A pankreász duktális sejtek fő funkciója egy HCO 3 ban gazdag, izotónikus folyadék szekréciója, amely alapvető szerepet játszik az acinusok által termelt emésztőenzimek kimosásában illetve a gyomor felől érkező savas kémhatás neutralizálásában. Elégtelen vagy csökkent duktális ion és folyadékszekréció a pankreász működésének zavaraihoz, illetve különböző betegségek (akut pankreatitisz, cisztás fibrózis) kialakulásához vezethet. Annak ellenére, hogy a duktális sejtek alapvető fontosságúak a normál környezet fenntartásában kevés irodalmi adat áll rendelkezésünkre a duktális sejtek működésére vonatkozóan fiziológiás és patofiziológiás körülmények között. Ezért jelen projektben célul tűztük ki a pankreatitisz kiváltásában szerepet játszó etiológia faktor, az epe illetve a tripszin hatásának karakterizálását a duktális sejtekre ezen belül is elsősorban a HCO 3 szekrécióra kifejtett hatásukat vizsgáltuk. I. Epesavak hatásának karakterizálása a pankreász duktális sejtek működésére Korábbi kísérleteinkben kimutattuk, hogy a duktális sejtek luminális membránja felől adott kenodezoxikólsav (CDC; 0.1 mm) fokozza a duktális sejtek bikarbonát szekrécióját az intracelluláris kalcium emelésén keresztül. Kísérleteink elsődleges célja az volt, hogy megvizsgáljuk, hogy mely iontranszporterek, ioncsatornák vesznek részt ezen stimulált szekrécióban. A patch clamp technika egész sejtek konfigurációjának felhasználásával kimutattuk, hogy 0.1 mm CDC hatására fokozódik a duktális sejteken keresztül folyó K + ionáramok nagysága. Küldönböző K + csatorna inhibitorok segítségével kimutattuk, hogy a CDC által aktiválta K + konduktancia, a nagykonduktanciájú Ca 2+ aktiválta K + csatorna vagy más néven BK csatorna gátlószerével, iberiotoxinnal (IBT; 100 nm) teljes mértékben gátolható volt (1. ábra). Kontroll CDC CDC + IBT 1. ábra. Az iberiotoxin hatása a nagykonduktanciájú Ca 2+ aktiválta K + csatornákra. (A) Reprezentatív K + ionáramok a kezelés előtt (i), CDCvel történő kezelést követően (ii) illetve iberiotoxin (IBT) (iii) jelenlétében. (B) Áram/feszültség (I/V) grafikon. A négyzet az alap áramot, a gyémánt a CDCstimulált áramot, a háromszög pedig az IBT kezelést reprezentálja. (C) A CDC és IBT hatása + 60 mvnál mért áram denzitásra. CDC: kenodezoxikólsav, IBT: iberiotoxin. *=p 0.05 vs. Kontroll. A következő lépésben megvizsgáltuk, hogy a CDC HCO 3 szekréciót stimuláló hatása a BK csatornák aktiválásán keresztül valósule meg. Ehhez IBT (100 nm) jelenlétében vizsgáltuk a CDC szekréciót stimuláló hatását intakt pankreász duktuszokon a mikrofluorometriás technika felhasználásával. A bikarbonát szekréció nagyságára az alkalózisból történő regeneráció mértékéből következtettünk.
Eredményeink azt mutatták, hogy a bazális oldal felől adott IBT nem befolyásolta a CDC hatását, ezzel szemben, a luminális oldal felől adva, teljes mértékben megszüntette a CDC HCO 3 szekrécióra kifejtett stimuláló hatását (2. ábra). Továbbá kimutattuk, hogy a luminális membrán felől adott IBT nem befolyásolja a szekretin, luminális ATP vagy carbacholindukálta HCO 3 szekréciót. Eredményeink azt mutatják, hogy a BK csatornák aktivációja fontos szerepet játszik a CDCstimulált szekrécióban illetve, hogy ezek a csatornák feltehetőleg a duktuszok luminális membránjára lokalizálódnak. Kontroll CDC CDC + IBT (B) CDC + IBT (L) Regeneráció alkalózisból 2. ábra. A luminális membrán felől adott IBT gátolja a CDC szekréciót stimuláló hatását. (A) Reprezentatív ph görbék a kontroll, luminálisan adott CDC, CDC + bazális IBT illetve CDC + luminálisan adott IBT jelenlétében. (B) A HCO 3 szekréció mértékét (J(B min)) az alkalózisból történő ph regeneráció mértékéből becsültük meg lineráris regressziós analízis segítségével. B: bazális, L: luminális. *=p 0.05 vs. Kontroll. Kontroll CDC CDC + IBT (B) CDC + IBT (L) Mivel eredményeink azt sugallták, hogy a CDCstimulálta szekréció a BK csatornák aktivációján keresztül valósul meg, feltételeztük, hogy a BK csatornák aktiválása egy farmakológiai vegyülettel, hasonlóképpen aktiválná a HCO 3 szekréciót. Ehhez megvizsgáltuk egy specifikus BK csatornaaktiváló, NS11021 hatását a HCO 3 szekrécióra az alkalózisból történő regeneráció vizsgálatával. A luminális membrán felől adott 3 µm NS11021 fokozta a duktális HCO 3 szekréciót, míg az NS11021 inaktív formája, az NS13558 nem befolyásolta a szekréció mértékét. A következő lépésben immunhisztokémiai eljárással sikerült kimutatnunk a BK csatornák jelenlétét a duktális sejtek luminális membránján, míg az acinusokban negatív festődést kaptunk. A következőkben azt vizsgáltuk, hogy a CDC hatása az újonnan felfedezett epesav receptor, a Gpbar1 közvetítésével valósule meg. A Gpbar1 receptor ellen kifejlesztett ellenanyag pozitív festődést mutatott az acinusokban. A duktális sejtekben azonban nem sikerült ezen receptor jelenlétét kimutatnunk. Ezzel szemben reverz transzkripciós PCR technikával sikerült kimutatnunk a az organikus anion transzporter2 (Oatp2) epesav transzporter jelenlétét tengerimalac pankreászban illetve a fő pankreász vezetékben. Végül pedig elektronmikroszkóp felhasználásával megvizsgáltuk, hogy az epesavas kezelés okoze morfológiai eltéréseket a pankreász duktális sejtek sejtorganellumaiban vagy a
plazmamembrán integritásában. A pankreász duktuszok CDCvel (0.1 mm) történő 10 perces inkubálása nem befolyásolta a sejten belüli organellumokat, morfológiai elváltozást nem tapasztaltunk Eredményeink összefoglalásaként elmondhatjuk, hogy: 1.) Kimutattuk egy Ca 2+ aktiválta K + csatorna (BK) jelenlétét tengerimalac pankreász duktális sejtek luminális membránján 2.) Megállapítottuk, hogy a BK csatornák alapvető szerepet játszanak a kis koncentrációban adott CDC duktális HCO 3 szekréciót stimuláló hatásában 3.) A BK csatorna aktivátor, NS11021 stimulálta a duktális HCO 3 szekréciót. Hipotézisünk szerint a duktális HCO 3 szekréció stimulációja védekező funkciót jelenthet a biliáris akut pankreatitisz kezdeti szakaszában azáltal, hogy kimossa a különböző toxikus faktorokat, így az epesavakat a duktális fából, megakadályozva ez által a pankreász károsodását. Eredményeink azt mutatják, hogy a BK csatornák aktivációja terápiás lehetőséget jelenthet az akut pankreatitisz kezelésében. A tripszin hatásának karakterizálása a pankreász duktális sejtek működésére Első lépésben megvizsgáltuk, a PAR2 receptor kifejeződését tengerimalac pankreász duktális sejtekben illetve humán pankreászban. Immunhisztokémiai módszer erőteljes PAR2 festődést mutatott mind a tengerimalac pankreász duktuszokban. Az intra/interlobuláris duktuszok festődésének denzitometriás összehasonlítása nagy mennyiségű PAR2 expressziót mutatott az intralobuláris duktuszokban, míg a nagyobb, interlobuláris duktuszokban alig volt detektálható ezen receptor kifejeződése. A humán pankreász immunhisztokémiai vizsgálata hasonló festődési mintázatot mutatott a tengerimalac pankreászéhoz. Tengerimalac Humán 3. ábra. PAR2 lokalizációja tengerimalac és humán pankreász duktuszokban. A PAR2 receptor a kis méretű intra/interlobuláris duktuszok luminális membránjára lokalizálódik. 400Xos nagyítás, vonalas mérték: 50 µm. A következő kísérletsorozatban megvizsgáltuk a tripszin, a tripszin aktiváló peptid, PAR2 AP, a tripszin agonista és antagonista (PAR2ANT) hatását a duktális sejtek intracelluláris kalcium szintjére és phjára. Kimutattuk, hogy a PAR2AP és a tripszin dózisfüggő intracelluláris kalcium szignalizációt indukál a tengerimalac pankreász duktuszokban. A luminális membrán felől adott PAR2AP hatását (1, 10 és 100 µm) mind a PAR2 antagonista (10 µm) mind pedig a kalcium kelátor BAPTAAM (40 µm) teljes mértékben kivédte, míg az extracelluláris oldatból történő kálcium elvonása nem befolyásolta. A luminális membrán felől adott tripszin (0.1, 1 and 10 µm) hatása megegyezett a PAR2AP hatásával. A tripszin generálta kálcium szignált mind a szójabab tripszin inhibitor (SBTI, 5 µm), mind a PAR2ANT (10 µm) mind pedig a BAPTAAM (40 µm) előkezelés gátolta.
Ezen eredmények alapján megállapíthatjuk, hogy a tripszin intracelluláris kálcium koncentrációra ([Ca 2+ ] i ) kifejtett hatása a PAR2 receptorok aktiválásán keresztül valósul meg (4. ábra). A B TRIPSZIN 4. ábra. A tripszin hatása az intracelluláris kalcium koncentrációra ([Ca 2+ ] i ) mikroperfundált tengerimalac duktuszokban. (A) A reprezentatív görbék 0.1, 1 illetve 10 µm tripszin hatását mutatják a [Ca 2+ ] i re. A (B) ábrán látható a különböző koncentrációban adott tripszin, tripszin inhibitor (SBTI), tripszin antagonista (PAR2 ANT), illetve a BAPTAAM kezelés és az extracelluláris kalcium elvonás hatása a [Ca 2+ ] i re. *=p 0.05 vs. 0.1µM tripszin, **=p 0.05 vs. 10µM tripszin. SBTI: szójabab tripszin inhibitor, PAR2 ANT: PAR2 antagonista. TRIPSZIN (µm) Az intracelluláris phban (ph i ) bekövetkező változások detektálása a phfüggő fluorescens festék, BCECFAM felhasználásával történt. A PAR2AP (10 µm) és a tripszin (10 µm) dózisfüggő alkalizációt indukál a duktális sejtekben. Ezen alkalizáció feltehetőleg az apikális membránon keresztüli bikarbonát kiárámlás gátlásán keresztül jön létre. A PDEC SBTIvel (5 µm), PAR2ANTval (10 µm) vagy BAPTAAMel (40 µm) történő előkezelése kivédte a tripszin ezen gátló hatását. Fontos megjegyezni, hogy a Cl /HCO 3 kicserélőt gátló H 2 DIDS adása illetve a Cl elvonása a külső oldatból csökkentette, de nem szüntette meg a tripszin hatását az intracelluláris ph i ra, amely arra utal, hogy a tripszin mind a Cl függő mind pedig a Cl független bikarbonát szekretáló mechanizmusokat gátolja. A következőkben a patch clamp technika whole cell configurációjának a felhasználásával megvizsgáltuk, hogy a tripszin és a többi farmakológiai ágens hatását a CFTR Cl áramokra. A PAR2AP (10 µm) és a tripszin (10 µm) az alap CFTR áramokat nem, viszont a forskolinaktiválta CFTR áramokat több mint 50%al csökkentette. Mindkét esetben a gátlás irrevezibilis volt. SBTIvel (5 µm) vagy PAR2ANTval (10 µm) történő előkezelés teljesen megszüntette a tripszin ezen gátló hatását, amely arra utal, hogy a tripszin a CFTR Cl áramokat a PAR2 receptor aktiválásán keresztül gátolja. A következő lépésben megvizsgáltuk, hogy befolyásolja a duktális phban bekövetkező változás a tripszinogén autoaktivációját. A tripszinogén autoaktivációját a ph csökkenés (8.5 ről 7re) szignifikánsan megemelte. Ezt követően az autoaktiváció egy lassú csökkenést mutatott ph 7.0 és 6.0 között. Annak érdekében, hogy kizárjuk, hogy az autoaktivációban bekövetkező változás a pufferek különböző ionösszetételével magyarázható, megismételtük a
kísérletet 100mM NaClot tartalmazó pufferben is. Bár a reakció összeségében lassabban ment végbe NaCl jelenlétében, az autoaktiváció ugyanolyan ph függést mutatott. Végül pedig megvizsgáltuk a PAR2 jelenlétét krónikus pankreatitiszben. Az 5. ábrán látható, hogy krónikus pankreatitiszben csökkent mind fehérje mind pedig mrns szinten a PAR2 kifejeződése. A PAR2 citoplazmába történő transzlokációban nem tapasztaltunk eltérés a normál és krónikus pankreatitiszben szenvedő betegekből vett szöveti mintákban. A IMMUNOHISZTOKÉMIA B DENZITOMETRIA ÉS PCR C MEMBRÁN CITOPLAZMA NORMÁL CP 5. ábra. PAR2 kifejeződése normál és krónikus pankreatitiszben szenvedő betegek pankreászában. Az (A) ábrán a normál (i és ii) illetve a krónikus pankreatitiszes (iii és iv) szövetminták immunohisztokémiai festése látható PAR2 elsődleges ellenanyag jelenlétében (i és iii) illetve hiányában (ii és iv). (B) Relatív optikai denzitás. *=p 0.05 vs. CP membrán. (C) ábrán a PAR2 mrna expressziójának analízise. *=p 0.05 vs. CP. CP: krónikus pankreatitisz. Vonalas mérték: 50 µm. Eredményeink alapján arra következtetünk, hogy a pankreász duktális sejtek HCO 3 szekréció alapvető szerepet játszik a tripszinogén autoaktivációjának a kivédésében. Azonban, ha a tripszin jelen van a duktális fában a duktális sejtek luminális membránjára lokalizálódó PAR 2 receptorok aktiválódnak, amely intracelluláris kalcium felszabaduláshoz és megemelkedett intracelluláris kalcium szinthez vezet. Ezen folyamat gátlólag hat mind a luminális anion kicserélőre mind pedig a CFTR Cl csatornára, amely a HCO 3 szekréció csökkenését fogja eredményezni. A csökkent szekréció miatt egyrészt lassabban jutnak el a zimogének a duodénumba, másrészt az elégtelen HCO 3 szekréció miatt lecsökken a duktális ph, amely elidítja a tripszinogén idő előtti autoaktivációját. A tripszinogén autoaktivációja pedig tovább gátolja az anion kicserélő működését beindítva ezáltal egy ördögi kör, amely végső soron a pankreatitisz kialakulásához vezet.