptalaj Hanks-féle kiegyenlített sóoldat (4) DEAE-dextrán Tisztított agar (3) 200 ml 200 mg 15,65 g
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-6 Alapos összekeverés után a keveréket autoklávban sterilezzük, majd 100 C-ra hűtjük és a fent előírt táptalaj 1740 ml-éhez elegyítjük. (1) Szarvasmarhaszív-bouillon Szarvasmarhaszív (bouillon készítéséhez) Pepton Nátrium-klorid Desztillált víz A keveréket autoklávban sterilezzük. 500 g 10 g 5 g ad 1000 ml (2) Esszenciális vitaminok Biotin Kalcium-pantotenát Kolin-klorid Folsav i-inozit Nikotinamid Piridoxál-hidroklorid Riboflavin Tiamin-hidroklorid Desztillált víz (3) Tisztított agar 100 mg 100 mg 100 mg 100 mg 200 mg 100 mg 100 mg 10 mg 100 mg ad 1000 ml Immunológiai és mikrobiológiai célra szánt, különlegesen nagy tisztaságot, átlátszóságot és erős gélképző tulajdonságot eredményező, ioncserélő eljárással előállított, nagy tisztaságú agar. Hozzávetőleges összetétele: Víz 12,2% Hamu 1,5% Savban oldhatatlan hamu 0,2% Klór 0 Foszfát (P 2 O 5 -ban kifejezve) 0,3% Összes nitrogén 0,3% Réz 8 ppm Vas 170 ppm Kalcium 0,28% Magnézium 0,32% (4) Hanks-féle kiegyenlített sóoldat (módosított) Nátrium-klorid Kálium-klorid Magnézium-szulfát-heptahidrát Magnézium-klorid-hexahidrát Kalcium-klorid, vízmentes 6,4 g 0,32 g 0,08 g 0,08 g 0,112 g
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-7 Dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát Kálium-dihidrogén-foszfát, vízmentes Desztillált víz (5) Agyvelő-szív-főzet Borjú agyvelő-főzet Szarvasmarhaszív-főzet Proteóz-pepton Glükóz-monohidrát Nátrium-klorid Dinátrium-hidrogén-foszfát, vízmentes Desztillált víz (6) PPLO-bouillon Szarvasmarhaszív-főzet Pepton Nátrium-klorid Desztillált víz 0,0596 g 0,048 g ad 800 ml 200 g 250 g 10 g 2 g 5 g 2,5 g ad 1000 ml 50 g 10 g 5 g ad 1000 ml INDIKÁTORSEJT-TENYÉSZTÉSES MÓDSZER A sejttenyészeteket egy, a DNS-hez kötődő fluoreszkáló festékkel festjük. A mikoplazmákat a sejtek felületén, erősebb mikoplazma-szennyezettség esetén a sejtek környezetében is megjelenő, jellegzetes, szemcsés vagy szálas fluoreszcencia-mintázatuk alapján mutatjuk ki. A citoplazma mitokondriumai is festődhetnek, ezek azonban határozottan megkülönböztethetők a mikoplazmáktól. Ha vírusszuszpenziók esetében az eredmények értelmezését jelentős sejtkárosító hatások befolyásolják, a vírus semlegesíthető olyan specifikus antiszérummal, amely nem gátolja a mikoplazmákat, illetve olyan sejttenyészet-szubsztrátumot is alkalmazhatunk, amelyben a vírus nem szaporodik. Annak igazolására, hogy a szérum nem rendelkezik gátló hatással, a pozitív kontroll vizsgálatokat az antiszérum jelenlétében és távollétében is elvégezzük. A SZUBSZTRÁTUM ALKALMASSÁGÁNAK IGAZOLÁSA A mikoplazmák kimutatására Vero sejteket vagy más, mikoplazmák kimutatására azonos hatékonyságú sejttenyészetet (pl. a termelő sejtvonalat) használunk. A felhasznált sejtek hatékonyságát az alább leírt eljárással vizsgáljuk. M. hyorhinis és M. orale megfelelő referencia-törzseiből legfeljebb 100 CFU-nak vagy 100 CFUanalóg egységnek megfelelő mennyiségű mikroorganizmust oltunk be. A következő törzsek alkalmasnak bizonyultak: M. hyorhinis ATCC 29052 M. orale NCTC 10112 CIP 104969 ATCC 23714
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-8 A sejtek abban az esetben alkalmasak, ha mindkét referenciatörzs kimutatható. Az indikátorsejteket a vizsgálatot megelőzően, antibiotikumok alkalmazása nélkül át kell oltani. VIZSGÁLATI MÓDSZER 1. Megfelelő sűrűségű (pl. milliliterenként 2 10 4 2 10 5 sejt, négyzetcentiméterenként 4 10 3 2,5 10 4 sejt) indikátor sejttenyészetet készítünk, amely három nap szaporodás után a sejtek összefolyását eredményezi. A vizsgálandó termék 1 ml-ét a sejttenyészetet tartalmazó edénybe oltjuk és 35-38 C-on inkubáljuk. 2. Legalább 3 napos inkubálást követően, amikor a sejtek összefolyása megtörtént, megfelelő tartályokba helyezett fedőlemezekre vagy más alkalmas felületre (pl. üreges lemezre)átoltást végzünk. A sejtekből kis sűrűségű tenyészetet készítünk úgy, hogy 3-5 nap inkubálás után 50%-os összefolyást érjünk el. A teljes mértékű összefolyást kerülni kell, mert rontja a mikoplazmák láthatóságát a festést követően. 3. Eltávolítjuk a táptalajt, és az egysejtrétegű indikátorsejt tenyészetet R nátriumklorid tartalmú foszfát tompítóoldattal (ph 7,4) mossuk, majd alkalmas fixálóoldatot adunk hozzá. (Ha R biszbenzimidet használunk festésre, fixáló oldatként 1 térfogatrész R tömény ecetsav és 3 térfogatrész R metanol elegye megfelel). 4. A fixálóoldatot eltávolítjuk, és a sejteket steril R vízzel mossuk. A lemezeket amennyiben a festés több, mint 1 óra elteltével történik teljesen meg kell szárítani. (A szárítást követően festett lemezekre különös figyelmet kell fordítani az esetlegesen keletkező melléktermékek miatt.) 5. A lemezeket alkalmas DNS-festék hozzáadását követően megfelelő ideig állni hagyjuk. (R biszbenzimid oldat alkalmazása esetén 10 perc megfelelő). 6. A festéket eltávolítjuk és a sejtréteget R vízzel mossuk. 7. Adott esetben a fedőlemezekre pl. R glicerin és R foszfát-citrát tompítóoldat (ph 5,5) 1:1 arányú elegyéből egy-egy cseppet visszük. Legalább 400-szoros nagyítás mellett fluoreszcenciás kiértékelést végzünk. (Biszbenzimid festék alkalmazásakor 330/380 nm gerjesztő fényszűrő és LP 440 nm záró fényszűrő megfelelő.) 8. A vizsgált tenyészetek sejtmagon kívüli fluoreszcenciájának mikroszkópos képét összehasonlítjuk a negatív és a pozitív kontrollokéival. A mikoplazmák pontok vagy szálak formájában jelennek meg az indikátorsejtek citoplazmájában és esetenként a sejtek közötti térben is. A validálás során készült előírás alapján több mikroszkópos teret vizsgálunk. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-9 A vizsgált termék megfelel a vizsgálat követelményének, ha mikoplazmákra jellemző fluoreszcencia nem jelenik meg. Amennyiben a pozitív kontrollokban nem látható a mikoplazmákra jellemző fluoreszcencia, a vizsgálat nem értékelhető. Nem értékelhető a vizsgálat továbbá akkor sem, ha a negatív kontrollban megjelenik a mikoplazmákra jellemző fluoreszcencia. NUKLEINSAV-AMPLIFIKÁCIÓS MÓDSZEREK (NAT) A NAT technika (2.6.21), melynek alkalmazása során a mintából kivont nukleinsavakat specifikus primerek segítségével amplifikálják, s így feltárják a célnukleinsavak jelenlétét, alkalmazható mikoplazmák kimutatására. A NAT jelzi egy adott nukleinsavszekvencia jelenlétét, de nem szükségszerűen jelzi életképes mikoplazmák jelenlétét. Számos különböző módszer is ismeretes. Ez az általános fejezet nem ír elő a vizsgálathoz egy meghatározott módszert. Az alkalmazott eljárást a leírtak szerint validálni kell, figyelembe véve az e fejezet végén található útmutatókat. Amennyiben kereskedelemben kapható készletet használunk, a validálás bizonyos elemeit elvégezheti a gyártó, és információt mellékelhet a felhasználó részére; azt azonban figyelembe kell venni, hogy a primerekről teljes információ nem mindig szerezhető meg, illetve a készlet előállítása módosulhat vagy meg is szűnhet. Nukleinsav-amplifikációs módszert ott kell alkalmazni, ahol azt a cikkely előírja. A módszer megfelelő validálás után alkalmazható a tenyésztéses módszer ill. az indikátorsejt-tenyésztéses módszer helyett is. Citotoxikus anyag jelenlétében és abban az esetben, ha gyors módszerre van szükség, direkt NAT alkalmazható. Sejttenyészet dúsítást követő NAT: a vizsgálati mintát és egy megfelelő sejtszubsztrátumot (ld. az indikátorsejt-tenyésztéses módszer alfejezetben) alkalmas időtartamig együtt tenyésztünk; a sejtekből és a felülúszóból ezután kivonjuk a nukleinsavakat és azokat NAT alkalmazásával kimutatjuk. VALIDÁLÁS A validálás különböző szakaszaiban, valamint a vizsgálat rutinszerű alkalmazása során kontrollkénti felhasználásra referenciastandardokra van szükség. A referenciastandardok mikoplazmák vagy nukleinsavak lehetnek. A kimutatási határ validálása céljából az alábbiakban felsorolt fajok a szennyezésként való előfordulás gyakorisága és törzsfejlődési rokonság szempontjából optimális válogatást jelentenek: A. laidlawii; M. fermentans;
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-10 M. hyorhinis (ahol sejttenyésztéses dúsítást alkalmaznak, ott egy érzékeny törzset, mint pl. az ATCC 29052 törzset kell bevonni); M. orale; M. pneumoniae vagy M. gallisepticum; M. synoviae (ahol az előállítás folyamán madár eredetű anyagot használnak, vagy a termék madár eredetű anyaggal érintkezhet); Mycoplasma arginini; Spiroplasma citri (ahol az előállítás folyamán rovar eredetű vagy növényi anyagot használnak, vagy a termék ilyen eredetű anyaggal érintkezhet). A specificitás bizonyításához megfelelő (a mikoplazmáktól eltérő) baktériumfajták használatára van szükség. Ehhez a validációhoz a mikoplazmákkal szoros törzsfejlődési rokonságban álló baktériumnemzetségek a legmegfelelőbbek; ezek közé tartoznak a Clostridium, a Lactobacillus és a Streptococcus nemzetségek. Összehasonlító tanulmányok a NAT alternatív módszerként való alkalmazására. Minden egyes vizsgált mikoplazma típusra: a tenyésztéses módszer alternatívájaként: bizonyítani kell, hogy a NAT vizsgálati rendszer alkalmas 10 CFU/ml kimutatására; az indikátorsejt-tenyésztéses módszer alternatívájaként: bizonyítani kell, hogy a NAT vizsgálati rendszer alkalmas 100 CFU/ml kimutatására; vagy egy, a fentiekkel egyenértékű, a vizsgálati minta mikoplazma-nukleinsav példányszámában kifejezett kimutatási határ elérésére (a megfelelő mikoplazmanukleinsav referenciastandardokat használva). ELLENŐRZÉSEK Belső kontrollok. Belső kontrollok a gátló hatásoktól való mentesség igazolására szükségesek. A belső kontroll tartalmazhatja a primer kötőhelyét, de más alkalmas szekvencia is használható. A belső kontrollt tanácsos a nukleinsav izolálása előtt adni a vizsgálati anyaghoz, ily módon ez a vizsgálat egészének (kivonás, fordított átírás, amplifikáció, kimutatás) kontrolljaként működik. Külső kontrollok. A pozitív külső kontroll meghatározott számú célszekvenciamásolatot vagy CFU-t tartalmaz egy vagy több, megfelelő a vizsgálati körülmények validálása során használt mikoplazma specieszből kiválasztva. A pozitív kontrollok egyikét a pozitív határértékhez közeli értékre állítjuk, ezzel bizonyítva a várt érzékenység elérését. A negatív külső kontroll nem tartalmaz célszekvenciát, sőt nem feltétlenül ugyanazt a mátrixot tartalmazza, mint a vizsgálati termék. AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-11 A használt primerek amplifikálhatnak nem mikoplazma eredetű bakteriális nukleinsavat s ez hamis pozitív eredményekhez vezet. A validáció alkalmával, szükség esetén, eljárásokat kell megállapítani a pozitív eredmények megerősítésére. A következő rész tájékoztató jellegű. MIKOPLAZMÁK KIMUTATÁSÁRA SZOLGÁLÓ NUKLEINSAV- AMPLIFIKÁCIÓS MÓDSZEREK (NAT) VALIDÁLÁSA: ÚTMUTATÓ 1. ALKALMAZÁSI TERÜLET A nukleinsav-amplifikációs módszerek (NAT) nukleinsav kimutatására szolgáló kvalitatív vagy kvantitatív vizsgálati módszerek. Egyes minták, így pl. vakcinák és sejtszubsztrátumok mikoplazmaszennyezésének kimutatására a kvalitatív vizsgálatok megfelelőek és határérték-vizsgálatoknak tekinthetők. Ez az útmutató mikoplazma-szennyezés megállapítására szolgáló kvalitatív nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárások validálásának módszereit írja le. Az útmutató alkalmazható a szennyezők ellenőrzését határérték-vizsgálatként végző valós idejű NAT esetében is. Az analitikai eljárás validálásának két legfontosabb jellemzője a specificitás és a kimutatási határ. Ezen felül értékelendő az analitikai eljárás robusztussága is. Jelen dokumentum értelmében az analitikai eljárás magában foglalja a teljes folyamatot a nukleinsav kivonásától az amplifikált termékek kimutatásáig. Amennyiben az analitikai eljárás egy részéhez vagy a teljes eljáráshoz kereskedelmi forgalomban beszerezhető készletet használunk, a készlet gyártója által már elvégzett, dokumentált validációs vizsgálatokat a felhasználónak nem kell elvégeznie. Mindazonáltal, a készlet teljesítőképességét (pl. kimutatási határ, robusztusság, más baktériumosztályok kereszt-kimutathatósága) az adott felhasználás során a felhasználónak bizonyítania kell. A NAT felhasználható: kiegészítő vizsgálati módszerként (pl. citotoxikus vírus-szuszpenziók esetén) vagy folyamat-ellenőrzési célokra; alternatív módszerként, hivatalos eljárás helyettesítésére (indikátorsejttenyésztéses módszer vagy sejttenyésztéses módszer). Jelen útmutató külön tárgyalja a két tárgykört, olyan módon, hogy előbb magának a NAT-nak a validációjához, majd a NAT és a hivatalos módszerek összehasonlító tanulmányához nyújt útmutatást. 2. ÚTMUTATÓ A MIKOPLAZMA NAT VALIDÁCIÓJÁHOZ
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-12 Három paramétert kell értékelni: a specificitást, a kimutatási határt és a robusztusságot. 2-1. Specificitás. A specificitás a célnukleinsav egyértelmű becslésének lehetősége a várhatóan jelenlévő komponensek mellett. A NAT specificitása függ a primerek megválasztásától, valamint a próbafragmens megválasztásától (a végtermék analízise esetén), és a vizsgálati körülmények szigorúságától (mind az amplifikációs, mind a kimutatási szakaszt illetően). A NAT-nak azon képessége, hogy a mikoplazmák széles palettáját ki tudja mutatni, függ a primerek, a próbafragmensek és a módszerparaméterek megválasztásától. Ezt a képességet jellemzett referenciatörzsek (pl. az EDQM [Európai Gyógyszerminőségi Igazgatóság] által rendelkezésre bocsátott referenciatörzsek) alkalmazásával kell bizonyítani. Minthogy a NAT-rendszerek általában primerkeveréket alkalmaznak, a primereknek és próbafragmenseknek adatbázisokkal történő összehasonlításon alapuló elméleti analízise nem ajánlott, mivel az eredmények értelmezése túlságosan bonyolult lehet, és lehetséges, hogy nem tükrözi a kísérleti eredményeket. Ezenfelül, annak valószínűsége miatt, hogy a primerek más baktériumfajtákat is kimutatnak, a validációs tanulmányban vizsgálni kell az esetleges keresztkimutatást. Erre a célra az olyan baktériumnemzetségek, mint pl. a mikoplazmákkal szoros törzsfejlődési rokonságban álló Gram-pozitív baktériumok a legalkalmasabbak; ezek közé tartoznak a Clostridium, a Lactobacillus és a Streptococcus nemzetségek. Mindazonáltal ez nem egy mindenre kiterjedő felsorolás, és a vizsgálandó fajok kiválasztása attól függ, hogy a NAT rendszer elméletileg (a primerek és próbafragmensek szekvenciája alapján) milyen egyéb fajok kimutatására képes. Amennyiben a módszer specificitása a validációs eredmények alapján nem kielégítő (pl. nem mikoplazma eredetű bakteriális nukleinsav kimutatása) úgy a validációs tanulmányban alkalmas stratégiát kell javasolni a pozitív eredmények értelmezésére a rutin vizsgálatok során. Például egy megfelelő specificitású alternatív módszer alkalmazásával vagy egy hivatalos módszert használva megismételjük a vizsgálatot. 2-2. Kimutatási határ. Valamely egyedi analitikai eljárás kimutatási határa a minta célnukleinsav-tartalmának az a legkisebb mennyisége, amely még kimutatható, ez azonban pontos értékként mennyiségileg nem feltétlenül határozható meg. A kimutatási határ megállapításával a nukleinsav-amplifikációs analitikai eljárás pozitív határértékét (positive cut-off point) határozzuk meg. A pozitív határérték (ahogy azt a 2.6.21 általános fejezet definiálja) a célszekvenciák azon legkisebb száma (a minta térfogategységére vonatkoztatva), mely a vizsgálati menetek 95%- ában kimutatható. Ezt a határértéket a vizsgált egyedi mintákban lévő mikoplazma-
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-13 genomok megoszlása és az olyan tényezők befolyásolják, mint pl. az enzimhatékonyság. Ilyen módon az egyedi analitikai vizsgálati menetekre különböző 95%-os határértékek adódhatnak. A pozitív határérték megállapítása céljából a jellemzett és (telepképző egységben vagy nukleinsav-másolatszámban) kalibrált házi munkatörzsek vagy EDQMstandardok egy hígítási sorozatát vizsgáljuk. A vizsgálatokat különböző napokon végezzük, hogy megállapíthassuk az egyes vizsgálati menetek közti ingadozást. A kimutatási határ validálása céljából a következőkben felsorolt fajok a szennyezésként való előfordulás gyakorisága és a törzsfejlődési rokonság szempontjából egy optimális válogatást jelentenek: A. laidlawii; M. fermentans; M. hyorhinis; M. orale; M. pneumoniae vagy M. gallisepticum; M. synoviae (ahol az előállítás folyamán madár eredetű anyagot használnak, vagy a termék madár eredetű anyaggal érintkezhet); M. arginini; S. citri (ahol az előállítás folyamán rovar eredetű vagy növényi anyagot használnak, vagy a termék ilyen eredetű anyaggal érintkezhet). Minden egyes törzsből legalább 3 egymástól független tízszeres hígítási sorozatot kell vizsgálni, mindegyik hígításból elegendő számú párhuzamossal, úgy, hogy minden hígításra összesen 24 vizsgálati eredményt kapjunk; ezáltal válik lehetővé az eredmények statisztikai elemzése. Például egy laboratórium vizsgálhat három hígítási sorozatot különböző napokon, hígításonként 8 párhuzamossal, vagy négy hígítási sorozatot különböző napokon, hígításonként 6 párhuzamossal, vagy hat hígítási sorozatot különböző napokon, hígításonként 4 párhuzamossal. Annak érdekében, hogy a hígítások számát kezelhető szinten tartsuk, egy előzetes vizsgálattal meg kell határozni a közelítő pozitív határértéket (vagyis azt a legnagyobb hígítást, amely még pozitív jelet ad). Ezt követően a hígítási tartományt az előzetes vizsgálattal meghatározott pozitív határérték köré választjuk. Ezután megfelelő statisztikai módszer alkalmazásával kiszámíthatjuk a mikoplazmák azon koncentrációját (CFU-k vagy másolatok), amelyet a vizsgálati menetek 95%-ában ki tudunk mutatni. Ezek az eredmények az analitikai eljárás ingadozásának kiértékelését is szolgálhatják.
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-14 2-3. Robusztusság. Egy analitikai eljárás robusztussága annak mértéke, hogy a módszer paramétereinek kicsi, de szándékos változtatásai mennyire hatástalanok az eljárásra; a robusztusság egyben jelzi a módszer megbízhatóságát a szokásos alkalmazás során. A robusztusságot a kifejlesztés szakaszában kell értékelni. Ennek azt kell mutatnia, hogy az analitikai eljárás megbízható a módszer paramétereinek szándékos változtatásai esetén. Az NAT-ot illetően a módszer paramétereinek kismértékű változtatásai is döntőek lehetnek. Mindazonáltal, a módszer robusztussága a kifejlesztés folyamán igazolható a kémszerek (pl. MgCl 2, primerek vagy dezoxiribonukleotidok) kis koncentrációváltoztatásai hatásának vizsgálatával. A kivonásra használt készletek vagy kivonó eljárások módosításait, valamint a különböző termociklizáció típusokat is értékelhetjük. Végezetül: a módszer robusztussága körvizsgálatokkal is értékelhető. 3. ÚTMUTATÓ AZ ÖSSZEHASONLÍTHATÓSÁGI TANULMÁNYHOZ A nukleinsav-amplifikációs módszereket (NAT) a hivatalos módszerek (indikátorsejt-tenyésztéses módszer és/vagy tenyésztéses módszer) helyett használhatjuk. Ebben az esetben összehasonlító tanulmányt kell végezni. Ez az összehasonlító tanulmány elsősorban az illető alternatív módszer és a hivatalos módszer kimutatási határainak összehasonlítását jelenti. Mindazonáltal a specificitásra (kimutatott mikoplazma fajok, vélelmezett hamis pozitív eredmények) is figyelmet kell fordítani. A kimutatási határ tekintetében a következő elfogadhatósági szempontok érvényesek: ha az alternatív módszert a tenyésztéses módszer helyettesítésére kívánják használni, úgy igazolni kell, hogy a NAT rendszerrel a 2-2. pontban megadott mindegyik mikoplazma fajra a kimutatási határ 10 CFU/ml; ha az alternatív módszerrel az indikátorsejt-tenyésztéses módszert kívánják helyettesíteni, úgy igazolni kell, hogy a NAT rendszerrel a 2-2. pontban megadott mindegyik mikoplazma fajra a kimutatási határ 100 CFU/ml. Mindkét esetben megfelelő, a nukleinsav-kópiák és a CFU számadataira hitelesített nukleinsav standardok alkalmazhatók annak megállapítására, hogy a fenti elfogadhatósági kritériumokat elértük. A referencia-készítményeknél a CFU és a nukleinsav kópiaszám közti kapcsolatot előzetesen meg kell állapítani, hogy az alternatív NAT módszer teljesítményét a hivatalos módszerek teljesítményével összehasonlíthassuk. Az összehasonlító tanulmány megtételéhez az alábbi két stratégia egyikét követhetjük:
2.6.7. Mikoplazmák Ph. Hg. VIII. Ph. Eur. 6.1.-15 a NAT alternatív módszert és a hivatalos módszert párhuzamosan, a hitelesített törzsek ugyanazon mintáival végezzük el, és így a két módszer kimutatási határát egyidejűleg értékeljük; a hivatalos módszer validálásával előzetesen nyert adatokkal hasonlítjuk össze a NAT alternatív módszer teljesítményét. Ebben az esetben mindkét validációra használt standard hitelesítését, valamint stabilitásukat gondosan dokumentálni kell. Abból a célból, hogy a hivatalos módszerekkel összehasonlítva az alternatív NAT módszer előnyeit és/vagy hátrányait megállapítsuk, az összehasonlíthatósági tanulmány jelentésének tartalmaznia kell a 2. pontban megadott valamennyi validációs elemet (specificitás, kimutatási határ, variabilitás, valamint robusztusság).