Giliszta immunsejtek aktivációjának és lyseninexpressziójának vizsgálata Doktori (PhD) értekezés Opper Balázs Pécsi Tudományegyetem, Klinikai Központ, Immunológiai és Biotechnológiai Intézet Doktori Iskola vezetője: Dr. Lénárd László egyetemi tanár Programvezető: Dr. Németh Péter egyetemi tanár Témavezetők: Dr. Németh Péter egyetemi tanár Dr. Engelmann Péter egyetemi adjunktus Pécs, 2014 1
TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE... 4 2. BEVEZETÉS... 5 2. 1. A veleszületett és az a adaptív immunitás kapcsolata az élővilágban... 5 2. 2. A gilisztafajok immunrendszere... 6 2. 3. A kalciumion jelentősége a gerinctelenek és a gerincesek immunválaszában... 11 2. 4. Mitogének gerinctelen immunsejtek osztodására gyakorolt hatása... 12 2. 5. Humorális faktorok szerepe a giliszták immunválaszában... 13 3. CÉLKITŰZÉSEK... 16 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK... 17 4. 1. Vegyszerek... 17 4. 2. Coelomasejtek izolálása... 17 4. 3. A sejtek feltöltése Ca 2+ -szenzitív fluoreszcens indikátorral... 18 4. 4. Coelomasejtek stimulálása, proliferációjuk vizsgálata PI festéssel... 18 4. 5. Ca 2+ -ATPáz enzim citokémia... 19 4. 6. Monoklonális anti-lysenin ellenanyag létrehozása... 20 4. 7. Giliszta coelomasejtek immuncitokémiai vizsgálata... 20 4. 8. Immunhisztokémiai és immunfluoreszcens vizsgálatok giliszta szöveteken... 22 4. 9. In vitro baktérium kezelés vizsgálata... 22 4. 10. Coelomasejt-lizátum készítése... 22 4. 11. Indirekt ELISA-vizsgálat anti-efcc5 ellenanyaggal... 23 4. 12. Szendvics ELISA a-efcc5 ellenanyag alkalmazásával... 23 4. 13. SDS-poliakrilamid gél elektroforézis és Western blot... 23 4. 14. Áramlási citometria FITC konjugált a-efcc5 ellenanyaggal... 24 4. 15. Az eredmények értékelése és statisztikai elemzése... 25 5. EREDMÉNYEK... 26 5. 1. E. fetida és A. caliginosa fajokból származó coelomasejt alcsoportok nyugalmi kalciumszintje... 26 5. 2. Ionofór kezelés hatása coelomasejt alcsoportok kalciumszintjére... 27 5. 3. A PMA kezelés nem indukált kalcium mobilizációt a coelomasejt alcsoportokban... 31 5. 4. Giliszta coelomasejtek thapsigargin-szenzitív kaclium pumpái.... 33 5. 5. Fitohemagglutinin Ca 2+ -mobilizáló hatása E. fetida coelomasejtekben... 36 2
5. 6. Bakteriális formil peptid intracelluláris kalciumszint emelkedést okoz a coelomasejtekben... 38 5. 7. Coelomasejtek sejtciklusának vizsgálata... 39 5. 8. Izolált coelomasejtek lysenin expressziója... 40 5. 9. Szabad chloragocyta sejtek lysenin expressziója... 41 5. 10. Gram pozitív baktériumok lysenin termelést befolyásoló hatása... 44 6. DISZKUSSZIÓ... 46 6. 1. Coelomasejtek intracelluláris kalciumszintjei... 46 6. 2. Coelomasejtek Ca 2+ -influxának indukciója ionomycinnel és gátlása PMA-val... 46 6. 3. Ca 2+ -ATPáz aktivitás coelomasejtekben... 49 6. 4. Fitohemagglutinin és fmlp coelomasejtek kalciumjelére gyakorolt hatása... 49 6. 5. Ismételt sejtizolálások és mitogénstimuláció hatása a coelomasejtek osztódására... 50 6. 6. A lysenin expressziója Eisenia coelomasejtekben és szövetekben... 51 6. 7. In vitro baktérium kezelés befolyásolja a coelomasejtek által termelt lysenin mennyiségét... 52 7. KONKLUZIÓK... 53 8. ÖSSZEFOGLALÁS... 54 9. IRODALOMJEGYZÉK... 55 10. A DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA... 65 11. EGYÉB TUDOMÁNYOS KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA... 65 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 67 13. MELLÉKLETEK... 68 3
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACD Citrate-dextrose solution (citrát-dextróz oldat) A.U. arbitrary units BrdU 5-bromo-2-deoxyuridine (5-bromo-2-deoxiuridin) BSA Bovine serum albumin (borjú szérum albumin) CCF coeloma cytolitic factor (coeloma citolítikus faktor) CD cluster of differentiation CFA complete Freund s adjuvant (komplett Freund adjuváns) ConA Concanavalin A DAPI 4, 6- diamino-2-phenylindoline (4,6- diamino-2-fenilindolin) DGNBP Drosophila Gram-negative bacteria-binding protein (Drosophila Gram-negatív baktérium-kötő protein) DMEM Dulbecco s Modified Eagle Medium EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid (etiléndiamin-tetraecetsav) EFCC Eisenia fetida coelomocyte cluster EGTA Ethylen glycol tetraacetic acid (etilénglikol-tetraecetsav) EP Eiseniapore FITC Fluorescein isothiocyanate (fluoreszcein izothiocianát) fmlp N- formyl-l-methionyl-l-leucyl-l-phenylalanine- (N-formil L-metionil L-leucil fenilalanin) HRP Horseradish peroxidase (tormaperoxidáz) IFA incomplete Freund s adjuvant (inkomplett Freund adjuváns) LPS Lipopolysaccharide (lipopoliszacharid) NK natural killer cells (természetes ölősejtek) NL557 NorthernLights 557 Fluorochrome (NorthernLights 557 fluorokróm) PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis (poliakrilamid gél elektroforézis) PAMP pathogen-associated molecular pattern (patogén asszociált molekuláris mintázat) PBS Phosphate Buffered Saline (foszfát pufferolt sóoldat) PHA Phytohaemagglutinin A (fitohemagglutinin A) PI Propidium iodide (propidium-jodid) PMCA Plasma membrane Ca 2+ -ATPase (plazma membrán kalcium ATPáz) PRR pattern recognition receptor (mintázatfelismerő receptor) PWM Pokeweed mitogen RIPA radioimmunoprecipitation assay SDS Sodium dodecyl sulfate (nátrium-dodecil-szulfát) SERCA sarcoplasmatic reticulum calcium transport ATPase (szarkoplazmatikus retikulum kalcium ATPáz) TBS Tris-buffered saline TG thapsigargin 4
2. BEVEZETÉS 2.1. A veleszületett és az adaptív immunitás kapcsolata az élővilágban Az immunrendszer legfontosabb feladata az egyedi integritás fenntartása. A túlélés feltétele a kórokozók vagy a szervezet saját, de módosult struktúrái elleni folyamatos védekezés. A gerinctelen és a gerinces szervezetek immunrendszerének összehasonlító szemléletű vizsgálata napjainkban mind az alapkutatások fontos részét, mind az alkalmazott kutatás ígéretes területét képezik. Számos gerinctelen faj szerepet játszik a fertőző betegségek terjesztésében, parazitaként, vagy mezőgazdasági kártevőként. Más, gazdaságilag kevésbé jelentős fajok fontos tagjai az ökoszisztémának, vagy értékes tápanyagforrásként szolgálnak. Immunrendszerük vizsgálata ezért gyakorlati jelentőséggel is bír az ellenük való védekezés, vagy éppen a védelmük és tenyésztésük szempontjából (Cooper és mtsai, 2002; Kvell és mtsai, 2007). A gerinctelen fajok veleszületett, azaz nem antigén-specifikus immunitásának tanulmányozása jelentős tudományos eredményekhez vezetett a bonyolultabb felépítésű adaptív immunrendszerrel, klónspecifikus receptorokkal is rendelkező gerincesek esetében is. A fagocitózis folyamatát Mecsnyikov gerinctelen modellen végzett kísérletei alapján írta le, majd a későbbiekben a jelenség előfordulása igazolódott az adaptív immunrendszerrel rendelkező állatfajok esetében is (Cooper és mtsai, 2002). A gerinctelen állatmodellek vizsgálata napjainkban is jelentőséggel bír, mindemellett jövőbeni Drosophila modellen végzett tumorgenezis-kísérleteknek is nagy jelentőségük lehet (Neal és mtsai, 2011; Na és mtsai, 2013). Az adaptív immunrendszerrel nem rendelkező, gerinctelen állatfajok számos mechanizmust alkalmaznak szervezetük védelmére, pl. leukocyta jellegű immunsejteket, amelyek képesek immunprotektív molekulák szintézisére és szekréciójára. Ezek az immunsejtek sem morfológiai, sem pedig funkcionális szempontból nem egységesek. A veleszületett immunitás sejtes és molekuláris komponenseinek összehangolt rendszere teszi lehetővé az antimikrobiális peptidek termelését, a koagulációs, enkapszulációs, cytotoxikus és a fagocita funkció megvalósítását. 5
A lítikus hatású anyagok termelése már egysejtű élőlények esetében is megfigyelhető, pl. az Entamoeba histolytica fajban azonosították az ún. amoebapore polipeptidet, melynek lítikus hatásai a sertés cytotoxikus limfocitáiból ismert NK-lysinhez hasonlítanak (Leippe és mtsa, 1994). Ezzel a parazitával fertőzött betegek szervezetében az amoebapore ioncsatornákat képez a célsejtek membránjában, ami akár életveszélyes állapotot is előidézhet. További antibakteriális hatással rendelkező humorális faktorok megismerése az emlős szervezetekben lejátszódó kórfolyamatok jobb megértését teheti lehetővé. A hatékony veleszületett immunrendszer a kórokozók membránkomponenseit felismerő mintázatfelismerő receptorok (PRR) működésén alapul (Honti és mtsai, 2013). A receptorok jelátviteli útvonalakat aktiválnak, melyek végül gyulladásos mediátorokat, antimikrobiális peptideket és a fagocitózis elemeit kódoló géneket szabályoznak (Cooper és mtsai, 2002; Csikós és mtsai, 2009; Engelmann és mtsai, 2005). A gerinctelenek sejtes és szolúbilis faktorokból szerveződő veleszületett immunitása a saját-nem saját struktúrák elkülönítését, a károsodott saját struktúrák és külső antigének hatékony eliminálását biztosítja. Ezt a komplex immunrendszert számos, az evolúció során konzervált molekula és mechanizmus jellemzi az élővilágban, ezért a gerinctelen fajok immunrendszerének megértése fontos lépés a gerincesek immunitásának megismeréséhez is. Az emlősök szervezetében is a védelem első vonalában szerepelnek a veleszületett immunitás gyorsan aktiválódó komponensei, biztosítva a szervezet védelmét az adaptív immunitás lassabb aktivációjáig. A veleszületett immunitás részét képező antimikrobiális peptidek nagyban befolyásolhatják az adaptív immunitás antigénekre adott válaszát (Cooper és mtsai, 2002). 2.2. A gilisztafajok immunrendszere A gyűrűsférgek törzsébe (Annelida), a nyeregképzők osztályába (Clitellata) és a kevéssertéjűek alosztályába (Oligochaeta) sok eltérő megjelenésű gilisztafaj tartozik. A kisebb méretű fajok mindössze néhány centiméter hosszúságúak, a leghosszabbak elérhetik az egy méter körüli testhosszt is (1. és 2. kép). 6
1. kép L. terrestris (a) és L. castaneus (b) gilisztafajok egy-egy példánya. hindawi.com 2. kép Megascolides australis faj egy példánya. Fotó: Alan Yent/ Museumvictoria.com.au 3.kép A kísérleteinkhez használt Eisenia faj egy példánya. A jelentős méretbeli különbségek ellenére a giliszták testfelépítése alapvetően hasonló (3 és 4. kép). A giliszta hosszúkás, hengeres teste homonóm szelvényekből épül fel. A giliszták testének külső felszínét nyálkás bőr fedi, ami összenőtt az alatta elhelyezkedő izomréteggel. Ezeket a rétegeket együttesen bőrizomtömlőnek nevezik, és fontos szerepe van az állatok mozgásában, légzőfunkcióiban, és érzékelésében. A kevéssertéjű gyűrűsférgek ősszájúak, háromszakaszos bélcsatornával rendelkeznek. Érdekesség, hogy zárt keringési rendszerrel rendelkeznek, ami egyedülálló a gerintelen állatfajok között. Vörös színű vérükben az oxigénszállító molekula a hemoglobin. A mezoderma tagolt, belőle számos szerv és szövet differenciálódik. A mezodermából alakul ki a valódi, másodlagos testüreg (ún. coeloma), mely hámmal bélelt. Ezt az üreget tölti ki a coelomafolyadék, melyben szabad immunsejtek és humorális komponensek is találhatók. 7
Veszély esetén a giliszták ezt a coelomafolyadékot bocsátják ki pórusaikon keresztül a környezetükbe. 4. kép A giliszták testfelépítését keresztmetszetben bemutató sémás rajz. http://www.esu.edu/~milewski/intro_biol_two/lab_10_platy_annelida_mol/annelida.html Az Oligochaeta alosztály számos tagját használják ökotoxikológiai, detoxifikációs és fémfelhalmozási kísérletekben. A gilisztafajok azután kerültek az összehasonlító immunológiai vizsgálatok előterébe, hogy transzplantációs (allo- és xenograft rejekciós) kísérletekkel sikerült bizonyítani immunrendszerük képességét a saját szövetek felismerésére (Cooper 1968, 1969, 1970). További érdekesség, hogy egy rövid távú immunológiai memória meglétét is próbálták igazolni ebben az állatcsoportban (Cooper, 1969b; Cooper és Roch, 1986). A giliszták immunrendszerének celluláris alkotóelemei a gerincesek fehérvérsejtjeihez hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek, így képesek a fagocitózisra, sejtsejt kölcsönhatásokra és a lítikus folyamatokban való részvételre (Cooper, 1981; 1993). A gerinctelen állatok immunsejtjeire jellemző lítikus tulajdonságok jól vizsgálhatóak mikroorganizmusokat, vörösvértesteket vagy tumorsejteket célsejtekként felhasználó kísérleti rendszerekben (Cooper és mtsai, 1996; 1999). 8
A humorális és a sejtes elemek egymástól függetlenül vagy együttműködve is szolgálhatják a természetes immunitás folyamatait. A célsejt-immunsejt kapcsolatot igénylő folyamatoknál gyorsabb védelmet biztosítanak a coelomafolyadék lítikus hatású humorális faktorai, ezek termelése segíti az állatok túlélését a sokszor kedvezőtlen tulajdonságú, mikroorganizmusokat és szennyező anyagokat is tartalmazó talajban. Ez azonban csak egy aspektusa a giliszták immunvédelmének, és alapját a szolúbilis faktorokat termelő és szekretáló immunsejtek csoportjai képezik. A giliszták immunsejtjeit - a testüregükben előforduló úgynevezett coelomasejteketlítikus és fagocita folyamatok mediátorainak tartják. A coelomasejtek szerepét az immunitásban már korábbi munkákban is vizsgálták (Toupin és Lamoureux, 1976, Toupin és mtsai, 1977). Ezeket az immunsejteket ultrastruktúrájuk és citokémiai jellemzőik alapján több alcsoportba sorolták az elmúlt évtizedekben (Linthicum és mtsai, 1977; Stein és mtsai, 1977, Cossarizza és mtsai, 1996; Engelmann és mtsai, 2002). A kis coelomasejteket a cytotoxikus folyamatokért, a nagy coelomasejteket pedig a fagocitózisért tartották felelősnek (Cossarizza és mtsai, 1996). A sejtcsoportok további elkülönítéséhez elektronmikroszkópiát és áramlási citometriát használtak. A kis, elektrondenz coelomasejtek többféle emlős CD markerre (CD11a, CD45RA, CD45RO, CDw49B, CD54, CD90 (Thy-1), ß2m) specifikus ellenanyaggal mutattak keresztreakciót (Cooper és Mansour, 1989; Cooper és mtsai, 2002, Cossarizza és mtsai 1996; Roch és mtsai, 1983). Ezen immunsejtek hatékonyan lizálnak NK-szenzitív K562 célsejteket (Cossarizza és mtsai, 1996). A nagyobb méretű coelomasejtek negatívnak bizonyultak a fenti CD markerekre, nem kötődtek a K562 célsejtekhez sem, de fagocitózisra képesek voltak. Klónspecifikus receptorral rendelkező sejtek előfordulása a gerinctelen állatfajokban nem ismert, a cytotoxikus reakcióban természetes ölősejt-aktivitás játszhat szerepet. A giliszták hatékony természetes ölősejt-szerű lítikus aktivitása magyarázhatja a kialakuló malignus sejtek hatékony elpusztítását (Cooper és mtsai, 2002). Intézetünkben előállított, emlős konzervatív antigének (citokinek, peptidhormonok, enzimek) ellen termeltetett monoklonális ellenanyagok (a-thy-1, a-cd24, a-tnf-α, a- TSH, a-cu/zn SOD) felhasználásával is sikerült kimutatnunk keresztreakciókat a coelomasejtek két alpopulációjában (R1 és R2), míg a harmadik sejtcsoport (eleocyta, R3) konzekvensen negatívnak bizonyult (Engelmann és mtsai, 2002). 9
Más csoportosítás szerint granulált és hyalin coelomasejteket, továbbá szabad chloragocyta sejtcsoportot írtak le (Cooper és mtsai, 2002). Egyes tudományos közlemények szerint a coelomafolyadékban előforduló szabad chloragocyták (az úgynevezett eleocyták) végállapotú sejtek, melyek a középbelet körbevevő chloragogén szövetből származnak (Cholewa, 2006). Ez a sejttípus helyhez kötötten kezdi fejlődését, majd szabad sejtalakká válik. A giliszta immunsejttípusok pontosabb funkcionális elkülönítése, és giliszta coelomasejt CD markerek meghatározása (EFCC markerek, Engelmann és mtsai, 2005) érdekében monoklonális ellenanyagokat termeltettek a coelomasejtek ellen. A létrehozott ellenanyagok felhasználásával három coelomasejt alpopuláció különíthető el E. fetida gilisztában, melyek közül kettő effektor sejttípusként vesz részt az immunológiai folyamatokban (fagocitózis és enkapszuláció) (Engelmann és mtsai, 2005). A giliszták középbelének falát kívülről borító chloragogén szövetet felépítő chloragocyta sejtpopuláció funkcionális szempontból homológnak tekinthető a gerincesek máj sejtjeivel (Jamieson, 1981). A giliszták chloragocyta alcsoportját hozzák kapcsolatba bizonyos lítikus és agglutinációs hatással rendelkező molekulák (hemolizinek) termelésével, melyek közé olyan citolítikus faktorok tartoznak, mint a fetidinek, lyseninek és az eiseniapore (Eue és mtsai, 1998). Egyes szerzők szerint a chloragocyta sejtek elkülönült populációkra oszlanak: a perifériás chloragocyta sejtek a bélfalban, míg a centrális chloragocyta sejtek a typhlosolisban helyezkednek el (Ohta és mtsai, 2000). Ezek a sejtek tápanyagokat raktároznak (glikogént, lipideket), és általános anyagcsere folyamatok mellett szerepük lehet a hemoglobin, és fémeket kötő cisztein tartalmú proteinek (pl. metallothionein) termelésében is (Fischer, 1993; Morgan és mtsai, 2004). A chloragocyták autofluoreszcens sejtek, amit a chloragoszómáikban található riboflavin okozhat (Cholewa és mtsai, 2006). Korábbi in situ hibridizációs és poliklonális ellenanyagokkal végzett munkák a centrális chloragocyták lysenin expressziós szerepét valószínűsítették (Ohta és mtsai, 2000; Sekizawa és mtsai, 1996b). A szabad chloragocyták (ún. eleociták) a coelomaüreg granulált sejtcsoportja, eredetük ma is vita tárgya, valószínűleg a bél chloragogén szövetéből származnak. A szabad chloragocyta sejtek fagocita aktivitása a többi coelomocyta 10
sejtcsoporthoz képest elenyésző (Engelmann és mtsai, 2005), azonban fontos szerepük van az antimikrobiális anyagok termelésében (Cooper és mtsai, 2002). A nem-saját struktúrák felismerése valószínűleg számos, még nem teljesen felderített jelátviteli utat is aktiválhat a gilisztákban. 2.3. A kalciumion jelentősége a gerinctelenek és a gerincesek immunválaszában A kalciumionnak másodlagos hírvivőként számos sejttípus életfolyamatában van kiemelt szerepe (Carafoli, 2002, 2005). Az intracelluláris szabad kalciumszint szerepe emlősök jelátviteli útvonalaiban jól ismert (Case és mtsai, 2007; Langerbacher és Chen, 2008; Oh-Hora és Rao, 2008). A Ca 2+ -szint változása alapvető fontosságú az eukarióta sejtek aktivációjában és homeosztázisának fenntartásában (Case és mtsai, 2007): a kalciumionok kulcsszereplői az izomkontrakciónak (Panfoli és mtsai 1999), a reproduktív folyamatoknak (Whitaker, 2008), és az immunválasznak is (Oh-Hora és Rao, 2008; Vig és Kinet, 2009). Az élővilágban a kalciumszint változása plazmamembránhoz vagy sejtorganellumokhoz kapcsolt kalciumtranszporterek és ioncsatornák, valamint kalciumkötő fehérjék (pl. kalmodulin, kalmodulinszerű proteinek, kalcium-dependens protein-kinázok) által valósul meg (Batistic és Kudla, 2012). A kalciumcsatornákat potenciálváltozás vagy ligandok kötése aktiválhatja. A Ca 2+ -pumpák (Ca 2+ -ATPázok) előfordulhatnak a sejtek plazmamembránjához kapcsolódva (PMCA), vagy az endoplazmatikus, ill. szarkoplazmatikus retikulumhoz kötve (SERCA). A gerincesek veleszületett és adaptív immunrendszerében a sejtek aktivációja kalciumhoz köthető jelátviteli utakon keresztül valósulhat meg. Az intracelluláris kalciumszint emelkedése számos immunológiai folyamathoz vezethet, például kemotaxishoz, degranulációhoz, fagocitózishoz, citokinek felszabadulásához vagy proliferációhoz (Suzuki és mtsai, 2012). A gerinctelen fajok is hasonló evolúciósan konzervált biokémiai, jelátviteli mechanizmusokkal rendelkeznek (Crozatier és Meister, 2007). Irodalmi adatok utalnak arra, hogy a kalcium másodlagos hírvivőként rovar- és puhatestű fajok sejtjeinek intracelluláris jelátvitelében is szerepet játszik (Burlando és mtsai, 2001; Whitaker, 2006), illetve nehézfémek hatására pl. a kagyló hemocyták kalcium-homeosztázisa is megváltozott 11
(Marchi és mtsai, 2004; Viarengo és mtsai, 1993). A végrehajtott in vitro kísérleti eredmények azt sugallják, hogy a hemocyta sejtek citoszoljának kalciumszint emelkedése aktiválja a foszfolipáz A2 enzimet, ami a lizoszómák membránjának destabilizációjához vezet (Marchi és mtsai, 2004). Eisenia fetida gilisztákban azonosítottak egy evolúciósan konzervált kalciumkötő fehérjét, a kalretikulint. A protein számos sejt- és szövetféleség mellett a coelomasejtekben is expresszálódik (Kauschke és mtsai, 2001; Silerova és mtsai, 2007). 2.4. Mitogének gerinctelen immunsejtek osztódására gyakorolt hatása A mintázatfelismerő faktorok a kórokozókra jellemző molekuláris mintázatokat (PAMP) képesek megkötni. PAMP motívumként kerülnek felismerésre a Gram-negatív és Gram-pozitív baktériumok, valamint az élesztők számos sejtfalkomponense (pl. zymosan) is. A gerinces fajokkal végzett kísérletek alapján megállapították, hogy a különböző PAMP molekulák -mitogénként- képesek bizonyos sejttípusok proliferációját elősegíteni. Az LPS a monociták és makrofágok, illetve a limfociták poliklonális aktivációját okozza (Goodman és Sultzer 1979; Tough és mtsai, 1997), de beszámoltak már az LPS hatására létrejött nitrogén-monoxid termelés makrofágok proliferációját gátló hatásáról is (Vadiveloo és mtsai, 2001). Az egyik leggyakrabban alkalmazott mitogén a PMA, mely a protein-kináz C jelátviteli úton keresztül a sejtek aktivációját és proliferációját okozza (Ma és mtsai, 2009). A növényi lektinek közül a ConA és a PHA a legismertebb mitogén (Currie és mtsai, 2007; Fortier és mtsai, 2008). Gerinctelen modellállatok esetében korlátozott ismeretek állnak rendelkezésünkre a mitogének sejtosztódásra gyakorolt hatásairól. LPS és ConA hatására az Asterias rubens tengeri csillag coelomasejtjeinek száma megemelkedett (Holm és mtsai, 2008). PMA kezelést követően a Biomphalaria glabrata csigafaj osztódó hemopoetikus sejtjeinek aránya növekedett (Salamat és Sullivan, 2009). Az LPS és ConA apoptózist indukáló hatásáról is rendelkezünk adatokkal (Grant és mtsai, 1995). Eisenia fetida coelomasejtek osztódási képességét vizsgálva megfigyelték a szabad coelomasejtek proliferációs képességének növekedését ismételt antigénstimulust (arzénsav- 12
humán szérum albumin konjugátum) követően (Bilej és mtsai, 1992). Egy másik kísérletsorozat adatai szerint sejtizolálást követően áramlási citometria segítségével sikerült proliferáló coelomasejteket azonosítani Dendrobaena veneta giliszták coelomafolyadékában is (Homa és mtsai, 2008). 2.5. Humorális faktorok szerepe a giliszták immunválaszában A coelomasejtek a sejtes immunfolyamatok mellett a humorális folyamatokban is részt vesznek hemolítikus és antimikrobiális faktorok termelése révén (Bilej és mtsai, 2000; Cooper és mtsai, 2002). A coelomafolyadék fontos alkotóeleme a giliszták veleszületett immunválaszának, egyes szerzők szerint antigénkötő fehérjéket is tartalmazhat (Bilej és mtsai, 2000). A fetidin/lysenin fehérjecsalád a coelomafolyadék egyik központi összetevője. Az E. fetidában leírt fetidinek polimorf lipoproteinek, melyek antibakteriális és hemolítikus tulajdonságokkal rendelkeznek (Cooper és mtsai, 2002; Lasségues és mtsai, 1997), valamint a testfolyadék alvadási folyamatában (koaguláció) is részt vesznek. Korábbi vizsgálatok azt sugallják, hogy normál körülmények között a fetidinek a giliszták külső felszínén fordulnak elő, elkeveredve az állat teljes testfelszínét bevonó nyákkal, így egy nem specifikus barriert képeznek a környezet mikroorganizmusai számára (Cooper és mtsai, 2002). A fetidinek termelésében két független gén vesz részt. Vörösvértesteket célsejtekként használva két monomer fetidint azonosítottak, az egyik 40 kda, a másik 45 kda molekulatömegű. A klónozott 40 kda tömegű fetidin szekvenciája tartalmaz egy peroxidáz motívumot, ami a faktor peroxidáz aktivitásáért felelős (Lasségues és mtsai, 1997). A rekombináns protein gátolta a Bacillus megaterium növekedését (Cooper és mtsai, 2002). Az E. fetida fajból izolált lysenin a fetidinekhez hasonló tulajdonságokkal rendelkezik. Ez a fehérje a sejtmembrán szfingomielin komponenseihez kötődik (Shogomori és Kobayashi, 2008), kísérletes körülmények között patkány simaizom kontraháló hatását is leírták (Sekizawa és mtsai, 1996a, Sekizawa és mtsai, 1997). Más lítikus faktorokhoz hasonló hemolítikus funkciójáról is beszámoltak (Cooper és mtsai, 2002). Gilisztaszövetekből származó RNS-sel végzett Northern blot analízis, illetve in situ 13
hibridizáció alapján valószínűsítették, hogy a lysenint nem a coelomaüregben, hanem a bélfalban található chloragogén sejtek termelik (Ohta és mtsai, 2000; Sekizawa és mtsai, 1996b). Ismertek a coelomafolyadékban előforduló, lyseninnel rokon fehérjék (lysenin related peptid 2 és a lysenin related peptid 3). Ezek képződési helye és pontos funkciója azonban még nem ismert. A lyseninnek és rokon vegyületeinek szerepe lehet a fizikai sérülést követően a giliszták coelomaüregébe kerülő kórokozók elleni védelemben (Cooper és mtsai, 2002; Kobayashi és mtsai, 2004; Bruhn és mtsai, 2006). A fetidin/lysenin proteincsalád tagjainak expresszióját befolyásoló mikrobiális hatások korábbi vizsgálatai alapján a fetidin in vitro bakteriális kezeléssel indukálható (Lasségues és mtsai, 1989). Későbbi in vivo E. coli és B. subtilis törzseket alkalmazó vizsgálatok nem igazoltak kimutatható fetidin mrns szint emelkedést a coelomasejtek esetében, bár a coelomafolyadék összproteintartalma megnövekedett (Köhlerova és mtsai, 2004). Az előző kísérleteket kiegészítve, csökkent lysenin expressziót figyeltek meg E. coli O157:H7 törzzsel való kezelés után (Wang és mtsai, 2010). A lysenin expresszióját azonban a giliszták normál talajból kísérleti talajba történő áthelyezése is befolyásolhatja (Brulle mtsai, 2011). A hemolítikus faktorok kötődését a célsejtek membránjához ceramidrészből (például szfingomielinből) és hidrofil csoportból (foszforilkolin, galaktozil) felépülő szfingolipidek jelenléte teszi lehetővé. Felismerték, hogy a koleszterin fokozza a lítikus aktivitást a szfingomielin tartalmú lipid vezikulákkal szemben. A leghatékonyabb lízist akkor figyelték meg, amikor a vezikulák az emberi vörösvértestek felszíni lipid komponenseit modellezték (Cooper és mtsai, 2002; Lange és mtsai, 1999). Preparatív PAGE módszerrel sikerült izolálni az SDS-ben stabil H1 és H2 agglutinint, valamint egy két egységre hasadó (18 kda és 21 kda méretű) H3 agglutinint. A H1 és H2 agglutininek 56 o C hőmérsékleten elvesztik hemolítikus aktivitásukat, azonban a H3 protein agglutinációs hatása továbbra is megfigyelhető. Monospecifikus antiszérumokkal, ezekből származó ellenanyagokkal, valamint szénhidrátokkal gátolva az agglutininek biológiai hatásait kiderült, hogy mindhárom faktor hasonló szerkezettel rendelkezik (Cooper és mtsai, 2002). A közelmúltban vált ismertté egy coelomasejtek által expresszált és a colomafolyadékban is előforduló, 42 kda molekulatömegű protein, az ún. coeloma 14
citolítikus faktor (CCF). A CCF a mintázatfelismerő receptorok közé sorolható, szekvenciája az atlanti tőrfarkú rák (Limulus polyphenus) koagulációs faktor G molekulájával, és a selyemlepke (Bombyx mori) Gram-negatív baktériumkötő proteinjével mutat rokonságot (Cooper és mtsai 2002). Ez a különleges fehérje képes az élesztők és a Gram-negatív baktériumok sejtfalának béta-1,3-glükán-, N,N-diacetil-ketobióz-, a lipopoliszacharid O-antigén, illetve a Gram-pozítiv baktériumok muramil-dipeptid komponenseihez is kapcsolódni. Ezek felismerése egy szerin-proteáz rendszer, az ún. profenol-oxidáz kaszkád aktiválódásához vezet (Bilej és mtsai, 2001). Számos tanulmány rámutat, hogy a profenol-oxidáz rendszer kulcsszereplője a gerinctelen állatok immunrendszerének (Beschin és mtsai, 1998, 1999; Bilej és mtsai, 1998, 2001, 2006; Bloc és mtsai, 2002; Cerenius és mtsai, 2008). A profenol-oxidáz rendszer mediálja a sejtlízis és az opszonizáció folyamatát, valamint antimikrobiális anyagok felszabadulását, tehát a CCF molekulának az opszonizációban is szerepe van, ami a fagocitózis folyamatát megelőző esemény (Bilej és mtsai, 1995). A L. rubellus gilisztafajból azonosított, konstitutívan termelődő lumbricin I Grampozitív és Gram-negatív baktériumokkal szemben antimikrobiális hatással rendelkezik, azonban emberi vörösvértestekkel szemben nincs hemolítikus aktivitása. Prolinban gazdag fehérje, szekvenciája hasonlít a korábban felfedezett antimikrobiális peptidek szerkezetére, például az ízeltlábú fajokban leírt drosocinra és a PR39-re (Cooper és mtsai, 2002). A fetidin szekvenciája jelentős homológiát mutat a lysenin 1, lysenin 2 és lysenin 3 molekulákkal, de nincs számottevő homológiája a CCF és lumbricin I faktorokkal (Cooper és mtsai 2002). Szerin-proteázok közé tartozó enzimeket is azonosítottak E. fetida (Roch és mtsai, 1991) és L. terrestris (Kauschke és mtsai, 1997; Leipner és mtsai, 1993) fajokban. Affinitás kromatográfiát alkalmazva sikerült tisztítani egy 14 kda méretű szerin-proteáz inhibítor monomert, aminek aminosavsorrendjében a növényi szerin-proteáz inhibítorok szerkezetével nagyfokú hasonlóságot mutató hidrofób rész is előfordul. Feltételezések szerint a szerin-proteáz enzimek szabályozó mechanizmusai kapcsolhatják össze a giliszták sejtes és humorális immunválaszának komponenseit (Cooper és mtsai, 2002). Rovarok hemolimfáját vizsgálva kiderült, hogy extracelluláris szerin-proteáz inhibítorok képesek gátolni intracelluláris proteolítikus enzimek aktivitását (Polanowski és mtsa, 1996). 15
3. CÉLKITŰZÉSEK A bevezetésben jeleztük, hogy fontos tisztázni a kalcium szerepét a giliszta immunrendszer működésében és az immunsejtek aktivációjában. Részleteiben nem ismert, hogy a coelomasejtek osztódásra képes sejtek-e vagy végállapotú differenciálódott sejtek illetve hogy a mitogének vagy ionofórok képesek-e bármilyen módon befolyásolni a giliszta immunsejtek kalciumszintjét. A gilisztafajok immunsejtjein végzett kísérleteinket az alábbi célokkal kezdtük meg: 1. A giliszta coelomasejt alcsoportok nyugalmi intracelluláris kalciumszintjének meghatározása. 2. Ionofórok (ionomycin), valamint mitogének (növényi lektinek és lipopoliszacharid) kalciumion-mobilizáló hatásának vizsgálata. 3. Többféle mitogénstimulust és nyugalmi (regenerációs) periódust alkalmazva a giliszták coelomaüregében in vivo osztódási fázisban lévő immunsejtek arányának tanulmányozása. A lysenin fehérjecsalád tagjai feltehetőleg fontos szerepet töltenek be a giliszták immunválaszában. Ezen fehérje termelődési helye és immunválaszban betöltött szerepe részleteiben még nem tisztázott. További kísérleteinkben a PTE KK Immunológiai és Biotechnológiai Intézetében létrehozott anti-lysenin monoklonális ellenanyagot használva céljaink között szerepelt: 4. A lysenin sejtes és szöveti lokalizációjának térképezése. 5. A szabad coelomasejtek baktérium expozíciót követő lysenin expressziós változásainak nyomon követése. 16
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Vegyszerek Fitohemagglutininból (PHA-P, Sigma, L1668, St. Louis, MO, USA), lipopoliszacharidból (LPS, Sigma, L6529), concanavalin A-ból (ConA, Sigma, C0412) és Phytolacca americana lektinből (PWM, Sigma, L8777) 1 mg/ml koncentrációjú törzsoldatokat készítettünk LBSS (összetétel ld. 4.2. pont) felhasználásával. Formilmetionil-leucil-fenilalaninból (fmlp, Orpegen Pharma, Heidelberg, Németország) 1 mm koncentrációjú oldatot készítettünk. Abszolút alkoholban 1 mg/ml koncentrációban ionomycint, dimetil-szulfoxidban (DMSO, Sigma, D8418) pedig forbol 12-mirisztát 13- acetátot (PMA, Sigma, P8319) oldottunk fel ugyanilyen koncentrációban. 1 mg/ml Fluo-3 AM (Invitrogen Molecular Probes, F-1242, Eugene, OR, USA) törzsoldatot 15% pluronsav F-127 (Sigma, P2443) tartalmú DMSO-val állítottunk elő, 1 mm koncentrációjú thapsigargint (Sigma, T9033) pedig DMSO-ban oldottunk. Mindegyik reagenst -20 o C hőmérsékleten tároltuk. Az immunizáláshoz a lysenin (PeptaNova GmbH, Sandhausen, Németország) fehérjét 1 mg/ml koncentrációban desztillált vízben oldottuk fel. 4.2. Coelomasejtek izolálása Kísérleteinkhez Eisenia fetida és Allolobophora caliginosa gilisztafajokat használtunk. A kísérletek megkezdése előtt a gilisztákat 2 napig nedves törlőkendőn tartottuk, béltartalmuk ezalatt kiürült. Az állatokat 3-4 ml izoláló puffert (71,2 mm NaCl; 5 mm EGTA; 50,4 mm guaiacol-glyceryl-éter; 5 v/v % etanol; ph 7,3) tartalmazó Petricsészébe helyeztük. Az állatok coelomasejteket tartalmazó coelomafolyadékot bocsátottak ki a testüregükből, amit összegyűjtöttünk, majd kétszeres térfogatra higítottunk LBSS pufferrel (71,5 mm NaCl; 4,8 mm KCl; 4,2 mm NaHCO 3; 1,1 mm MgSO 4 *7 H 2 O; 0,4 mm KH 2 PO 4; 0,3 mm NaH 2 PO 4; ph 7,3). Az összegyűjtött sejteket kétszer mostuk LBSS- 17
ben (1000 rpm, 5 perc, szobahőmérsékleten). Az élő sejtek számát tripánkék festéssel határoztuk meg. 4.3. A sejtek feltöltése Ca 2+ -szenzitív fluoreszcens indikátorral Az izolált coelomasejteket 1% Fluo-3 AM tartalmú DMEM tápoldatban (Sigma) vagy Ca 2+ -mentes PBS-ben vettük fel 10 7 sejt/ml koncentrációban. A mintákat tartalmazó centrifugacsöveket 30 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk (Boldizsár és mtsai, 2002; Minta és mtsai, 1989). A csöveket 10 ml DMEM-mel, vagy Ca 2+ -mentes PBS pufferrel töltöttük fel, majd további 30 perc inkubáció következett szobahőmérsékleten. A mintákat 5 percig centrifugáltuk 1000 rpm-mel, majd DMEM vagy PBS hozzáadásával 10 6 sejt/ml állítottuk be a minták koncentrációját. A fluoreszcens jel intenzitását áramlási citometriával az FL-1 csatornában detektáltuk. A sejtszuszpenziók alap Ca 2+ -szintjét BD FACSCalibur áramlási citométerrel 50 másodpercig mértük, majd különböző kezeléseket (ionofór, eltérő koncentrációjú mitogén vagy kemoattraktáns stimulust) alkalmaztunk. Annak igazolására, hogy az FL1 csatornában megfigyelt jel az élő coelomasejtektől származott, 1 µg/ml propidium-jodidiot adtunk a mintákhoz a mérések megkezdése előtt. Az eredmények értékelése során a PI negatív, élő coelomasejtek adatait használtuk fel. A kontroll kísérletekben megfelelő koncentrációjú abszolút etanolt, illetve DMSO-t adtunk a sejtekhez. Az áramlási citometriával kapott adatokat CellQuest és FCS Express (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA), valamint FlowJo 7.5 (Tree Star Inc., Ashland, OR, USA) programok segítségével analizáltuk. 4.4 Coelomasejtek stimulálása, proliferációjuk vizsgálata PI festéssel Ismételt sejtizolálások valamint mitogénstimulusok coelomasejt proliferációt befolyásoló hatásának tanulmányozásakor a gilisztákat egy éjszakán át nedves törlőkendőn tartottuk, majd hármasával kísérleti csoportokba osztottuk őket. 18
Az ismételt sejtizolálások hatásának vizsgálatakor az első coelomasejt izolálást még további három követte. Az izolálások között a gilisztákat talajba helyeztük regenerálódni. Az első és a második sejtizolálás között 1 nap, a második és harmadik izolálás között 3 nap, a végül a harmadik és negyedik izolálás között 7 nap regenerációs időt alkalmaztunk. Mitogén stimulus hatását tanulmányozva a coelomasejt izolálást követően az állatokat 5-5 ml LBSS-t tartalmazó Petri-csészébe helyeztük egy éjszakára, amit különböző koncentrációjú mitogénekkel (LPS, PHA, ConA, vagy PWM) egészítettünk ki. Kontrollként LBSS-ben tartott gilisztákat használtunk. Másnap a stimulus rövid távú hatásának ellenőrzésére a kísérleti csoportokból újra sejtizolálást végeztünk. A stimulusok hosszabb távú hatásának felderítéséért az állatokat a mitogénstimulációt követően talajba helyeztük három napig regenerálódni, ezt követően az állatokat ismét nedves törlőkendőre kerültek egy éjszakára, amit sejtizolálás követett. Többszörös stimuláció során a gilisztákból sejteket izoláltunk, éjszakán át stimuláltuk őket mitogénekkel, majd 13 napra talajba kerültek regenerálódni. Ezt követően pedig egy éjszakát nedves törlőkendőn töltöttek az állatok, majd megismételtük a csoportokon korábban is alkalmazott stimulusokat. Ezek után az állatok két napra ismét talajba kerültek, majd végül sejtizolálás következett. Az izolálást követő mosási lépések és tripánkék festékkizárás után az LBSS-ben felvett coelomasejteket egyenlő térfogatokra osztva FACS-csövekben vettük fel. A centrifugálást követően a sejteket mostuk ACD pufferben (4,8 g/l citromsav; 13,2 g/l nátrium-citrát; 14,7 g/l dextróz; ph 5,0). További lépésben PI jelölőpufferben (10 mm Tris base;10 mm NaCl; 0,1 ml/100 ml Nonidet P-40; ph 8,0), illetve 1 μl RNáz-A-t és 10 μg/ml PI-t is tartalmazó PI jelölőpufferben reszuszpendáltuk a sejteket (Homa és mtsai, 2008). A mintákat 4 o C hőmérsékleten 30 percen keresztül fénytől védve inkubáltuk, majd áramlási citométerrel mértük. 4.5. Ca 2+ -ATPáz enzim citokémia Sejtizolálást követően a coelomasejteket Cytospin 3 készülékkel (Shandon, Thermo Labsystems, Waltham, MA, USA) tárgylemezre ülepítettük. A lemezeket ezt követően 20 19
percen át 37 o C hőmérsékleten inkubáltuk 3mM ATP-t és 0,18 % kalcium-kloridot tartalmazó Na-barbitál pufferben (ph 9,4), majd 0,1% kalcium-kloriddal, 2% kobaltkloriddal és 0,5% ammónium-szulfiddal kezeltük. Az inkubációs idő letelte után Mayer-féle hematoxilinnal (Reanal, Budapest) kontrasztosítottuk a sejteket. Az enzimreakció terméke fekete csapadékként jelent meg a pozitív jelet adó sejtekben. A preparátumokat Nikon Eclipse 80i mikroszkóppal tanulmányoztuk (Auroscience Kft., Budapest), az értékeléshez a SPOT szoftvercsomagot használtuk (Diagnostic Instruments Inc., Sterling Heights, MI, USA). 4.6. Monoklonális anti-lysenin ellenanyag létrehozása Desztillált vízzel 1 mg/ml koncentrációjú lysenin (PeptaNova, Sandhausen, Németország) törzsoldatot készítettünk. Nőstény 8 hetes BALB/c egerekbe 10 µg lysenint (komplett Freund adjuvánsban) (CFA, Sigma Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) injektáltunk, amit két további, inkomplett Freund adjuvánssal végrehajtott intraperitoneális injekció követett három hetes intervallumokban. Végül az antitest titer és izotípus alapján kiválasztott egerek egy további injekciót is kaptak 3 nappal a tervezett splenocyta/myeloma sejtfúziót megelőzően. A hibridóma sejtekkel a korábban ismertetett módon dolgoztunk (Köhler és Milstein, 1975; Engelmann és mtsai, 2005). A hibridóma felülúszókat indirekt ELISA módszer segítségével teszteltük lysenin és coelomasejt-lizátum antigénekkel, valamint BSA kontroll (Sigma) felhasználásával. 4.7. Giliszta coelomasejtek immuncitokémiai vizsgálata A coelomasejtekből (5*10 5 sejt/ml LBSS pufferben) 80-80 µl térfogatot tárgylemezekre vittünk fel Cytospin 3 készülék (Shandon, ThermoScientific, Waltham, MA, USA) segítségével. A mintákat jéghideg acetonnal fixáltuk, majd a sejtek endogén peroxidáz aktivitását 1 mg/ml fenil-hidrazin-hidrokloriddal blokkoltuk. 20
A tárgylemezeket ezután 5 %-os BSA oldatban inkubáltuk 20 percig a nemspecifikus kötődés kiküszöbölése céljából, majd lysenin ellen termeltetett hibridóma felülúszókkal (a-efcc5) vagy Protein G sepharose oszlopon (GE Healthcare, München, Németország) tisztított IgG frakciókkal jelöltük a coelomasejteket szobahőmérsékleten, 60 percig. A következő lépésben HRP-konjugált anti-egér IgG másodlagos ellenanyagot használtunk (1:100, Dakopatts, Glostrup, Dánia). Kettős immunfluoreszcens jelölés során egérben termeltetett monoklonális a- EFCC5 IgG frakciókat (1:100) mutattunk ki a másodlagos ellenanyagként használt NL557 konjugált szamár anti-egér immunglobulinnal (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Ezután FITC konjugált a-efcc1, a-efcc2, a-efcc3 vagy a-efcc4 monoklonális ellenanyagot alkalmaztunk (1:100). Másik kísérleti elrendezésünkben egér monoklonális a-efcc1-4 IgG frakciókat (1:100) detektáltunk a mintákon, NL557 konjugált szamár anti-egér immunglobulinnal (R&D Systems, Minneapolis. MN, USA), majd a lyseninre specifikus, FITC konjugált monoklonális a-efcc5 ellenanyagot használtuk (1:100). Pozitív kontrollként nyúl poliklonális anti-lysenin ellenanyagot (1:100; PeptaNova) használtunk, amit második lépésben NL557 konjugált anti-nyúl immunglobulinnal (R&D Systems) jelöltünk. A negatív kontroll mintákat normál egér szérummal inkubáltuk, majd a megfelelő másodlagos ellenanyagot használtuk. Az immuncitokémiai reakciókat acetátpufferben (ph 5,0) felvett 3-amino-9-etil karbazollal (Sigma) tettük láthatóvá. Magfestésre Mayer-féle hematoxilint (Reanal, Budapest, Magyarország), az immunfluoreszcens jelölések esetében DAPI-t (Invitrogen Molecular Probes, Eugene, OR, USA) használtunk. A lemezeket Olympus BX61 mikroszkóppal és AnalySIS programmal (Olympus, Hamburg, Németország) értékeltük. 21
4.8. Immunhisztokémiai és immunfluoreszcens vizsgálatok giliszta szöveteken A gilisztákat boncoltuk, az így nyert szövetmintákat Zamboni-féle fixáló oldatba helyeztük (2% paraformaldehid; 15% pikrinsav; 0,1 M nátrium-foszfát puffer; ph 7,3; Zamboni és DeMartino, 1967), majd 30% szukrózba ágyaztuk. A mintákból 1% zselatinnal bevont tárgylemezekre 8-10 μm vastag metszeteket készítettünk kriosztáttal. A lemezekkel immunhisztokémiai vagy immunfluoreszcens módszerekkel vizsgáltuk. A szöveteken történő kivitelezés (antitestek, hígitás, inkubációs idő) hasonlóan történt, mint az immuncitokémiai vizsgálatoknál (ld. 4.7. alfejezet). Az egyes lépések között a mintákat 0,1% Triton-X 100 tartalmú PBS-ben mostuk. Az immunfluoreszcens vizsgálatok esetében az autofluoreszcencia csökkentése érdekében 15 percig 0,05 M ammónium-kloriddal inkubáltuk a mintákat. A metszeteket Olympus BX61 mikroszkóppal és AnalySIS programmal elemeztük. 4.9. In vitro baktérium kezelés vizsgálata Izolált giliszta coelomasejteket 6 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk hővel inaktivált Staphylococcus aureus (OKI II2001) vagy Escherichia coli (ATCC 25922) baktériumokkal. A coelomasejteket (10 6 ) a baktériumokkal (10 7 ) 1 ml térfogatban kevertük össze 12*75 mm-es Eppendorf csövekben (Falcon, BD Labware). A fagocitózist követően a mintákat LBSS-ben mostuk (Engelmann és mtsai, 2005). A felülúszót -80 o C-on tároltuk a további vizsgálatokig, az üledékből coelomasejt-lizátumot készítettünk. 4.10. Coelomasejt-lizátum készítése A coelomasejteket proteáz inhibítor keverékkel (Sigma) kiegészített RIPA pufferrel (50 mm TRIS/HCl, ph 8,0; 150 mm NaCl; 1 v/v % NP-40; 0,5 w/v % Na- deoxicholat; 5 mm EDTA; 0,1 % SDS) lizáltuk jégen 15 percig, majd 4 o C-on centrifugáltuk 15 percig, 13000 rpm-mel. A coelomasejt-lizátumok és a felülúszók fehérjetartalmát BCA kit-tel határoztuk meg (Pierce, Rockford, IL, USA), immunreaktivitásukat ELISA és Western blot módszerekkel vizsgáltuk. 22
4.11. Indirekt ELISA-vizsgálat anti-efcc5 ellenanyaggal Mikrotiter lemezeket (Nunc, Microelisa, Roskilde, Dánia) coelomasejt-lizátummal vagy 5 µg/ml lyseninnel érzékenyítettük éjszakán át 4 o C-on. A nem-specifikus kötőhelyeket 0,5% zselatinnal blokkoltuk 30 percen keresztül, 37 o C-on. A lemezeket a-efcc5 felülúszóval inkubáltuk 37 o C-on, 60 percig. A mosási lépések után a lemezre a HRP-konjugált kecske anti-egér IgG ellenanyag került (Dakopatts) 37 o C-on, 60 percre. Az a-efcc5 monoklonális ellenanyag izotípusát indirekt ELISA módszerrel határoztuk meg egér monoklonális ellenanyag izotípus meghatározó kittel a gyártó leírása alapján (Sigma). A színreakciót ortofenilén-diaminnal hívtuk elő, majd 4 M kénsavval állítottuk le. Az egyes lépések között a lemezeket 0,05 % Tween 20 (Sigma) tartalmú PBS-sel mostuk. A színreakció erősségét 490 nanométeren detektáltuk Dynatech ELISA reader segítségével. 4.12. Szendvics ELISA a-efcc5 ellenanyag alkalmazásával Mikrotiter lemezeket (Nunc) poliklonális anti-lysenin ellenanyaggal (1:1000, PeptaNova) érzékenyítettük 4 o C-on, éjszakán át. A nem-specifikus kötőhelyeket 0,5% zselatinnal gátoltuk 37 o C-on, 30 percen keresztül. Ezután standard görbe készítéséhez különböző lysenin koncentrációkat alkalmaztunk, 2 µg/ml és 50 µg/ml közötti tartományban. Kontroll vagy bakteriális stimulust kapott coelomasejtekből nyert felülúszókkal inkubáltuk a mikrotiter lemezeket 37 o C-on, 60 percig. Ezután a-efcc5 ellenanyagot (1:1000) adtunk a mintákhoz és a további lépésekben fentebb leírt ELISA protokolt követtük (ld. indirekt ELISA-vizsgálat anti-efcc5 ellenanyaggal). 4.13. SDS-poliakrilamid gél elektroforézis és Western blot A fehérjék elválasztásához 10% poliakrilamid gélt használtunk (Mini Protean 3, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Az elválasztás után a proteineket nitrocellulóz membránra 23
(Bio-Rad) blottoltuk 4 o C-on, 2 órán keresztül. A membránokat 60 percen át blokkoltuk 1% BSA/TBS-Tween (25 mm Tris; 150 mm NaCl; 0,05 % Tween; ph 7,5) alkalmazásával. Ezután a géleket 60 percig inkubáltuk monoklonális a-efcc5 ellenanyaggal (1:1000, 1% BSA/TBS-Tween), vagy nyúlból származó poliklonális anti-lysenin ellenanyaggal (1:1000, 1% BSA/TBS-Tween, PeptaNova). A következő lépésben HRP-konjugált anti-egér vagy anti-nyúl IgG (Dakopatts) ellenanyagot alkalmaztunk szobahőmérsékleten, 60 percig. A mosási lépésekhez TBS/ 0,05% Tween (Sigma) puffert alkalmaztunk, a reakciók előhívása pedig ECL reagenssel történt (Pierce). Töltés-kontrollként egér anti-α-tubulin ellenanyagot (1:1000, Sigma) használtunk, mellyel a stripping pufferes (Pierce) kezelés után inkubáltuk a membránokat. A kemilumineszcens jel detektálása Fuji LAS 4000 (Fuji, Japán) rendszerrel történt. 4.14. Áramlási citometria FITC konjugált a-efcc5 ellenanyaggal Az izolált coelomasejteket PBS pufferben mostuk, majd 4% paraformaldehiddel fixáltuk a sejteket (10 5 sejt/minta). A mosási lépések során 0,1 % nátrium-azidot tartalmazó PBS-t, majd permeabilizáló puffert (0,1% nátrium-azidot és 0,1% szaponint tartalmazó PBS) használtunk. Permeabilizáló pufferben felvett FITC konjugált a-efcc5 ellenanyagot adtunk a mintákhoz, amit 30 perc inkubáció követett 4 o C-on. A mintákat kétszer mostuk szaponintartalmú permeabilizáló pufferben, majd egyszer BSA-t és nátrium azidot tartalmazó PBS pufferben. Végül a mintákat 0,5% paraformaldehiddel kiegészített PBS pufferben fixáltuk. FACSCalibur áramlási citométerrel (BD Biosciences, San Diego CA, USA) mértük a minták fluoreszcencia intenzitását az FL1 csatornában, a kapott adatok értékelésére CellQuest (BD Bioscience, San Diego, CA, USA) és FCS Express programokat (De Novo Software, Los Angeles, CA, USA) használtuk. 24
4.15. Az eredmények értékelése és statisztikai elemzése A statisztikai elemzés céljára Microcal Origin (Microcal Software Inc., Northhampton, MA, USA) programot alkalmaztuk. Az eredmények ábrázolásakor az átlagokat és a standard hibasávokat tüntettük fel. A kezelések hatásainak elemzését Student-féle (kétmintás, egyenlő varianciájú) t-teszttel, illetve három, vagy több értéksor összehasonlítása esetén ANOVA és post-hoc analízis segítségével végeztük. A p<0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. 25
5. EREDMÉNYEK 5.1. Az E. fetida és A. caliginosa fajokból származó coelomasejt alcsoportok nyugalmi kalciumszintje A giliszta immunitásának sokrétű feladatait a coelomasejtek eltérő alcsoportjai látják el (Vetvicka és Sima, 2009). Az E. fetida és A. caliginosa fajok coelomafolyadékában szabadon előforduló coelomasejtek korábban leírt alpopulációit a vizsgálatok során fizikai tulajdonságaik; nagyság és granularitás alapján különítettük el (1.A és B ábra). Az intracelluláris kalciumszintet egy áramlási citometrián alapuló módszerrel határoztuk meg, a Fluo3-AM fluoreszcens festék jelintenzitása korrelál a sejtek szabad kalciumszintjével. Szignifikáns eltérést figyeltünk meg a coelomasejt-alcsoportok nyugalmi Ca 2+ -szintje között, az E. fetida chloragocyta populációja magasabb kalciumszinttel rendelkezik, mint a granulált és hyalin coelomasejtek populációi (1. C ábra). Megfigyeléseink szerint az A. caliginosa faj coelomasejt és chloragocyta alcsoportjai hasonló Ca 2+ -szinttel rendelkeznek, mint az E. fetida faj megfelelő populációi (1. C ábra). 1. ábra. Az E. fetida és A. caliginosa giliszták immunsejt-alcsoportjainak intracelluláris kalciumszintjei. Az ábrán jelölt chloragocyta és coelomocyta sejtpopulációk mellett a minták előkészítése során a sejtekből kiszabadult granulumok láthatóak. 26
5.2. Ionofór kezelés hatása coelomasejt alcsoportok kalciumszintjére Coelomasejt izolálást követően a sejteket 1,8 mm CaCl 2 tartalmú DMEM médiumban töltöttük fel Fluo3-AM-mel. Az alap kalciumszint 50 másodpercig tartó mérése után 7 µm ionomycint adtunk a csövekhez. Az E. fetida sejtcsoportok közül a coelomocyta populáció nagymértékű, három-négyszeres Ca 2+ -szint emelkedést mutatott már néhány másodperccel az ionomycin hozzáadása után (2. ábra). A megemelkedett kalciumszint végig megfigyelhető volt a hét percen keresztül zajló mérés során. 2. ábra. Ionomycin kezelés jelentős kalcium szignál változást okoz E. fetida coelomasejtek esetében. A Fluo3-AM festékkel feltöltött coelomasejtek gyors, szignifikáns intracelluláris kalciumszint változással reagálnak a 7 µm koncentrációban alkalmazott ionomycin hatására. A dot-plot (2.A. ábra) a független vizsgálatok egy reprezentatív eredményét mutatja (átlag±sem; n=12; # p<0,001). 27
Az előző sejtcsoporttal ellentétben a chloragocyta/eleocyta populáció nem reagált az ionomycin kezelésre a Ca 2+ -szint emelkedésével (3. ábra). 3. ábra. Az E. fetida chloragocyta/eleocyta populációra nem volt detektálható hatással a 7 µm ionomycin stimuláció. Vizsgáltuk, hogy van-e kimutatható különbség a két gilisztafaj coelomocyta populációjának a kalciumjelében. Az ionomycin A. caliginosa coelomasejtekben is szignifikáns mértékű Ca 2+ -szint emelkedést váltott ki (p<0,05), de ez a változás kisebb mértékű volt, mint az azonos körülmények között kezelt E. fetida coelomasejtek esetében (4. ábra). Hasonlóan az E. fetida chloragocyta/eleocyta sejtekhez, az A. caliginosa alcsoport sem mutatott Ca 2+ -jel változást az ionomycin kezelés hatására (5. ábra). 28
4. ábra. Az ionomycin kezelés mérsékelt kalciumszint változáshoz vezet A. caliginosa coelomasejtekben (1.B. ábrán jelölt sejtpopuláció), ami elmarad az E. fetida coelomasejtek esetében 7 µm ionomycin stimulus után tapasztalható változástól. Az ábrázolt dot-plot (4.A. ábra) 10 független vizsgálat egy reprezentatív eredményét mutatja (átlag±sem; n=10; * p<0,05; p<0,01). 29
5. ábra. A. caliginosa chloragocyta/eleocyta sejtek (1. B. ábrán látható sejtpopuláció) nem reagáltak 7 µm ionomycin kezelésre Ca 2+ -influx változással. Az ábrázolt dot-plot (5. A. ábra) a független vizsgálatok egy reprezentatív eredményét mutatja. Ionomycin hatására a sejtmembrán és/vagy intracelluláris raktárak kalciumcsatornái is kinyílnak, ami a citoplazma Ca 2+ -szintjének megemelkedéséhez vezet. Kísérleteinkben a kalcium forrása ismeretlen volt, ezért a coelomasejteket Ca 2+ -mentes PBS-ben töltöttük fel Fluo3-AM-mel, majd áramlási citometriával vizsgáltuk az ionomycin hatását. Az E. fetida coelomasejt alpopuláció Ca 2+ -szintje magasabb lett a kezelést követően, de a változás elmaradt a Ca 2+ -tartalmú DMEM médiumban tartott sejteknél mért értéktől. A nyugalmi szinthez képest azonban szignifikánsan nőtt a citoplazma szabad kalciumion szintje (p<0,001), ami arra utal, hogy az ionomycin intracelluláris kalciumraktárak kiürülését is okozza (6. ábra). 30