!HU000008218T2! (19) HU (11) Lajstromszám: E 008 218 (13) T2 MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (21) Magyar ügyszám: E 03 77992 (22) A bejelentés napja: 03.. 16. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 077992 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 18641 A1 04. 0. 13. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 18641 B1. 02. 24. (1) Int. Cl.: C07K 14/62 (06.01) A61K 9/00 (06.01) A61K 38/28 (06.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 039838 PCT/EP 03/011470 () Elsõbbségi adatok: 297 02.. 29. DE (72) Feltaláló: BERCHTOLD, Harald, 61476 Kronberg (DE) (73) Jogosult: Sanofi-Aventis Deutschland GmbH, 6929 Frankfurt am Main (DE) (74) Képviselõ: Lengyel Zsolt, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest (4) Inzulinanalógok kristályai és eljárás elõállításukra HU 008 218 T2 A leírás terjedelme 6 oldal Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 199. évi XXXIII. törvény 84/H. -a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.
1 2 3 4 0 A találmány tárgyát képezik olyan inzulinanalóg kristályai, amelyekben a B¹lánc B3. helyzetében lévõ aszparagin (Asn) ki van cserélve egy természetes körülmények között elõforduló bázikus aminosavra, és a B¹lánc B27., B28. vagy B29. helyzetében legalább egy aminosav ki van cserélve egy másik, természetes körülmények között elõforduló, semleges vagy savas aminosavra, ahol a B¹lánc B1. helyzetében a fenil-alanin (Phe) fakultatív módon hiányozhat, ahol a kristályok az R3¹tércsoportban (146. sz.) vannak jelen, amelyben a cella tengelyei: A=81, ű1 Á és C=33,3 ű1 Å. Világszerte 1 millió ember szenved cukorbetegségben (diabetes mellitus). Ebbõl körülbelül 12 millió ember I. típusú cukorbetegségben szenved, amelyre jelenleg az egyetlen lehetséges terápia inzulin alkalmazása. Az érintett személyeknek egész életükben, rendszerint naponta többször kell inzulininjekciót kapniuk. Bár a II. típusú cukorbetegség, amiben körülbelül 0 millió ember szenved, alapvetõen nem inzulinhiánnyal jár, az esetek nagy számában az inzulinkezelés kedvezõ vagy egyedüli lehetséges terápiaformának számít. A betegség elõrehaladt szakaszában sok páciens esetén a cukorbetegség úgynevezett késõi komplikációkhoz vezet. Ezek lényegében különbözõ mikro- és makrovaszkuláris károsodások, aminek a következménye a típustól és a kiterjedéstõl függõen veseelégtelenség, vakulás, végtagok elvesztése vagy szív/keringési betegségek megnövekedett kockázata. A betegség okáért elsõsorban krónikusan megnövekedett vércukortükör felelõs, ugyanis még gondosan beállított inzulinterápia esetén is, normál vércukorprofil, ami megfelelne a fiziológiás szabályozásnak, nem érhetõ el [Ward, J. D., British Medical Bulletin 4, 111 126 (1989); Drury, P. L. és munkatársai, British Medical Bulletin 4, 127 147 (1989); Kohner, E. M., British Medical Bulletin 4, 148 173 (1989)]. Egészséges személyekben az inzulin kiválasztása szorosan a glükóz koncentrációjához igazodik. Megnövekedett glükóztükör, ami étkezések után alakul ki, fokozott inzulinfelszabadulással gyorsan kompenzálódik. Kiéhezett állapotban a plazma-inzulintükör egy alapérték alá csökken, ami elegendõ, hogy garantálja az inzulinra érzékeny szervek és szövetek folyamatos ellátását glükózzal. A terápia optimalizálása céljából, az úgynevezett intenzív inzulinterápia ma már elsõsorban azt a célt tûzi ki, hogy a vércukor-koncentráció ingadozása, konkrétan a fentebb említett eltérések mértéke a lehetõ legkisebb legyen [Bolli, G. B., Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S3 S16 (1989); Berger, M., Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S2 S32 (1989)]. Ez oda vezet, hogy jelentõsen csökken az esetek száma és az elõrehaladt cukorbetegség késõi károsodásainak mértéke [ The Diabetes Control and Complications Trial Research Group, N. Engl. J. Med. 329, 977 986 (1993)]. Az inzulinkiválasztás fiziológiájából következik, hogy javított, intenzívebb inzulinterápiához szubkután alkalmazható preparátumba különbözõ farmakodinámiával rendelkezõ, kétféle inzulinkészítmény szükséges. Az étkezés utáni vércukortükör kompenzálására az inzulinnak gyorsan kell beáramlania, és csak egy óráig szabad hatnia. Az alapszint biztosításához, különösen éjszaka, olyan preparátumnak kell rendelkezésre állnia, amely hosszan mûködik, nem mutat határozott maximumot, és csak nagyon lassan áramlik. Humán és állati eredetû inzulinra alapozott preparátumok az intenzív inzulinterápiával szemben támasztott igényeket csak korlátozottan elégítik ki. Gyorsan ható inzulin (hagyományosan alkalmazott inzulin) túl lassan jut a véráramba és a hatás helyéhez, és túl hosszan fejti ki hatását. Ennek az a következménye, hogy a posztprandiális glükóztükör túl magas lesz, és étkezés után több órával túl erõteljesen csökken [Kang, S. és munkatársai, Diabetes Care 14, 142 148 (1991); Home, P. J. és munkatársai, British Medical Bulletin 4, 92 1 (1989); Bolli, G. B., Diabetes Res. Clin. Pract. 6, S3 S16 (1989)]. A rendelkezésre álló alapinzulin, mindenekelõtt az NPH-inzulin ezzel szemben túl rövid ideig hat, és túl erõs, határozott maximumot mutat. Amellett, hogy lehetõség van a hatásprofil befolyásolására galenuszi alapokon keresztül, ma már a géntechnika segítségével új alternatív inzulinanalógokat lehet tervezni, amelyekben meghatározott tulajdonságokat, például a hatás kialakulását és tartósságát pusztán strukturális jellemzõkön keresztül lehet megcélozni. Alkalmas inzulinanalógok alkalmazásával a vércukorszint lényegesen jobb, a természetes körülményeket szorosabban megközelítõ beállítása érhetõ el. Gyorsan kialakuló hatással rendelkezõ inzulinanalógokat leírtak az EP 0 214 826, EP 0 37 437 és EP 0 678 22 számú európai szabadalmi iratokban. Az EP 0 214 826 számú szabadalmi iratban többek között hivatkoznak B27 és B28 szubsztitúcióira, azonban nincs utalás szubsztitúcióra a B3. helyzetben. Az EP 0 678 22 számú szabadalmi iratban olyan inzulinanalógokat írnak le, amelyek a B29. helyzetben különbözõ at, elõnyösen prolint tartalmaznak, azonban glutaminsavat nem. Az EP 0 376 437 számú szabadalmi iratban olyan inzulinanalógokat írnak le, amelyek a B28. helyzetben lizint és arginint tartalmaznak, amelyek adott esetben továbbá a B3. és/vagy A21. helyzetben módosítva lehetnek. Az EP 0 88 961 A1 számú szabadalmi iratban a B3. helyzetben lizint és a B29. helyzetben glutamátot tartalmazó humán inzulint új, gyorsan ható inzulinként írják le. Az EP 0 419 04 számú szabadalmi iratban olyan, kémiai módosításokkal szemben védett inzulinanalógokat írnak le, amelyekben a B3. helyzetben lévõ aszparagin, és az A., A1. A18. vagy A21. helyzetben lévõ, legalább egy további aminosav meg van változtatva. A leírt inzulinanalógok a B3. helyzetben mégiscsak egy módosítást tartalmaznak, és az említett csoportok közül további módosítás egyikben sincs. Nincs utalás arra, hogy ezek az anyagok megváltozott farmakodinamikával rendelkeznek, aminek a következménye a hatás gyorsabb kialakulása. Az inzulinanalógok természetes körülmények között elõforduló inzulinok, konkrétan humán inzulin vagy állatból származó inzulinok analógjai, amelyek legalább egy, természetes körülmények között elõforduló 2
1 2 3 4 0 aminosav szubsztitúciójával, és/vagy legalább egy aminosav és/vagy szerves csoport hozzáadásával különböznek a megfelelõ, egyébként ugyanolyan természetesen elõforduló inzulintól. A humán inzulin A¹lánca a következõ aminosavszekvenciával rendelkezik: Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn (1. azonosító számú szekvencia). A humán inzulin B¹lánca a következõ aminosavszekvenciával rendelkezik: Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr (2. azonosító számú szekvencia). A húsz természetes körülmények között elõforduló aminosav közül, amelyek genetikailag kódolhatók, a leírásban a glicin (Gly), alanin (Ala), valin (Val), leucin (Leu), izoleucin (Ile), szerin (Ser), treonin (Thr), cisztein (Cys), metionin (Met), aszparagin (Asn), glutamin (Gln), fenil-alanin (Phe), tirozin (Tyr), triptofán (Trp) és prolin (Pro) at tekintjük semleges nak, az arginin (Arg) lizin (Lys) és hisztidin (His) at bázikus nak és az aszparaginsav (Asp) és glutaminsav (Glu) at savas nak tekintjük. Vagy fiziológiailag elfogadható sója, konkrétan az (I) képletû inzulinanalóg vagy fiziológiailag elfogadható sója, azzal jellemezve, hogy A8 alanin (Ala) A9 szerin (Ser) A valin (Val) és B alanin (Ala) (marhából származó inzulin A8 A ) A8 treonin (Thr) A9 szerin (Ser) és A izoleucin (Ile) (emberi vagy sertésbõl származó inzulin A8 A ), ahol B alanin (Ala) (sertésinzulinból származó B aminosav) vagy B treonin (Thr) (humán inzulin B aminosav, vö. 2. azonosító számú szekvencia) Különösen elõnyös az (I)-képletû inzulinanalóg vagy fiziológiailag elfogadható sója, ahol az A8¹A és B humán inzulinból származnak, amelyet továbbá az jellemez, hogy (A1 A) humán inzulin A¹láncának (1. az. sz. szekvencia) A1 A helyzeteiben lévõ (A12 A19) humán inzulin A¹láncának (v. ö. 1. az. sz. szekvencia) A12 A19 helyzeteiben lévõ (B8 B18) humán inzulin B¹láncának (v. ö. 2. az. sz. szekvencia) B8 B18 helyzeteiben lévõ (B B26) humán inzulin B¹láncának (v. ö. 2. az. sz. szekvencia) B B26 helyzeteiben lévõ A találmány további elõnyös megvalósítási módjai olyan kristályok, amelyek (I)-képletû inzulinanalógot vagy fiziológiailag elfogadható sóját tartalmazzák, azzal jellemezve, hogy a B¹lánc B1¹helyzetében lévõ aminosav fenil-alanin (Phe), vagy B¹lánc B3¹helyzetében lévõ aminosav hisztidin (His), lizin (Lys) vagy arginin (Arg). A találmány további elõnyös megvalósítási módjai olyan kristályok, amelyek B¹lánc B27¹, B28- és B29-helyzeteiben lévõ közül legalább egy olyan természetesen elõforduló aminosavra van kicserélve, amely semleges vagy savas csoportjából van kiválasztva, B¹lánc B27¹, B28- és B29-helyzeteiben lévõ közül legalább egy olyan természetesen elõforduló aminosav, amely izoleucint (Ile), aszparaginsavat (Asp) és glutaminsavat (Glu) tartalmazó csoportból van kiválasztva, elõnyösen, azzal jellemezve, hogy a B¹lánc B27¹, B28- és B29-helyzeteiben lévõ közül legalább egy olyan természetesen elõforduló aminosavra van kicserélve, amely semleges csoportjából van kiválasztva, vagy különösen elõnyösen a B¹lánc B27¹, B28- és B29-helyzeteiben lévõ közül legalább egy izoleucin (Ile), vagy B¹lánc B27¹, B28- és B29-helyzeteiben lévõ közül legalább egy olyan természetesen elõforduló aminosav, amely savas csoportjából van kiválasztva, elõnyösen, azzal jellemezve, hogy legalább egy aminosav a találmány elõnyös megvalósítási módjai olyan kristályok, amelyek inzulinanalógot vagy fiziológiailag elfogadható sóját tartalmazzák, azzal jellemezve, hogy a B¹lánc szekvenciája: Phe val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (3. azonosító számú szekvencia). Az inzulinanalóg elõnyösen géntechnológiailag lett elõállítva. Az inzulin elõállítása fõleg géntechnológiailag, helyspecifikus mutagenezissel, standard eljárások szerint történik. Ehhez elõször a kívánt inzulinanalógot kódoló génstruktúrát állítjuk elõ, és egy gazdasejtben elõnyösen egy baktériumban, például E. coliban vagy egy élesztõben, különösen Saccharomyces cerevisiae-ben expresszáljuk, és fúziós fehérjét kódoló génstruktúra esetén a fúziós fehérjébõl felszabadítjuk az inzulinanalógot; analóg eljárásokat leírtak például az EP A 0 211 299, EP A 0 277 938, EP A 0 229 998, EP A 0 286 96 számú szabadalmi iratokban és a P 3821 19 számú DE szabadalmi bejelentésben. A fúziós fehérjerészek hasítása sejtfeltárás után kémiailag, halogén-cián alkalmazásával történik (lásd EPA 0 180 9 számú szabadalmi iratban leírtakat). Ha az elõállítás prepro-inzulin elõalakon keresztül történik, ami fúziós fehérjerészletet (preszekvenciát) 3
tartalmaz az,38,87 számú USA-beli szabadalmi leírás alapján, a fúziós fehérjerész hasítása egy késõbbi lépésben, a C¹peptid lehasításával együtt történik. Az inzulin-elõalakokat azután oxidatív szulfitolízisnek vetjük alá, például R. C. Marshall és A. S. Inglis által a Practical Protein Chemistry A Handbook címû könyvben (kiadó A. Darbre, 1986, 49 3. old.) leírt módszer szerint, ezt követõen tiol jelenlétében a helyes diszulfidhidak kialakulásával renaturáljuk, például G. H. Dixon és A. C. Wardlow által leírt [Nature, 721 724 (19)] módszerrel. Az inzulin-elõalakok natív konformációja ( folding ) azonban közvetlenül is kialakulhat (EP A 0 0 372; EP A 0 668 292 számú szabadalmi iratok). A C¹peptidet tripszines hasítással távolítjuk el, például Kemmler és munkatársai által leírt módszerrel [J. B. C. 6786 6791 (1971)], és az I¹képletû inzulinanalógot ismert technikával, például kromatográfiával például az EP A 0 7 számú szabadalmi iratban leírtak szerint és kristályosítással tisztítjuk. Ezzel az eljárással elõállított B¹lánc C¹terminálisa argininnel vagy két argininnel végzõdik. Ezt enzimatikusan karboxi-peptidáz-b-vel lehet eltávolítani. Az inzulinanalóg teljes mértékû biológiai aktivitással rendelkezik. Ezt nyulaknak intravénásan beadva és ennek eredményeként fellépõ, vércukorszint-csökkenéssel mutatjuk ki. A hatás gyorsabb kialakulása szubkután beadás után euglikémiás clamp technika alkalmazásával kiéhezett kutyában mutattuk ki (EP 0 88 961 A1. számú európai közzétételi iratban, az. és 6. példában leírtak szerint). 0,3 IE/kg¹ot adtunk be. A referenciakészítmény humán inzulin volt. A clamp - technikában az inzulininjekció után egy rövid idõ elteltével vércukorszintet mérünk, és pontosan annyi glükózt infundálunk, hogy a csökkenést kompenzáljuk. Ennek elõnye, hogy állatoknál nem lép fel ellenszabályozás, mint abban az esetben, ami inzulin beadására a vércukor erõteljes csökkenésekor fordulna elõ. Az infundált glükóz mennyisége és idõbeli lefutása jellemzõ az inzulin hatására. Lys(B3), Glu(B29) (3. azonosító számú szekvencia) hatása egyértelmûen gyorsabban kialakul, mint a humán inzuliné. A maximális hatás (glükózinfúziós sebesség) humán inzulinnal 0 perc elteltével jelentkezik, Lys(B3), Glu(B29) (3. azonosító számú szekvencia) inzulinnal viszont 80 perc múlva. Ezért, ha nem sokkal étkezés elõtt injektáljuk az említett analógot, a vércukor posztprandiális emelkedését jobban kompenzálja, mint a humán inzulin. A leírt inzulinanalógok alkalmasak mind I. típusú, mind II. típusú cukorbetegség terápiájára, alapinzulinnal kombinációban. Inzulinanalógok gyógyászati készítményekbe fiziológiailag elfogadható sóik, például alkáli- vagy ammóniumsóik formájában is bevihetõk. Egy vagy több inzulinanalóg tetszés szerinti része, további inzulinanalógok által alkotott keverékben egymástól függetlenül, egyidejûleg oldott, amorf és/vagy kristályos formában is lehet. Inzulint és inzulinanalógokat gyakran olyan vizes alapú gyógyászati készítményként állítanak elõ, amely cinkionokat tartalmaz. 1 2 3 4 0 Cinkionok hozzáadása az inzulinkészítményekhez lényegében két okból történik: 1. Cinkionok stabilizáló hatást fejtenek ki az inzulinkészítményre, mert elõsegítik inzulinhexamerek kialakulását [Brange és munkatársai, Diabetic Medicine 3, 32 36 (1986)]. 2. A cinkion-koncentrációtól függõen, az inzulinkészítmény áramlási kinetikájának idõbeli lefutását szabályozni lehet. Gyorsan ható inzulin esetén az 1. és 2. pontban felsoroltak problémát okozhatnak. A készítmény megnövekedett galenuszi stabilitása miatt az inzulinhexamerek magas koncentrációi hátrányosak. Mivel a cinkionok az inzulinanalógok áramlási kinetikáját javítják, a hatóanyag-felszabadulás kívánt kinetikája ellen hatnak. Ezért olyan döntés született, hogy a leírt inzulinanalógokat, konkrétan humán inzulin Lys B3, Glu B29 analógokat cinkmentes, vízalapú kiszerelés formájában állítjuk elõ (PCT/EP02/0262 számú szabadalmi irat). Humán inzulin Lys B3, Glu B29 analógok cinkmentes, vízalapú kiszereléseinek elõállításához szükség van arra, hogy az említett inzulinanalógok cinkmentes kristályait tudjuk hozzáadni. Továbbá ilyen cinkmentes kristályokat más gyógyászati kiszerelések, például szilárd kiszerelések vagy inhalátorban alkalmazható emulziók vagy orális készítmények elõállítására is alkalmaznak. A találmány kidolgozása során feladatként tûztük ki tehát a leírt inzulinanalógok cinkmentes kristályainak elõállítását. Ehhez el kellett kerülni cinkionok cseréjét más, olyan kétértékû ionokra, amelyek toxicitásuk miatt gyógyászati készítményekben nem alkalmazhatók. Meglepõ módon azt találtuk, hogy a leírt inzulinanalógokat olyan hexamer kristályok formájában lehet elõállítani, amelyek nem tartalmaznak kétértékû ionokat, például cinkionokat. A Lys B3, Glu B29 humán inzulin új kristályformája krisztallográfiailag izomorf a klasszikus 2Zn-inzulin-típussal, amit az irodalomban sertésbõl származó inzulinra és humán inzulinra leírtak [Baker és munkatársai, Phil. Trans. Roy. Soc. 319, 369 44 (1988)]. Az új cinkmentes hexamerkristályok a romboéderes R3¹tércsoportba tartoznak (146. sz.), aszimmetrikus egységenként két inzulinmonomerrel. Az elemi cella tengelyei 70 C¹on (fagyasztásos sokk módszerének alkalmazásával) a következõ: A=81, Å és C=33,3 Å. Az új kristályforma röntgen-szerkezetanalízise 1,8 Å felbontásnál azt mutatta, hogy a Zn 2+ -ionok helyénél, ami körülbelül 2,0 Å kötési távolság (a klasszikus 2Zn-típusban), az új, Lys B3, Glu B29 humán inzulin új kristályformájában sokkal kisebb elektronsûrûség található, ami megfelel a vízmolekulával (H 2 O) alkotott kötésnek (kötési távolság H 2 O¹His-B körülbelül 2,3 Å). Az elektronsûrûség mértéke és a kötési távolság egyaránt azt mutatja, hogy a B21-glutamát-oldallánccal rendelkezõ inzulinban a B-hisztidin körüli régió egy eddig ismeretlen strukturális elrendezését mutat. A B-hisztidin körüli régió (1o-2Fo¹Fc)-elektronsûrûsége szignifikánsan különbözik a klasszikus 2Zn-tí- 4
pustól, amelyben egy cinkion oktaéderesen helyezkedik el a három, szimmetrikusan szomszédos B-hisztidinhez és a három vízmolekulához viszonyítva. A kötési távolság (Zn 2+ ¹HisB) a PDB-adatbankban [Bernstein és munkatársai, J. Mol. Biol. 112, 3 42 (1977)] lefektetett, 2Zn-típus struktúrája szerint 1,9 és 2,1 Å között van, és szignifikánsan különbözik az új, cinkmentes kristálystruktúrában megfigyelt, körülbelül 2,3 Å kötési távolságtól. A különlegesség az itt leírt, Lys B3, Glu B29 humán inzulin új hexamer-kristályformájában az, hogy ezekbõl az inzulinhexamerekbõl hiányoznak az egyébként szükséges kétértékû kationok (például Zn 2+,Co 2+,Cd 2+ ). Eddig feltételezték, hogy inzulinhexamerek kialakulása kétértékû kationok nélkül csak akkor lehetséges, ha a glutamát-b21 oldallánc taszítását fehérjetervezéssel (például a B21. helyzetben lévõ Glu cseréjével Gln¹re) csökkenteni lehet [Bentley és munkatársai, J. Mol. Biol. 228, 1163 1176 (1992)]. A Glu-B21-oldallánc megtartása ami az inzulinhexamer szétesését segíti mégis fontos, mindenekelõtt gyorsan ható inzulinhoz, a gyors áramlási kinetika érdekében. A találmány tárgyát képezik ennek megfelelõen LysB3, GluB29 humán inzulin inzulinanalóg kristályai, ahol a kristályok az R3¹tércsoportban (146. sz.) vannak jelen, amelyben a cella tengelyei: A=81, ű1 Å és C=33,3 ű1 Å, ahol az inzulinanalóg molekulái olyan cinkmentes hexamerek formájában vannak jelen, amelyeket minden esetben három dimer alkot. A találmány tárgyát képezik továbbá a fentebb leírt kristályok, ahol a hexamerben lévõ inzulinanalóg három molekulájának B-hisztidin-csoportja minden esetben vízmolekulához, dihidrogén-foszfát-ionhoz (H 2 PO 4 ), monohidrogén-foszfát-ionhoz (HPO 4 2 ) vagy szulfát-ionhoz (SO 4 2 ) kötõdik hidrogénhídkötéseken keresztül. A találmány tárgyát képezik továbbá a fentebb leírt kristályok, ahol a hexamerben lévõ inzulinanalóg három molekulájának B-hisztidin-csoportja olyan konformációban van, hogy minden esetben saját dimerjét alakítja ki (lásd. ip.ban is), és nem alakul ki hidrogénhídkötés a B-hisztidin-csoport és egy jelen lévõ vízmolekula között. A találmány szerinti kristályok különösen olyan inzulinanalógot tartalmaznak, amelyeket az jellemez, hogy a B¹lánc a következõ szekvenciával rendelkezik: Phe val Lys Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr (3. azonosító számú szekvencia). A találmány tárgyát képezi továbbá gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy, fentebb leírt kristályt tartalmaz, ahol a készítmény elõnyösen olyan segédanyagot tartalmazhat, amely az inzulinanalóg vérbe való felszívódását megkönnyíti, és ahol különösen elõnyösen a gyógyászati kiszerelés gyorsan kialakuló inzulinaktivitással rendelkezik. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a fentebb leírt kristály elõállítására, amelyben (a) fentebb leírt, zinkmentes amorf inzulinanalóg-port feloldjuk vízben 1 2 mg/ml koncentrációban, 1 2 3 4 0 (b) kicsapást végzünk alkalmas kicsapást elõsegítõ anyag alkalmazásával, (c) a kristályokat izoláljuk és szárítjuk; ahol az inzulinanalóg különösen humán inzulin Lys B3, Glu B29. A találmány tárgyát képezi továbbá eljárás a fentebb leírt kristály elõállítására, amelyben a kicsapást elõsegítõ anyagot az alábbiak által alkotott csoportból választjuk ki: (a) ammónium-dihidrogén-foszfát (b) ammónium-dihidrogén-foszfát és trinátrium-citrát kombinációja; és (c) ammónium-szulfát és különbözõ molekulatömegû polietilénglikol kombinációja; ahol kicsapást elõsegítõ anyagként elõnyösen ammónium-dihidrogén-foszfátot vagy diammónium-hidrogénfoszfátot alkalmazunk 3,0 és 8,0 közötti ph¹kon, vagy ammónium-dihidrogén-foszfátot/diammónium-hidrogén-foszfátot alkalmazunk kombinációban trinátriumcitráttal,±1, ph¹n, vagy ammónium-szulfátot különbözõ molekulatömegû PEG-gel kombinációban 6,0±1, ph¹n. A találmány tárgyát képezi a fentebb leírt kristály alkalmazása I. és/vagy II. típusú cukorbetegség kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. A találmány szerinti megoldást pontosabban a példák segítségével magyarázzuk, anélkül, hogy igényünket ezekre korlátoznánk. 1. példa: Új, cinkmentes hexamer-kristályforma elõállítása Amorf, cinkmentes LysB3,GluB29 humán inzulinport puffermentesítettünk desztillált víz/hcl-ben, ph=2,0 körüli feloldáshoz. Ez a módszer lehetõvé teszi, hogy mg/ml körüli inzulinkoncentráció esetén tiszta oldat képzõdjön. A kristályosítás függõcseppmódszerrel történt 24 lyukú Linbro-tálcán. Kicsapást elõsegítõ anyagként a következõ reagenst alkalmaztuk a Protein Crystallization Screening Kit (Hampton Research, Inc. cég terméke) reagenskészletbõl: 0,4 M ammónium-dihidrogén-foszfát, ph=4,2. 2. példa: Új, cinkmentes hexamer-kristályforma elõállítása Amorf, cinkmentes LysB3,GluB29 humán inzulinport puffermentesítettünk desztillált víz/hcl-ben, ph=2,0 körüli feloldáshoz. Ez a módszer lehetõvé teszi, hogy mg/ml körüli inzulinkoncentráció esetén tiszta oldat képzõdjön. A kristályosítás függõcseppmódszerrel történt 24 lyukú Linbro-tálcán. Kicsapást elõsegítõ anyagként a következõ reagenst alkalmaztuk a Protein Crystallization Screening Kit (Hampton Research, Inc. cég terméke) reagenskészletbõl: 1 M ammónium-dihidrogén-foszfát, 0,1 M trinátrium-citrát, ph=,6. 3. példa: Új, cinkmentes hexamer-kristályforma elõállítása Amorf, cinkmentes LysB3,GluB29 humán inzulinport puffermentesítettünk desztillált víz/hcl-ben,
ph=2,0 körüli feloldáshoz. Ez a módszer lehetõvé teszi, hogy mg/ml körüli inzulinkoncentráció esetén tiszta oldat képzõdjön. A kristályosítás függõcseppmódszerrel történt 24 lyukú Linbro-tálcán. Kicsapást elõsegítõ anyagként a következõ reagenst alkalmaztuk a Protein Crystallization Screening Kit (Hampton Research, Inc. cég terméke) reagenskészletbõl: 0,2 M ammónium-szulfát, % PEG 3, ph=6,0. 4. példa: Röntgen-szerkezetanalízis Az 1 3. példákban leírtak szerint elõállított kristályok jól rendezettek, és lehetõvé teszik a röntgen-szerkezetanalízist, amely B21-glutamát-oldallánccal rendelkezõ inzulinra eddig ismeretlen strukturális elrendezést mutat a B-hisztidin körüli régióban. 2Zn-típusú, cinktartalmú humán inzulinkristályok az R3¹tércsoportban (146. sz.) vannak jelen, amelyben a cella tengelyei: A=81, Å és C=33,3 Å. Az inzulinmolekula felvett konformációja ( folding ) a humán inzulin cinktartalmú kristályszerkezetében és a cinkmentes, Lys B3, Glu B29 humán inzulin kristályszerkezetében úgynevezett T 6 ¹, illetve 2Zn-típusú. A 2Zn-inzulinban (T 6 ) mind a 6 monomer úgynevezett T=feszített állapotban van. A B¹lánc N¹terminálisának nincs semmilyen jelentõs másodlagos (szekunder) struktúrája, nem vesz fel ¹hélix másodlagos szerkezetet, mint az alternatív R¹állapotban. A kristályszerkezet jelentõs különbsége a humán inzulin és az (I)-vegyület között a hisztidin B-oldallánc régiója körüli elrendezõdésben van. Az 1 3. példa szerinti valamennyi elõállítási módszerre rendelkezésre áll nagy felbontású, egykristály röntgen-szerkezetanalízis, ami az inzulin hexamerkristály cinkmentes állapotát igazolja. Meghatároztuk az elemi cella tengelyeit és a kristályszimmetriát: 1. elõállítási eljárás: A=81,2, C=33,31 Å, R3 (146. sz. tércsoport) 2. elõállítási eljárás: A=81,1, C=33,43 Å, R3 (146. sz. tércsoport) 3. elõállítási eljárás: A=81,38, C=33,22 Å, R3 (146. sz. tércsoport) SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1 2 3 4 0 1. LysB3,GluB29 humán inzulin inzulinanalóg kristálya, ahol a kristály az R3¹tércsoportban (146. sz.) található, a következõ cellatengelyekkel: A=81, ű1 Å és C=33,3 ű1 Å, ahol az inzulinanalóg molekulái olyan cinkmentes hexamerek formájában vannak jelen, amelyeket minden esetben három dimer alkot. 2. Az 1. igénypont szerinti kristály, ahol a hexamerben lévõ inzulinanalóg három molekulájának B-hisztidin-csoportja minden esetben vízmolekulához kötõdik hidrogénhídkötéseken keresztül. 3. Az 1. igénypont szerinti kristály, ahol a hexamerben lévõ inzulinanalóg három molekulájának B-hisztidin-csoportja minden esetben dihidrogén-foszfát-ionhoz (H 2 PO 4 ) kötõdik hidrogénhídkötéseken keresztül. 4. Az 1. igénypont szerinti kristály, ahol a hexamerben lévõ inzulinanalóg három molekulájának B-hisztidin-csoportja minden esetben monohidrogén-foszfát-ionhoz (HPO 4 2 ) kötõdik hidrogénhídkötéseken keresztül.. Az 1. igénypont szerinti kristály, ahol a hexamerben lévõ inzulinanalóg három molekulájának B-hisztidin-csoportja minden esetben szulfát-ionhoz (SO 4 2 ) kötõdik hidrogénhídkötéseken keresztül. 6. Az 1. igénypontok bármelyike szerinti kristály, ahol a hexamerben lévõ inzulinanalóg molekuláinak B-hisztidin-csoportja olyan konformációban van, hogy minden esetben saját dimert képez, és nem alakul ki hidrogénhídkötés a B-hisztidin-csoport és egy jelen lévõ vízmolekula között. 7. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy, 1 6. igénypontok bármelyike szerinti kristályt tartalmaz. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, azzal jellemezve, hogy olyan segédanyagot is tartalmaz, amely elõsegíti az inzulinanalóg felszívódását a vérbe. 9. A 7. igénypont szerinti gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy legalább egy, 1 6. igénypontok bármelyike szerinti kristályt és olyan segédanyagot tartalmaz, amelyet inzulin vagy inzulinanalóg inhalációs és/vagy orális kiszereléseiben alkalmaznak.. Az 1 6. igénypontok közül egy vagy több igénypont szerinti kristály alkalmazása olyan gyógyászati készítmény elõállítására, amely gyorsan kialakuló inzulinaktivitással rendelkezik. 11. Eljárás az 1. igénypontok bármelyike szerinti kristály elõállítására, amelyben (a) az 1. igénypontok bármelyike szerinti, cinkmentes amorf inzulinanalóg-port feloldunk vízben 1 2 mg/ml koncentrációban, (b) kicsapást végzünk alkalmas kicsapást elõsegítõ anyag alkalmazásával (c) a kristályokat izoláljuk és szárítjuk. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, amelyben a kicsapást elõsegítõ anyagot: az alábbiakat tartalmazó csoportból választjuk ki: (a) ammónium-dihidrogén-foszfát (b) ammónium-dihidrogén-foszfát és trinátrium-citrát kombinációja; és (c) ammónium-szulfát és különbözõ molekulatömegû polietilénglikol kombinációja. 13. Eljárás az 1., 3., 4. és 6. igénypont közül egy vagy több igénypont szerinti kristályok elõállítására a 12. igénypont szerinti eljárással, ahol kicsapást elõsegítõ anyagként ammónium-dihidrogén-foszfátot vagy diammónium-hidrogén-foszfátot alkalmazunk 3,0 és 8,0 közötti ph¹értékeken. 14. Eljárás az 1 6. igénypontok közül egy vagy több igénypont szerinti kristály elõállítására a 12. igénypont szerinti eljárással, ahol kicsapást elõsegítõ anyagként ammónium-dihidrogén-foszfátot/diammónium-hidrogénfoszfátot alkalmazunk kombinációban trinátrium-citráttal,±1, ph¹n, vagy ammónium-szulfátot különbözõ molekulatömegû PEG-gel kombinációban 6,0±1, ph¹n. 1. Az 1 6. igénypontok közül egy vagy több igénypont szerinti kristály alkalmazása I. és/vagy II. típusú cukorbetegség kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására. Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Szabó Richárd osztályvezetõ Windor Bt., Budapest