QUANTA Lite TM ANA In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas

QUANTA Lite TM ANA 708750 In Vitro diagnosztikai alkalmazásra CLIA Bonyolultság: magas Javasolt alkalmazás QUANTA Lite TM ANA egy enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA) az anti-nuclearis antitestek (ANA) szemikvantitatív kimutatására humán szérumban. Az ANA jelenléte felhasználható a klinikai adatokkal és más laboratóriumi vizsgálatok eredményével együtt kiegészítő adatként a rheumatikus betegségek, mint például a szisztémás lupus erythematosus, Sjögren szindróma, scleroderma és a kevert kötőszöveti betegség diagnózisának felállítása során. A teszt együttesen detektálja, ugyanazon a mérőhelyen, az összes ANA-t, ami a chromatin (dsdna és hisztonok), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, centromer és PCNA ellen irányul, valamint a diagnosztikai jelentőségű cytoplasma antigének, mint a Jo-1, a mitochondrium (M-2) és a ribosomalis-p protein ellen irányuló ellenanyagokat. A HEp-2 sejteken kivitelezett hagyományos indirekt immunfluorescens antitest tesztben nem azonosított antigénekkel szemben pozitív savókat is lehet detektálni ezzel a módszerrel. A teszt összegzése és magyarázata Az ANA jelenléte az egyik döntő jele a szisztémás autoimmun betegségnek. 1-4 Tipikusan az ANA-t indirekt immunfluorescens eljárással (IFA) mutatják ki, szubsztrátként majomvese metszetek vagy HEp-2 sejtek használatával. 3 Az ANA pozitív szérumok további vizsgálatát enzimmel kapcsolt immunoszorbens assay (ELISA), Western blot vagy immunprecipitációs eljárások segítségével lehet elvégezni, az adott szérumban lévő specifikus ellenanyagok azonosítása érdekében. 1-4 Újabban a diagnosztikai szempontból jelentős antigének keverékét és HEp-2 sejt extraktumot együttesen használják az ELISA eljárásban ANA kimutatására. 5-9 Az ANA ELISA előnyei az IFA módszerrel szemben többek között a kivitelezés egyszerűsége, a vizsgáló személytől és az eszköztől függő torzítás elmaradása, szemikvantitatív eredmények, és végül, a biológiai okból téves pozitív reakciók kisebb száma. Az ELISA hátránya az IFA eljáráshoz viszonyítva többek között az ismeretlen sejtmag- és cytoplasma antigénekkel szembeni érzékenység hiánya és az, hogy elmarad az ANA mintázat leírása, amit az IFA eredményekkel együtt szoktak megadni. Az ismeretlen specifitású ANA diagnosztikai haszna azonban jelenleg még nem világos, mivel sok egészséges embert is ANA pozitívnak találtak ismeretlen specifitással, míg a diagnosztikailag jelentős autoantitestekre nézve negatívak voltak. 10-12 Ezen kívül, amint egy specifikus reaktivitást sikerül azonosítani a szérumban, az ANA mintázatnak a továbbiakban nincs olyan nagy diagnosztikai jelentősége. Így az ANA ELISA nyilvánvalóan igen jól használható a klinikai laboratóriumban. A módszer elve Erősen tisztított egyedi antigéneket és HEp-2 sejtmagok és nucleolusok kivonatát kötötték mikrotiter lemez mérőedénykéinek falához. Az antigének között van chromatin (dsdna és hisztonok), Sm/RNP, SS-A, SS-B, Scl-70, centromer, PCNA, Jo-1, mitochondrium (M-2) és ribosomalis-p protein, valamint extraktumok. Az anti-chromatin reaktivitásról nemrégiben kimutatták, hogy egyszerre korai és érzékeny markere az SLEnek. 13 Az előhígított kontrollokat és a hígított beteg-mintákat az egyes különálló mélyedésekbe töltjük, ahol a mintában esetleg jelen lévő ANA antitestek kikötődnek az edény falához rögzített antigénekhez. A nem kötődött mintát mosással eltávolítjuk, és minden egyes mélyedésbe enzimmel kapcsolt anti-humán IgG konjugátumot adunk. A második inkubáció lehetővé teszi az enzimmel jelzett anti-humán IgG számára, hogy a vizsgált mintából származó, az első inkubáció során lekötött antitesthez kapcsolódjon, ha volt ilyen. Miután az enzimmel jelölt anti-humán IgG felesleget mosással eltávolítottuk, a rögzítve maradt enzim aktivitását kromogén szubsztrát hozzáadásával és a kialakult szín intenzitásának mérésével határozzuk meg. A tesztet spektrofotometriás módszerrel lehet értékelni úgy, hogy a betegek mintáival kapott szín intenzitását lemérjük, és a kontrollokéhoz hasonlítjuk. Reagensek 1. Polisztirén mikrotiter ELISA lemez, sejtmag és cytoplasma antigénnel fedve (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel, szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba csomagolva. 2. ELISA Negatív Kontroll, 1 üveg puffer, tartósító anyagokat és humán szérumot tartalmaz, amelyben nincsenek humán sejtmag és cytoplasma antigén ellenes antitestek, előhígítva, 1.2mL 3. ANA ELISA Low Positive (alacsony titerű pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum sejtmag és cytoplasma antigén ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 4. ANA ELISA High Positive (magas titerű pozitív kontroll), 1 üveg puffer, benne tartósító anyagok és humán szérum sejtmag és cytoplasma antigén ellenes antitestekkel, előhígítva, 1.2mL 5. ANA Minta Diluens, 1 üveg rózsaszínre festve, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel, Tween 20, protein stabilizátorok és tartósító anyagok, 50mL 6. HRP mosó koncentrátum, 1 üveg 40x-es koncentrátum pirosra színezett, tartalma: konyhasó TRIS pufferrel és Tween 20, 25mL. A hígítási javaslatok a Módszer szakaszban találhatók. 7. HS HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG, 1 üveg bíborszínűre színezett, puffert, protein stabilizátorokat és tartósító anyagokat tartalmaz, 10mL 8. TMB Kromogén, 1 üveg, stabilizátorokat tartalmaz, 10mL 9. HRP Stop (leállító) Oldat, 0.344M kénsav, 1 üveg színtelen, 10mL Veszélyforrások 1. FIGYELEM: Ez a termék olyan kémiai anyagot (0.02% chloramphenicol) tartalmaz a mintahígítóban, kontrollokban és a konjugátumban, amelyet California államban rákkeltőként tartanak nyilván. 1

2. Az összes humán eredetű anyagot, amelyeket a kontrollok előállítása során felhasználtak ehhez a termékhez, ellenőrizték és negatívnak találták HIV, HBsAg, és HCV ellenes antitestekre nézve az FDA által jóváhagyott módszerekkel. Semmilyen teszt módszer nem tud azonban tökéletes biztonságot nyújtani arra nézve, hogy a termék mentes HIV, HBV, HCV vírusoktól, vagy más fertőző ágensektől. Éppen ezért, az ANA ELISA Low Positive és az ANA ELISA High Positive, valamint az ELISA Negatív Kontroll potenciálisan fertőző anyagként kezelendő. 14 3. Nátrium azidot alkalmaztak az oldatok stabilizálására. A nátrium azid méreg, és lenyelve, vagy szemen, bőrön keresztül felszívódva toxikus lehet. A nátrium azid ezen kívül ólom vagy réztartalmú vízvezeték csövekkel reakcióba léphet, robbanásveszélyes fém-azid komplexet képezve. Ha a reagensek maradványait a vízvezeték rendszeren keresztül távolítja el, öblítse a medencét nagy mennyiségű vízzel az azid lerakódás megakadályozása céljából. 4. A HRP konjugátum egy híg mérgező/korrozív vegyszert tartalmaz, ami nagy mennyiségben elfogyasztva toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 5. A TMB Kromogén irritáló anyagot tartalmaz, ami belélegezve, lenyelve, vagy a bőrön keresztül felszívódva veszélyes lehet. A sérülések megelőzése érdekében kerülje az anyag belélegzését, elfogyasztását illetve a bőrre, szembe jutását. 6. A HRP Stop oldat hígított kénsav oldat. Ne tegye ki bázisok, fémek vagy más olyan anyagok hatásának, amelyek savakkal reakcióba lépnek. A kénsav mérgező és maró anyag, lenyelve toxikus lehet. Az esetleges vegyi égési sérülés megelőzése érdekében vigyázzon, hogy az anyag bőrre, szembe ne kerülhessen. 7. Használjon megfelelő személyi védőeszközöket a kitben található reagensekkel végzett műveletek során. 8. A kicsöppenő reagenseket azonnal fel kell takarítani. A hulladékok eltávolítása folyamán tartsa be az összes szövetségi, állami és helyi környezetvédelmi előírást. Az analitikai hibák megelőzését célzó figyelmeztetések 1. Ez a termék in vitro diagnosztikai alkalmazásra készült. 2. A rendszer egyes elemeinek helyettesítése más termékekkel az eredményeket meghamisíthatja. 3. Nem tökéletes vagy hatástalan mosás, és a folyadék elégtelen eltávolítása az ELISA csíkok edénykéiből nem megfelelő reprodukálhatóságot és/vagy magas hátteret okozhat. 4. Ennek a tesztnek az adaptációja automatikus mintakezelési rendszerek és más folyadék-kezelő eszközök használatához, teljes egészében vagy részleteiben, a teszt eredményeinek eltérését okozhatja attól, amit manuális módszerrel nyertek. Minden laboratóriumnak a saját felelőssége az általa alkalmazott automatizált rendszer validálása annak érdekében, hogy az eredmények elfogadható tartományon belül legyenek. 5. A teszt működését változatos tényezők befolyásolhatják. Ilyenek lehetnek a reagensek induló hőmérséklete, a környezeti hőmérséklet, a pipettázási technika pontossága és reprodukálhatósága, a mosás és a folyadék-maradványoknak az ELISA lemez edénykéiből történő eltávolításának az alapossága, az eredmények mérésére használt fotométer, és az assay kivitelezése során alkalmazott inkubációs idők tartama. Nagy gondot kell fordítani a következetességre annak érdekében, hogy a kapott eredmények megbízhatóak és reprodukálhatóak legyenek. 6. Javasoljuk, hogy a vizsgálat kivitelezése során szigorúan kövesse a protokollt. 7. A mikrotiter csíkokat és a szárító betéteket tartalmazó visszazárható tasakok tökéletlen lezárása az antigén degradációját és a teszt precizitásának romlását okozza. 8. A HRP konjugátumnak bizonyos idő-intervallumban két vagy több alkalommal történő használata ugyanabból az üvegből, elfogadhatatlanul alacsony abszorbancia értékeket eredményezhet. Fontos a HRP konjugátum kezelésére vonatkozó előírások pontos betartása az ilyen problémák megelőzése érdekében. 9. A HRP konjugátum kémiai szennyeződése következhet be az eszközök és műszerek nem megfelelő tisztítása miatt. Általánosan használt laboratóriumi vegyszerek, mint például a formalin, fehérítő szerek, alkohol vagy detergensek maradványai a HRP konjugátum lebomlását okozzák bizonyos idő után. Kémiai tisztítószerek vagy fertőtlenítő szerek használata után a készülékeket és eszközöket alaposan le kell öblíteni. Tárolási körülmények 1. A kit valamennyi reagensét tárolja 2-8 C között. Nem szabad fagyasztani a terméket. A reagensek az előírásoknak megfelelően kezelve és tárolva a feltüntetett lejárati időn belül stabilak. 2. A fel nem használt, antigénnel bevont mikrotiter csíkokat a szárítóbetéttel együtt biztonságosan vissza kell zárni a fóliatasakba, és 2-8 C között kell tárolni. 3. A hígított mosópuffer 2-8 C között tartva 1 hétig használható. A minta vétele és kezelése Ez az eljárás szérum minták vizsgálatára alkalmas. A vizsgálandó mintákhoz azidot vagy más tartósító anyagokat adni nem ajánlott, mert ezek torzíthatják az eredményeket. Mikrobiológiai szempontból szennyezett, hőkezelt, vagy látható csapadékot, szilárd részecskéket tartalmazó minta nem használható. Kerülje az erősen hemolizált vagy lipémiás minták használatát. Levétel után a szérumot az alvadéktól el kell választani. Az NCCLS Document H18-A2 a minták tárolására a következő körülményeket javasolja: 1) Ne tartsa a mintákat 8 óránál hosszabb ideig szobahőmérsékleten. 2) Ha a vizsgálat nem végezhető el 8 órán belül, tartsa a mintákat hűtve, 2-8 C között. 3) Ha a teszt nem végezhető el 48 órán belül, vagy a minták szállítására van szükség, fagyassza és tárolja a mintákat -20 C-on vagy ennél alacsonyabb hőmérsékleten. A fagyasztott mintákat a kiolvasztás után és vizsgálat előtt alaposan 2

fel kell keverni. A teszt kivitelezése A kitben rendelkezésre álló anyagok 1 ANA ELISA mikrotiter lemez, (12-1 x 8 mérőhely), tartókerettel 1 1.2mL ELISA Negatív Kontroll, előhígítva 1 1.2mL ANA ELISA Low Positive (alacsony titerű pozitív kontroll) előhígítva 1 1.2mL ANA ELISA High Positive (magas titerű pozitív kontroll) előhígítva 1 50mL ANA Minta Diluens 1 25mL HRP Wash (mosó) Koncentrátum, 40x es koncentráció 1 10mL HS HRP IgG Konjugátum, (kecske), anti-humán IgG 1 10mL TMB Kromogén 1 10mL HRP Stop Oldat, 0.344M Kénsav További szükséges anyagok a kiten kívül Mikropipetták 5, 100, 200-300, és 500µL beméréséhez Egyszer használatos mikropipetta-hegyek Tesztcsövek a betegek mintáinak hígításához, 4mL térfogattal Desztillált vagy ionmentesített víz 1L-es edény a HRP mosó koncentrátum hígításához Mikrotiter lemez leolvasó az OD mérésére 450nm-en (és 620nm-en a két hullámhosszon történő leolvasáshoz) Módszer Mielőtt hozzákezd: 1. Várjon, míg a minták és a reagensek elérik a szobahőmérsékletet (20-26 o C) és mindegyiket jól keverje meg. 2. Hígítsa a HRP mosó koncentrátumot 1:40 arányban, úgy, hogy a HRP mosó koncentrátumos üveg tartalmát 975 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez adja. Ha nem kerül a teljes lemez egyszerre feldolgozásra, kisebb mennyiséget is lehet hígítani: minden 16 felhasználandó mérőhely számára adjon 2 ml koncentrátumot 78 ml desztillált vagy ionmentesített vízhez. A hígított puffer egy hétig stabil 2 8 C között tartva. 3. Készítsen minden egyes beteg-mintából 1:41 arányú hígítást a következő módon: adjon 10µL mintát 400µL ANA minta diluenshez. NE HÍGÍTSA az ANA ELISA alacsony titerű pozitív kontrollt, az ANA ELISA magas titerű pozitív kontrollt, és az ELISA negatív kontrollt. A hígított mintákat 8 órán belül fel kell használni. Megjegyzés: Az ANA mintahígítóval 1:41 arányban hígított mintákat igény szerint közvetlenül a HEp-2-sejt szubsztrátra is fel lehet vinni az ANA pozitivitás megerősítése, és az ANA mintázat meghatározása céljából. A pozitív minták végpontig titrálhatók, a minták hígítására standard PBS puffer használatával. A 1:41-es aránytól eltérő kezdeti hígítás használhatósága ezzel a pufferrel nincs igazolva. 4. Az ANA antitestek jelenlétének vagy hiányának tapasztalati egységekben történő meghatározása céljából használjon mind a három kontroll teszteléséhez két-két mérőhelyet, és a betegek mintának lemérésére egy vagy két mérőhelyet. Javasoljuk a betegek mintáiból is a párhuzamos (duplikált) meghatározásokat. A módszer kivitelezése 1. VALAMENNYI REAGENSNEK EL KELL ÉRNIE A SZOBA HŐMÉRSÉKLETÉT (20-26 C) A VIZSGÁLAT MEGKEZDÉSE ELŐTT. Helyezze a szükséges számú mérőedénykét/csíkot a keretbe. A fel nem használt csíkokat haladéktalanul tegye vissza a szárítóbetétet tartalmazó fóliatasakba, és zárja vissza a tasakot biztonságosan, hogy a mérőhelyek minimális ideig legyenek kitéve a párásodás veszélyének. 2. Pipettázzon 100µL-t az előhígított ANA ELISA alacsony titerű pozitív kontrollból, az ANA ELISA magas titerű pozitív kontrollból, az ELISA negatív kontrollból, és a hígított beteg-mintákból a mérőedénykékbe. Fedje be a lemezeket, és inkubálja 30 percig szobahőmérsékleten, sima vízszintes felületen. Az inkubációs idő az utolsó minta bemérése után kezdődik. 3. Mosás: Gondosan szívja le minden egyes mérőedényke tartalmát. Adjon 200-300µL hígított HRP mosó puffert minden egyes mérőhelyhez, majd ezt is szivassa ki. Ismételje az eljárást még kétszer, így végezzen el összesen három mosást. Fordítsa a lemezt nyílásokkal lefelé, és egy nedvszívó felületen finoman ütögetve távolítsa el tökéletesen az utolsó mosás után visszamaradt nedvesség nyomait az edénykékből. Nagyon fontos, hogy az edénykék minden egyes mosási lépés után tökéletesen ki legyenek ürítve. A leszíváskor tartsa be a minta felvitelekor alkalmazott sorrendet. 4. Adjon 100μL HS HRP IgG Konjugátumot minden egyes mérőhelyhez. A konjugátumot az eredeti reagens üvegből aszeptikus körülmények között és a helyes laboratóriumi eljárásnak megfelelően kell kivenni. Csak annyi konjugátumot vegyen ki az üvegből, amennyire a teszt kivitelezéséhez szüksége van. A POTENCIÁLIS MIKROBIOLÓGIAI ÉS/VAGY KÉMIAI SZENNYEZŐDÉS ELKERÜLÉSE ÉRDEKÉBEN SOHA NE TÖLTSE VISSZA A FEL NEM HASZNÁLT KONJUGÁTUMOT AZ ÜVEGBE. Inkubálja a lemezt 30 percig, mint a 2-ik lépésben. 5. Mosás: Ismételje a 3 lépést. 6. Adjon 100µL TMB kromogént minden egyes edénykébe, és inkubálja sötét helyen 30 percig szobahőmérsékleten. 3

7. Adjon 100µL HRP Stop oldatot minden mérőhelyre. Tartsa be a HRP Stop oldat adagolása alkalmával ugyanazt a tempót és sorrendet, amit a TMB kromogén bemérésekor használt. Óvatosan ütögesse meg ujjával a lemez oldalát, az edénykék tartalmának alapos összekeverése céljából. 8. Olvassa le minden egyes mérőhely abszorbancia (OD) értékét a reakció leállítását követő egy órán belül, 450 nm-en. Ha bikromatikus leolvasást igényel, referencia hullámhossznak a 620nm használható. Minőség-ellenőrzés 1. Az ANA ELISA alacsony titerű kontroll, az ANA ELISA magas titerű kontroll és az ELISA negatív kontroll minden egyes beteg-minta sorozattal együtt kell fusson, hogy ellenőrizhető legyen, hogy az összes reagens és az eljárás végrehajtása is kifogástalan volt a teszt kivitelezése folyamán. 2. Ne feledje, hogy mivel az ANA ELISA alacsony titerű kontroll, az ANA ELISA magas titerű kontroll és az ELISA negatív kontroll előhígítva kerülnek forgalomba, ezek nem kontrollálják a minta hígításával kapcsolatos előkészítési folyamatot. 3. Kiegészítő kontrollok vizsgálata is végezhető a helyi, állami és/vagy szövetségi rendelkezések, vagy az akkreditációs testületek ajánlásainak vagy elvárásainak megfelelően. Alkalmas kiegészítő kontroll szérum készíthető kevert humán szérum minták szétosztásával, és < -20 C-on történő tárolásával. 4. Annak érdekében, hogy a teszt eredményeit érvényesnek tekinthessük, valamennyi, alább felsorolt kritériumnak teljesülnie kell. Ha ezek közül bármelyik nem teljesül, a tesztet érvénytelennek kell tekinteni, és az eljárást meg kell ismételni. a. Az előhígított ANA ELISA magas titerű kontroll abszorbanciája nagyobb kell, hogy legyen, mint az előhígított ANA ELISA alacsony titerű kontroll abszorbanciája, és ez nagyobb kell legyen, mint az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája. b. Az előhígított ANA ELISA magas titerű kontroll abszorbanciája 1.0-nél nagyobb kell legyen, míg az előhígított ELISA negatív kontroll abszorbanciája nem lehet nagyobb 0.15-nél. c. Az ANA ELISA alacsony titerű pozitív kontroll abszorbanciája több, mint kétszerese kell legyen az ELISA negatív kontroll abszorbanciájának, vagy legyen nagyobb, mint 0.15. d. Az ELISA negatív kontroll és az ANA ELISA magas titerű pozitív kontroll a reagensek minőségének lényeges eltérését kontrollálja. Az ANA ELISA magas titerű pozitív kontroll használata nem garantálja a precizitást a teszt küszöbértékének közelében. e. A megfelelő QC eljárásokra vonatkozó további információkat az NCCLS Document C24-A tartalmazza, ennek tanulmányozása ajánlott. Az eredmények kiszámítása Először határozza meg a párhuzamos minták OD értékeinek átlagát. Ezután minden egyes minta reaktivitása meghatározható olyan módon, hogy a minta OD átlagát elosztjuk az ANA ELISA alacsony titerű pozitív kontroll OD átlagával. A kapott eredményt szorozzuk a az ANA ELISA alacsony titerű pozitív kontrollt tartalmazó üveg címkéjén feltüntetett egység számértékével. Minta OD Minta eredménye = x ANA ELISA alacsony poz. Kontr. (egység) ANA ELISA alacsony titerű pozitív kontroll OD (egység) A reaktivitás és a mintában lévő antitestek mennyisége között nem-lineáris kapcsolat van. Miközben a beteg antitest koncentrációjának növekedése és csökkenése a reaktivitás ezzel összefüggő növekedésében és csökkenésében mutatkozik meg, a változás nem lesz arányos (azaz, például a koncentráció kétszeresére nő, de a reaktivitás nem lesz kétszeres). Ha a beteg antitest koncentrációjának ennél pontosabb meghatározására van szükség, a beteg mintájának sorozatos hígítását kell tesztelni, és azt az utolsó hígítást tekintjük a beteg antitest titer értékének, ami még a tesztben pozitív eredményt adott. Az eredmények értelmezése Az ELISA assay a kivitelezési technikára nagyon érzékeny módszer, és képes a beteg-populációk között lévő igen kis különbségek érzékelésére. Az alábbi adatok csak tájékoztatásra szolgálnak. Minden laboratóriumban meg kell határozni a saját referencia tartományokat, az aktuálisan használt technikával, kontrollokkal, eszközökkel, és a vizsgált beteg populációra jellemző módon, a helyi eljárási szabályoknak megfelelően. A minta besorolása lehet negatív, mérsékelten pozitív és erősen pozitív az alábbi táblázat szerint: Egység Negatív < 20 Mérsékelten pozitív 20 60 Erősen pozitív > 60 1. A pozitív eredmény arra utal, hogy a mintában ANA antitestek vannak, és felveti valamilyen rheumatikus betegség, mint például a szisztémás lupus erythematosus (SLE), Sjögren szindróma, scleroderma, és/vagy kevert kötőszöveti betegség lehetőségét. 2. A negatív eredmény arra utal, hogy a betegnek nincs olyan antitestje, amelyeket a teszt kimutat, vagy annak koncentrációja nem éri el a teszt kimutathatósági küszöbét. 3. Javasoljuk, hogy a laboratórium által kiadott értékelés tartalmazza az alábbi meállapítást: Az itt következő eredmény az INOVA QUANTA Lite TM ANA ELISA használatával keletkezett. Más gyártók tesztjével kapott ANA eredmények ettől eltérőek lehetnek, váltakozva nem használhatók. A közölt IgG érték nagyságrendje nem vethető össze egy végpont-titer értékkel. 4

A módszer korlátai 1. Immunkomplexek és más immunglobulin aggregátumok jelenléte a mintában a nem-specifikus kötődés mértékét növelheti, és a teszt téves pozitivitását okozhatja. 2. Nem minden kötőszöveti betegségben szenvedő páciens mintája pozitív anti-nucleáris antitestekre. 3. Ezeket az eredményeket a klinikai adatok és más szerológiai tesztek eredményével együtt kell értékelni. 4. Egy reaktív savó specificitása ezzel a teszttel nem határozható meg. A specifikus ellenanyagok azonosítása céljából további vizsgálatokra van szükség. 5. Az ANA ELISA alacsony titerű kontroll és az ANA ELISA magas titerű kontroll RNP pozitív savó felhasználásával készült. Ez az antigén a degradációra leginkább érzékeny antigének egyike. Így ezek a kontrollok érzékenyen jelzik ennek az antigénnek az integritását is. Az egyes laboratóriumok saját hatáskörben más kontrollokat is alkalmazhatnak, a különböző antigének szintjének ellenőrzésére. 6. Az assay működési jellemzői a szérumtól eltérő anyagok vizsgálatára nincsenek meghatározva. Várható értékek Referencia tartomány Egy pozitív és egy negatív eredmény között a küszöb (cut-off) értéke 20 egység. 246 egészséges önkéntes személy mintáit tesztelték. Ez a populáció körülbelül 65%-ban nőkből állt, életkoruk 18-75 év között volt, a kor-átlag 38 év. Huszonhárom (9.4%) minta volt pozitív, így a specificitás 90.6%-nak adódik. Az ELISA pozitív minták közül azonban 6 pozitív lett HEp-2 sejteken végzett IFA vizsgálattal is. Ezek között találták az egészséges önkéntesektől származó két legnagyobb pozitív eredményt adó mintát is, amelyek értéke 40 és 50 egység volt. Ezt a 6 ANA pozitív mintát így figyelembe véve, a biológiailag téves pozitív minták aránya már csak 6.9%. Az egészséges önkéntesek megmaradt pozitív mintáinak eredménye minden esetben 35 egység, vagy annál kevesebb volt. Az egészségesek csoportjának közelítőleg 60%-ában 10 egység, vagy ez alatti értéket találtak. Relatív szenzitivitás és specificitás Összehasonlítás egy másik forgalomban lévő referencia ANA ELISA teszttel Klinikailag meghatározott mintákat vizsgáltak az INOVA QUANTA Lite ANA ELISA és egy referens ANA ELISA teszttel. Az egészséges populáció, valamint az SLE, Sjögren szindróma és scleroderma betegek vizsgálatának eredményeit az alábbi táblázatok tartalmazzák. Ezen felül olyan savókat is teszteltek, amelyekről ELISA módszerrel korábban megállapították, hogy SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, chromatin, ribosomalis P, és M2 antigénekkel szemben reaktív ellenanyagokat tartalmaznak. Olyan mintákat is vizsgáltak, amelyekben előzőleg immunfluorescens vagy Western blot eljárással mutatták ki a centromer, P-80 coilin, nucleolusok és PCNA ellenes pozitivitást. A kitek csaknem azonos eredményeket adtak. Az alábbi táblázatok adataiból kalkulálva a relatív szenzitivitás 89%, és a relatív specificitás 89%. Egészségesek eredményeinek összehasonlítása INOVA és referens ANA ELISA használatával. Normál n=134 Negatív 106 6** Referens ANA ELISA Pozitív 13* 9*** * Ezekben a mintákban 1-1.6 Referencia Egység volt, ami megfelel 20-33 INOVA Egységnek. A minták közül négy ANA pozitív volt HEp-2 sejteken, IFA eljárással. ** Ezekben a mintákban 20-25 INOVA Egységet mértek. Két minta volt ANA pozitív IFA módszerrel. *** Három minta volt ezek között ANA pozitív IFA módszerrel. Szisztémás rheumatikus betegségben (SRD) szenvedők eredményeinek összehasonlítása INOVA és referens ANA ELISA használatával SRD n=100 Negatív 4* 1 Referens ANA ELISA Pozitív 6 89 *Ezek közül a minták közül egy volt negatív HEp-2 sejteken végzett IFA vizsgálattal. Meghatározott reaktivitású minták összehasonlítása és egy referens ANA ELISA használatával Ismert minta n=74 Negatív 2* 7*** Referens ANA ELISA Pozitív 1** 64 * Volt 1 PCNA és 1 Scl-70 pozitív minta, mindkettő ANA pozitív IFA módszerrel HEp-2 sejteken. ** Ez a minta IFA eljárással vizsgálva pozitív volt, nucleolaris mintázattal. *** Ezek között volt 1 Scl-70, 1 RNP, 1 M2 és 4 Jo-1 pozitív minta, valamennyi alacsonytól a mérsékelt szintig pozitív az teszttel. Az Scl-70 és RNP minták ANA pozitívak voltak HEp-2 sejteken. A többi minta ANA negatív, de gyenge cytoplasma pozitivitást mutattak IFA módszerrel, a 5

várakozásnak megfelelően. A QUANTA Lite ANA ELISA és a NOVA Lite HEp-2 sejteken végzett IFA összehasonlító vizsgálata. Valamennyi normál és klinikailag definiált mintát, amelyet az INOVA QUANTA Lite ANA ELISA kittel vizsgáltak, az INOVA NOVA Lite HEp-2 kitekkel is teszteltek, IFA eljárással. A torzításmentes eredmények érdekében az IFA értékelését végző technikus vakon dolgozott, azaz nem tudta a mintákat azonosítani. Mint az alábbi táblázatban látható, az ANA ELISA szignifikánsan kevesebb ANA pozitív eredményt adott az egészséges populációban, mint az IFA technika. Ezen felül, mint a második táblázatban látható, az ELISA közel olyan érzékenységgel detektálta az ANA-t, mint a HEp-2 technika, SLE, Sjögren szindróma és scleroderma betegségben szenvedő páciensek mintáiban. Egészséges önkéntesek eredményeinek összehasonlítása a QUANTA Lite ANA ELISA és a NOVA Lite HEp-2 sejtek használatával Normál n=134 Negatív 91 10* IFA HEp-2 sejteken Pozitív 28 5 * Ezekben a mintákban a pozitivitás 35 Egység, vagy annál kisebb volt. SRD betegek eredményeinek összehasonlítása a QUANTA Lite ANA ELISA és a NOVA Lite HEp-2 sejtek használatával SRD n=100 Negatív 1 3** IFA HEp-2 sejteken Pozitív 9* 87 * A 3 minta SLE, Sjögren és scleroderma betegektől származott, változatos IFA ANA mintázattal, többnyire alacsony ANA intenzitással. ** Ezek a minták SLE betegekből voltak, közülük egy mutatott erősen pozitív cytoplasma fluoreszcenciát, és pozitív volt ribosomalis-p antitestre ELISA módszerrel. A pufferek összehasonlítása az ANA kimutatása során IFA eljárással, HEp-2 sejteken Várhatóan egyes laboratóriumok használni fogják a QUANTA Lite ELISA módszert a negatív minták kiszűrésére, és ezután a pozitív mintákon megerősítő vizsgálatként a hagyományos ANA IFA tesztet alkalmazzák. Hogy ez kényelmesebb legyen, az ANA Mintahígító kompatibilis a hagyományos IFA módszerekkel. A minták egy részén, amelyeket NOVA Lite HEp-2 IFA kittel vizsgáltak ANA-ra, elvégezték a tesztet úgy is, hogy az eredeti NOVA Lite kitben található PBS puffer helyett az ANA Mintahígítót használták a minták hígítására az IFA módszer kivitelezéséhez a HEp-2 sejteken. Az eredmények, amelyeket a két különböző diluens alkalmazásával kaptak, gyakorlatilag azonosak voltak az SLE, Sjögren szindróma és scleroderma betegek esetében. 97 mintából mindössze 5-ben észleltek eltérést. Az ANA Mintahígító csökkentette a nemspecifikus kötődést, és 3 esetben pozitív értékelést eredményezett korábban negatívnak véleményezett mintákkal. Ez a cytoplasma háttér-festődés kisebb intenzitásával magyarázható, ami lehetővé tette az ANA mintázat megjelenését. Két esetben korábban gyengén pozitívnak véleményezett minta negatív lett, a gyengébb magfestődés miatt. Mint ez várható is volt, a normál minták eredményeiben több eltérést tapasztaltak, mivel az alacsony vagy negatív IFA eredményeket sokkal nehezebb meghatározni, mint az erősen pozitívakat. A PBS diluens használatakor az egészséges önkéntesek 33%-a volt pozitív, míg az ANA ELISA hígító használatával a pozitív minták aránya 26% volt. Újabb irodalmi adatok szerint az egészséges normál populációban az ANA pozitivitás 30%, ha 1:40 arányú hígítással végzik a vizsgálatot. 11 A négy pozitív minta titerét meghatározták úgy, hogy az eredeti ANA Mintahígítóval készült 1:41 arányú hígításból sorozat hígítást készítettek PBS pufferrel. Ezek a végpont-titer értékek egy hígítási lépésen belül voltak ahhoz képest, mint amikor az alaphígításhoz a NOVA Lite PBS-t használták. A betegek mintáinak kezdeti hígítását az 1:41 aránytól eltérő értékkel az ANA Mintahígító használatával nem ellenőrizték. Klinikai Szenzitivitás és Specificitás Pozitív Páciens csoport Összesen # % Egészséges önkéntesek 246 23 9% Klinikailag definiált betegek SLE 46 43 93% Sjögren szindróma 27 24 89% Scleroderma 27 23 85% Antigén szinten definiált* 74 71 96% * 4 9 olyan mintát teszteltek, amelyek ismerten pozitívak voltak SS-A, SS-B, Sm, RNP, Scl-70, Jo-1, Chromatin, ribosomalis-p és M2 antitestekre. Olyan mintákat is vizsgáltak, amelyek IFA vagy Western blot módszerrel voltak pozitívak centromer, P-80 coilin, nucleolus és PCNA antitestekre. A fenti tanulmány alapján az ANA ELISA klinikai szenzitivitása SLE-re 93%, a klinikai specifikussága pedig 91%. Az SLE betegek között talált ANA pozitivitás %-os gyakorisága az irodalmi adatokkal megegyezik. 1-4 Meg kell jegyezni, hogy néhány beteget corticosteroidokkal ketzeltek, amikor a mintát vették tőlük. A Sjögren szindrómás és sclerodermás betegek IFA módszerrel ANA pozitívak voltak. Érdekes módon, az egészségesek között a biológiai téves pozitivitás szignifikánsan kevesebb volt ELISA-val, mint a HEp-2 sejteken végzett IFA eljárással, amit rendszerint 20-30%-nak találnak a különböző tanulmányokban. 11,12 6

Precizitás és reprodukálhatóság Sorozaton belül (Within-Run): A QUANTA Lite ANA ELISA sorozaton belüli precizitásának meghatározása céljából 5 mintát teszteltek, mindegyiket 12-szer egyetlen lemezen. Az eredmények az alábbi táblázatban láthatók: 1. Minta 2. Minta 3. Minta 4. Minta 5. Minta Átlag 31 Egység 51 Egység 54 Egység 144 Egység 172 Egység SD 1.3 Egység 3.4 Egység 6.0 Egység 9.6 Egység 6.5 Egység CV 4 % 7 % 11 % 7 % 4 % Sorozatok között (Between-Run): A sorozatok közötti precizitás meghatározása céljából 4 pozitív mintát, és egy határérték-közeli negatív mintát teszteltek naponta egyszer, hat különböző napon. Az eredmények az alábbi táblázatban láthatók: 1. Minta 2. Minta 3. Minta 4. Minta 5. Minta Átlag 16 Egység 27 Egység 31 Egység 47 Egység 160 Egység SD 1.6 Egység 2.4 Egység 2.2 Egység 5.1 Egység 22.6 Egység CV 10 % 9 % 7 % 11 % 14% Hivatkozások 1. Von Muhlen CA and Tan EM: Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 24:323-358 (1995). 2. Tan EM: Antinuclear antibodies: diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv Immunol 44:93-151 (1989). 3. Van Venrooj WJ and Maini RN, editors: Manual of Biological Markers of Disease, section B: Autoantigens. Kluwer Academic Publishing, Boston (1994). 4. Tan EM, et al: The 1982 Revised Criteria for the Classification of Systemic Lupus Erythematosus. Arthritis Rheum 25:1271-1277 (1982). 5. Jaskowski TD, et al: Screening for antinuclear antibodies by enzyme immunoassay. Am J Clin Pathol 105:468-473 (1996). 6. Woodruff E and O Neil L: Clinical significance of antinuclear antibodies: comparison of detection with immunofluorescence and enzyme-linked immunosorbent assays. Arth Rheum 40:1612-1618 (1997). 7. Carey JL: Enzyme immunoassays for antinuclear antibodies. Clin Lab Med 17:355-365 (1997). 8. Homburger HA, et al: Detection of antinuclear antibodies: comparative evaluation of enzyme immunoassay and indirect immunofluorescence methods. Arch Pathol Lab Med 122:993-999 (1998). 9. Gniewek RA, et al: Comparison of antinuclear antibody testing methods: immunofluorescence assay versus enzyme immunoassay. Clin Diagn Lab Immunol 4:185-188 (1997). 10. Vlachoyiannopoulos PG, et al: Clinical features and evolution of antinuclear antibody positive individuals in a rheumatology outpatient clinic. J Rheumatol 25:886-891 (1998). 11. Tan EM, et al: Range of antinuclear antibodies in healthy individuals. Arthritis Rheum 40:1601-1611 (1997). 12. Lipscomb MF, et al: Comparison of substrates for the detection of antinuclear antibodies in normals and in patients with connective tissue and other diseases. Diagn Immunol 2:181-187 (1984). 13. Amoura Z, et al: The key role of nucleosomes in lupus. Arthritis Rheum 42:833-843 (1999). 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control/National Institute of Health, 1999, Fourth Edition, (HHS Pub. # (CDC) 93-8395). A terméket előállítja: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America Forgalmazásra jogosult az EU területén: Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80 D-66386 St. Ingbert, Germany Tel.: +49-6894-581020 Fax.: +49-6894-581021 www.mt-procons.com Technical Service 888-545-9495 628750HUN May 2007 Revision HUN0 7