Vitaminok és karotinoidok meghatározása tojássárgájából mátrix szilárd fázisú diszperziós technikával

Tudományos Diákköri Dolgozat SOLYMOS EMESE Vitaminok és karotinoidok meghatározása tojássárgájából mátrix szilárd fázisú diszperziós technikával Témavezetők: Dr. Eke Zsuzsanna Dr. Torkos Kornél Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Budapest, 2007

Tartalomjegyzék 1. CÉLKITŰZÉS... 2 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS... 3 2.1. VITAMINOK ÉS KAROTINOIDOK ÁLTALÁNOS BEMUTATÁSA... 3 2.1.1. Vitaminok... 3 2.1.2. Karotinoidok... 6 2.1.3. A karotinoidok szerepe az énekesmadarak fajfenntartásában... 8 2.2. A TOJÁS ÖSSZETÉTELE... 9 2.3. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉSI MÓDSZEREK BEMUTATÁSA... 10 2.3.1.1. Lehetséges minta előkészítések szabad vitaminok és karotinoidok meghatározására... 11 2.4. MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSRA ALKALMAS ANALITIKAI MÓDSZEREK... 14 2.4.1. Kromatográfiás módszerek... 14 2.4.1.1. Vékonyrétegkromatográfia... 14 2.4.1.2. Gázkromatográfia... 14 2.4.1.3. Nagy hatékonyságú kromatográfia... 15 2.4.2. Detektálási módszerek... 16 2.4.2.1. Fluoreszcens spektrofotometria... 16 2.4.2.2. Tömegspektrometria... 17 2.4.2.3. UV-VIS spektrofotometria... 17 2.4.2.4. Diódasoros detektálás... 18 3. KÍSÉRLETI RÉSZ... 19 3.1. STANDARD OLDATOK ÉS A BELSŐ STANDARD MEGVÁLASZTÁSA... 19 3.2. KROMATOGRÁFIÁS KÖRÜLMÉNYEK... 20 3.2.1. Optimált paraméterek meghatározása... 20 3.2.1.1. Az eluens megválasztása... 20 3.2.1.2. Oszloptermosztát hőmérsékletének optimálása... 20 3.2.1.3. Detektálási paraméterek meghatározása... 21 3.3. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉSI MÓDSZER KIVÁLASZTÁSA ÉS OPTIMÁLÁSA... 23 3.3.1. Oldószeres extrakció... 23 3.3.1.1. Extrakciók számának meghatározása... 23 3.3.2. Az MSPD minta-előkészítés... 24 3.3.2.1. A töltet mennyiségének optimálása... 25 3.3.2.2. Oldószer kiválasztása... 25 3.3.2.3. Elúciós térfogat optimálása... 26 3.3.2.4. Extrakciós idő optimálása... 27 3.4. A KIFEJLESZTETT MÓDSZER... 28 3.5. A MÓDSZER ANALITIKAI TELJESÍTMÉNYJELLEMZŐINEK VIZSGÁLATA... 29 3.5.1. Specifikusság... 29 3.5.2. Érzékenység... 31 3.5.3. Linearitás... 32 3.5.4. Torzítatlanság... 33 3.5.5. Precizitás... 34 3.5.6. Stabilitás... 35 3.5.6.1. Referencia oldat stabilitása... 35 3.5.6.2. Mintaoldat stabilitása... 36 3.5.7. Kimutatási határ... 36 3.5.8. Meghatározási határ... 37 4. MÓDSZER ALKALMAZÁSA VALÓS MINTÁKRA... 39 5. ÖSSZEFOGLALÁS... 40 6. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS... 41 7. FÜGGELÉK... 42 7.1. VIZSGÁLT VEGYÜLETEK... 42 7.2. SPECIFIKUSSÁG VIZSGÁLATA... 45 7.3. LINEARITÁS ÉS ÉRZÉKENYSÉG VIZSGÁLATA... 51 7.4. TORZÍTATLANSÁG VIZSGÁLATA... 52 8. IRODALOMJEGYZÉK... 53 1

1. Célkitűzés A biológiai hatóanyagok csoportjába tartozó vitaminok és karotinoidok jelenlétének kimutatása, illetőleg mennyiségük meghatározása a korszerű táplálkozás biztosításának érdekében mindenképpen szükséges minőségellenőrző feladat. Előfordulásuk, metabolitjaik, valamint mennyiségi megoszlásuk ismerete az állati és növényi sejtekben egyaránt jelentős az orvosi kutatás, a klinikai gyakorlat, a gyógyászat, de a mezőgazdaság és az élelmiszeripar számára is. A vitaminok a természetes anyagokban kis koncentrációban fordulnak elő, többnyire kötött formában, és olyan kísérő anyagokkal együtt, amelyek a meghatározásuk biztonságát és pontosságát csökkentik. A vitaminok analitikája éppen ezért bonyolult feladat. A használatban lévő nagyszámú módszer azt mutatja, hogy tökéletesen egyik sem felel meg az előírt követelményeknek, mint megbízhatóság, pontosság, gyorsaság és gazdaságosság. Az ELTE Állatrendszertani és Ökológiai Tanszéke cinke tojássárgájában lévő antioxidáns hatású karotinoidok és vitaminok koncentrációjának vizsgálatát tűzte ki célul, annak kiderítése érdekében, hogy mennyire tudják befolyásolni a tojók a tojások minőségén keresztül fiókáik életkilátásait. Ennek kapcsán egy tudományos együttműködés keretében az Elválasztástechnikai Kutató-Oktató Laboratóriumot kérte fel az analitikai feladat elvégzésére. Tekintettel a kis mintamennyiségre és a minták nagy számára munkám során célul tűztem ki, hogy a lehető leggyorsabb és a követelményeknek leginkább megfelelő minta-előkészítési és kromatográfiás eljárást dolgozzam ki. 2

2. Irodalmi áttekintés 2.1. Vitaminok és karotinoidok általános bemutatása 2.1.1. Vitaminok A vitaminok olyan biológiailag aktív szerves vegyületek, melyeket az emberi szervezet általában nem tud előállítani, energiát nem szolgáltatnak, de fontos szerepet töltenek be az anyag- és energiaforgalom lebonyolításában. Egyes vitaminok szerkezetileg hasonló anyagokból, ún. provitaminokból keletkeznek, például az A-vitamin esetén a karotinoidok (1. ábra) [1]. A-vitamin (retinol) β-karotin 1. ábra: Az A-vitamin és a β-karotin szerkezeti képlete Kémiailag egymástól jelentősen eltérnek, ezért csoportosításuk oldhatóságukon alapszik, így jellegüket és funkcionális szerepüket nem veszik figyelembe (1. Táblázat). Vízoldható vitaminok a B- és C-vitaminok. A C-vitamin változatlan formában hasznosul, míg a B-vitaminok kémiai módosítást szenvednek, és koenzimként funkcionálnak [1]. Az A-, D-, E-, K-vitaminok a zsíroldható vitaminok csoportjába tartoznak (2. Táblázat). 3

Vitamin Koenzim Tipikus reakció Avitaminózis B 1 (Timain) Tiamin-pirofoszfát Aldehid-transzfer Beriberi (súlycsökkenés, szívproblémák, idegrendszeri zavarok) B 2 (Riboflavin) Flavin-adenindinukleotid (FAD) Oxidáció-redukció Szájsebek, bőrgyulladás B 6 (Piridoxin) Piridoxal-foszfát Aminocsoport-transzfer (az Depresszió, zavartság, aminosavak bioszintézise és rángatózás lebontása során) Nikotinsav Nikotinamid-adenindinukleotid (NAD+) depresszió, hasmenés) Pellagra (bőrgyulladás, Oxidáció-redukció (niacin) Pantoténsav Koenzim A (CoA) Acil-csoport transzfer Magas vérnyomás Vörös foltok a H (Biotin) Biotin-lizin komplexek ATP-függő karboxilezés és szemöldök körül, (biocitin) karboxilcsoport transzfer izomfájdalom, álmos fáradtság (ritka) Folsav Tetrahidrofolát Vérszegénység, Egy szénatom (C1) fejlődési (magzati) transzfer, timin szintézis idegtubulus károsodás B 12 Metilcsoport szállítása, Vérszegénység, vészes 5 -Dezoxiadenozilkobalamin intramolekuláris vérszegénység, átrendeződések metilmalonsav acidózis Skorbut (duzzadt és C (aszkorbinsav) - Antioxidáns vérző fogínyek, bőr alatti bevérzések) 1. Táblázat: A vízoldható vitaminok csoportosítása Vitamin Funkció Avitaminózis A Antioxidáns Spermiumtermelés gátlása; sérülések az izmokban és idegekben (ritkán) D Angolkór (rachitis): csontdeformációk, hiányos Kalcium- és foszfátanyagcsere növekedés, csontlágyulás (felnőtteknél); puha szabályozása hajlékony csontok E A látásban, növekedésben és Szürkületi vakság, szaruhártya-károsodás, a légzési és szaporodásban játszik szerepet gyomor-bél traktus károsodása K Véralvadás Bőralatti vérzés 2. Táblázat: A zsíroldható vitaminok (lipovitaminok) csoportosítása 4

Kühnau az élettani hatás alapján két nagy csoportot különböztet meg, a prosztetikus vitaminokat és az induktív vitaminokat. Prosztetikus vitaminoknak tekinti azokat a vitaminokat, amelyek a szervezetben fehérjéhez kapcsolódva enzimként működnek, induktív vitaminoknak pedig azokat, amelyek nem minden élő szervezet számára nélkülözhetetlenek, elsősorban a felsőbbrendű állati szervezetekben töltenek be még teljesen fel nem derített szerepet [2]. A prosztetikus és az induktív vitaminok eltérő tulajdonságait a 3. Táblázat mutatja be. Prosztetikus vitaminok Inuktív vitaminok Csoporttagok B- és K-vitaminok A-, C-, D-, E-vitaminok Természetes előfordulásuk Általános Csak bizonyos sejtekben és magasabb rendű szervezetekben Az átépítési (intermedier) anyagcserében nélkülözhetetlenek Csak sajátos feladatok teljesítésében vesznek részt Szerepük Létfontosságúak Nem feltétlenül létfontosságúak Koenzimek részei Nem vesznek részt a koenzimek felépítésében Szöveti koncentrációjuk Állandó Erősen változó Előfordulásuk a vérben Főképp az alakos elemekben Leginkább a plazmában Szintézisük a szervezeten Egyeseket a bélbaktériumok állítják belül elő A bélben nem szintetizálódnak Működésük gátlásának Minden vitamin antivitaminja lehetősége ismeretes Antivitaminjaik nem ismertek Vitamin-túladagolás (hipervitaminózis) Valódi hipervitaminózis nem ismert Túladagolás lehetősége fennáll 3. Táblázat: Vitaminok csoportosítása élettani hatás alapján A tudományok fejlődésével egyre több induktívnak tartott vitamin prosztetikus sajátságai váltak bizonyítottá (A-, C-, E-vitaminok). Az a tény is megállapításra került, hogy az induktív vitaminok csoportjába tartozó hatóanyagok szerepét több, hasonló szerkezetű vegyület is képes ellátni, melyeket izotel vagy vitamer anyagoknak neveznek [2]. 5

2.1.2. Karotinoidok A karotinoidok zsírban oldódó természetes eredetű pigmentek. A karotinoid elnevezés a sárgarépa latin nevéből ered (Daucus carota). A nyolc izoprén egységből felépülő karotinoidok közös szerkezeti sajátossága a folytonos konjugációt alkotó polién struktúra. Eddig kb. 600-féle karotinoidot azonosítottak, melyek közül a természetben leggyakrabban és legnagyobb mennyiségben a β-karotin fordul elő. A karotin három hasonló szerkezetű vegyület, az α-, β- γ- karotin keveréke (2. ábra). α-karotin β-karotin 2. ábra: Az α-karotin és β-karotin szerkezeti képlete Hasonló szerkezetű a paradicsom piros színanyaga a likopin (3. ábra). Mindkét láncvége nyitott, de gyűrűzáródással α- ill. β-ionon gyűrűt alkothat, hasonlóan a karotinizomerek láncvégeihez. Likopin 3. ábra: A likopin szerkezeti képlete 6

A karotinoidok a növény és állatvilágban nagyon elterjedtek, különösen nagy mennyiségben fordul elő néhány oxigéntartalmú származékuk, például a lutein, zeaxanthin és a β-kriptoxantin [2]. A karotinoidok szoros értelemben nem tekinthetők vitaminnak, de sokuk szolgál az A-vitamin előanyagaként. Az emberi szervezet a β-karotinból tud legkönnyebben A- vitamint előállítani. Az A-provitamin karotinoidok, amelyek legfontosabb képviselői az α-, β-, γ-karotin és a kriptoxantin, feltételezhetően a bélfalban alakulnak át a következő reakció értelmében: C 40 H 56 + 2 H 2 O β-karotin dioxigenáz 2 C 20 H 29 OH retinol A keletkező vitamin védelmét a megfelelő mennyiségben szükséges természetes antioxidánsok, a tokoferolok jelenléte biztosítja [2]. A karotinoidoknak eleinte csak provitamin szerepet tulajdonítottak, azonban ma már bizonyított az oxigén- és elektron-szállítási, illetve peroxid-képző funkciójuk. Daganatos betegségek széles körében végeztek tanulmányokat az egyes karotinoidok preventív hatásának kimutatására. Feltételezhető, hogy hatással vannak a sejtek differenciálódására és burjánzására. Mivel a daganatképződés alapvetően a sejtek életműködésének osztódási zavara, ezért a sejtek retinoid és karotinoid tartalma befolyásolhatja a daganatképződésre való hajlamot. Kutatások azt mutatják, hogy az egyes daganattípusoknál más-más vegyület bizonyult hatásosnak [3]. Az egészséges emberi szem rendelkezik a szervezet saját antioxidáns védelmi rendszerével. Ennek részei a sárgafoltban megtalálható lutein és a zeaxantin, az antioxidáns hatású C és E vitamin, valamint az antioxidáns enzimek alkotóelemei, a cink és a szelén. Bizonyos körülmények között a lutein és zeaxantin kiszűrik a káros sugarakat. Az idő előrehaladtával azonban ezen karotinoidok koncentrációja csökken a szemben, így helyes étrenddel pótolni kell őket. A karotinoidok azáltal, hogy hatástalanítani tudják az UV-sugárzás hatására keletkezett szabadgyököket, bőrünk védelmét is elősegítik a napsugárzással szemben [3]. Az egyes karotinoidok forrásai nagyrészt fedik egymást. β-karotin legnagyobb mennyiségben a sárga, narancssárga, sötétzöld zöldségekben és gyümölcsökben fordul elő. Ilyen például a kelkáposzta, sárgarépa, spenót, tök, sárgabarack, sárgadinnye és az őszibarack. Lutein és zeaxanthin forrásai a kelkáposzta, tök, spenót, endívia és a zeller. A narancs, mandarin, őszibarack és a papaya kriptoxantinban gazdag [4]. 7

2.1.3. A karotinoidok szerepe az énekesmadarak fajfenntartásában A kilencvenes évek kutatásai azt mutatták, hogy lehetőség van a tojó számára a szülői ráfordítás változtatására a tojások minőségén keresztül is. Hubert Schwabl kimutatta, hogy a kanári tojók tojásaikba eltérő mennyiségű tesztoszteront juttathatnak, amivel bizonyos mértékig szabályozni tudják utódaik életkilátásait [5]. A magas tesztoszteron koncentrációjú környezetben fejlődő fiókák erőteljesebbek voltak társaiknál, élénkebben kérték a táplálékot, és végeredményben nagyobb kirepülési súlyt értek el, mint társaik. Általános jelenség a gerincesek körében, hogy az ikrák, a peték és a tojások sárga színűek, ami a karotinoid tartalmuk következménye. Kutatások bizonyítják, hogy a madártojások karotinoid tartalma erősen függ a táplálékban lévő karotinoidok hasznosíthatóságától. Azt is kimutatták, hogy ezek a molekulák kiváló szabadgyökfogók, és megakadályozzák a fejlődő embrió biológiailag aktív membránjainak károsodását az agyban és a májban [6]. A tojássárgájában lévő karotinoidok mennyisége és minősége tehát, hasonlóan a tesztoszteronhoz, befolyásolhatja az embrió további életkilátásait. Korábbi vizsgálatokból már kiderült, hogy a karotinoid-felvétel energiaigényes folyamat, illetve a tojónak a rendelkezésére álló karotinoid-mennyiséget meg kell osztania saját élettani folyamatai és az embriók szükségletei között. A fészekalj tojásainak karotinoid mintázata tehát egy komplex folyamat eredménye. Fontos szerepet tölt be a tojó táplálékszerző képessége, egészségi állapota, tapasztalata és feltételezhetően a szociális környezet is. Török János és munkatársainak vizsgálatai megerősítették, hogy a kis szárnyfoltú hímek fészekaljaiban a tojássárgája szignifikánsan vörösebb színárnyalatú, mint a nagy szárnyfoltúakéban. Eredményeik azt mutatták, hogy a tojók akkor fektetnek többet a tojás minőségét javító biológiailag aktív molekulák bevitelébe, amikor párjuk nem rendelkezik költési tapasztalattal, azaz rossz minőségű szülő [7,8]. Mind a tesztoszteron, mind a karotinoidok többféle mechanizmus által életerős, egészséges fiókák kelését eredményezhetik, amelyek táplálékkérő aktivitása az átlagosnál élénkebb. 8

2.2. A tojás összetétele A tojás közel háromnegyede víz, a szárazanyag tartalom kb. 96%-a szerves vegyület (fehérjék, zsírok, természetes festékek és elenyésző mennyiségű szénhidrát), a fennmaradó részt pedig az ásványi anyagok teszik ki [5]. A fehérje és a sárgája összetevőinek megoszlását mutatja a 4. ábra. 4. ábra: A fehérje és a sárgája összetevőinek megoszlása A tojásfehérje gyakorlatilag zsírmentes, azaz a tojás zsírtartalmának egészét a sárgája adja. A tojók tápláléka nem befolyásolja a tojásfehérje és a sárgája mennyiségét, viszont ásványi anyag és vitamintartalmát meghatározza. 9

2.3. Minta-előkészítési módszerek bemutatása A vitaminok a sejtekben, szövetekben általában kötött formában vannak jelen. A zsíroldható vitaminok lipidekhez vagy fehérjékhez, a vízoldható vitaminok enzimfehérjéhez kötve, mint észterek fordulnak elő. A vitaminok vizsgálatánál a főbb lépések az alábbiak: 1. Mintavétel 2. Kötött formából történő felszabadítás 3. Extrakció 4. Elválasztás a zavaró szennyezőktől 5. Azonosítás 6. Mennyiségi meghatározás A meghatározások gyakorlati és elméleti értékét a mintavétel jelentősen befolyásolja, mivel a vitaminok az állati és növényi szövetek különböző részeiben igen eltérő koncentrációban fordulnak elő. Így nem reprezentatív mintavétel esetén extrém nagy vagy kis értékhez juthatunk. A vitaminok felszabadítására a sejteket elroncsolják és felaprítják. A feltárási és további műveleteket a lehető leggyorsabban és alacsony hőmérsékleten végzik, annak érdekében, hogy az enzimek káros hatást ne fejtsenek ki, így a meghatározás pontosságát egyáltalán ne befolyásolják. Oxigénérzékeny vitaminoknál inert atmoszférában, fényérzékenyeknél szűrt fénynél, vagy fénytől teljesen elzárt helyen kell a mintákat feldolgozni. A feltárást és a homogenizálást kíméletesen kell végrehajtani, mert a komponensek degradálódhatnak és fémionok jelenétében oxigén hatására autooxidációs folyamat játszódhat le. Vízoldható vitaminoknál a felszabadítást hidrolízissel végzik. B- vitaminoknál és biotinnál savas hidrolízist, folsav és pantoténsav esetén enzimes bontást alkalmaznak. Zsíroldható vitaminok közül az A, D, E alkalikus közegben stabil. A K- vitaminok mind savas, mind lúgos beavatkozásra érzékenyen reagálnak [9]. Feladatom a szabad vitaminok és karotinoidok meghatározása volt, így elszappanosítási (feltárási) lépés nem volt szükséges a minta-előkészítés során. A zsíroldható vitaminok extrakciójánál peroxidmentes oldószerekkel dolgozunk. Fontos az extrahálószer hőmérsékletének pontos megválasztása, mivel növekvő hőmérsékleten a kalciferolok még inert atmoszférában is jelentős mennyiségben 10

alakulnak át [10]. A vízoldható vitaminok a vizsgálandó anyag vizes oldatából könnyen kinyerhetők, ha már szabad állapotban vannak. Sokáig az oszlopkromatográfiát alkalmazták tisztításra. Napjainkban azonban a szilárd fázisú extrakciós töltetekkel lényegesen gyorsabban elvégezhető ez a lépés. 2.3.1.1. Lehetséges minta előkészítések szabad vitaminok és karotinoidok meghatározására 2.3.1.1.1. Protein kicsapás és oldószeres extrakció A fehérjék kicsapása elvégezhető oldószeres, illetve savas vagy lúgos közegben kicsapással. Az oldószeres kicsapásnál a leggyakrabban alkalmazott oldószerek az aceton, acetonitril, metanol és az etanol. Hátránya ennek módszernek, hogy dúsítási lépés alkalmazása nélkül csökken a kimutatási határ, mivel a minta jelentősen hígul. Gyakran előfordulhat, hogy oldószerváltást kell alkalmazni, az apolárisabb oldószer miatt, hogy folyadékkromatográfiásan injektálható legyen a minta. A savas/lúgos kicsapásnál minimális a hígulás, tiszta a felülúszó valamint könnyen centrifugálható. Hátránya azonban, hogy az extrém ph érték miatt nehéz semlegesíteni, magas az ionerősség, a vegyület instabillá válhat, és az analitikai oszlop stabilitása is csökkenhet az alacsony vagy magas ph értékeknél. A protein kicsapást követően az extrakció során a mintához megfelelő szerves oldószert adva, és rázatva a szerves komponensek a vizes fázisból a szerves fázisba kerülnek. A kicsapott fehérjék lecentrifugálásával a fázisok elválaszthatók. Ezután a szerves fázist dúsítják, mely során az oldószer nagyobb részét eltávolítják (pl.: bepárlással). 2.3.1.1.2. Mátrix szilárd fázisú diszperzió A mátrix szilárd fázisú diszperzió (MSPD: Matrix Solid Phase Dispersion) a szilárd fázisú extrakció (SPE: Solid Phase Extraction) egy speciális fajtája. A folyadékfolyadék extrakció (LLE: Liquid-Liquid Extraction) lehetséges alternatívájaként alakult ki. Rendszerint alumínium-oxid, magnézium-szilikát vagy módosított szilikagél (C8, C18, amino, ciano) fázisokat alkalmaznak. Kifejezetten szilárd, félkemény és meglehetősen viszkózus biológiai minták előkészítésére, extrakciójára és a komponensek elválasztására (frakcionálására) alkalmas analitikai eljárás. Olyan alapvető fizikai és 11

kémiai elveken alapul, mint például a mechanikai keverés, ami a minta összezúzását, a mátrix és a töltet érintkezését eredményezi. A kötött fázisú (pl.: oktadecil-szilillel módosított szilika) szilárd hordozót és a biológiai mintát dörzsöléssel diszpergálják. A homogenizált mintát pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM: Scanning Electron Microscopy) vizsgálva azt tapasztalták, hogy a minta szerkezete teljesen szétroncsolódik, és a mátrix komponensek szétoszlanak a hordozó felületén egy kb. 100 µm vastag fázist alkotva. Népszerűségének oka, hogy sok komplikációt kiküszöböl, ami a szilárd vagy félkemény minták folyadék-folyadék és szilárd fázisú extrakciójánál adódik. Kevesebb oldószert igényel, és az extrakció során nem lép fel emulzióképződés. A mintaelőkészítés során a minta komponenseinek egy nem viszkózus, tiszta és homogén oldatba kell kerülniük, hogy esetlegesen további tisztítási, vagy dúsítási lépést lehessen elvégezni rajtuk. Sok biológiai minta, mint a vizelet, vér, plazma vagy szérum, egyből rákerülhetnek a SPE töltetre, azonban sok minta nem vihető fel közvetlenül. Ilyen minták például az állati vagy növényi szövetek. Ezeknek a mintáknak a hagyományos mintaelőkészítése egy aprítási lépéssel kezdődik, ezt követi az oldószer, sav, bázis, puffer, só, detergens és/vagy kelátképző hozzáadása annak érdekében, hogy a minta szerkezetét és sejtjeit minél inkább megbontsák, és lehetővé tegyék az extrakciót. A feltárási folyamat során előfordulhat, hogy emulzió képződik. Ezt követően gyakran szűrni vagy centrifugálni kell a mintát, sőt előfordulhat többszöri extrakció és centrifugálás is, míg a minta alkalmassá válik a további tisztításra. Az MSPD kiküszöböli ezeket a komplikációkat azáltal, hogy a minta előzetes kezelés nélkül összekeverhető a töltettel. Így összességében egy lépésben elvégezhető a fehérjék denaturálása, a minta extrakciója, a centrifugálás/szűrés és a tisztítás [10]. A MSPD minta-előkészítési lépéseit az alábbi ábra szemlélteti (5. ábra). 12

5. ábra: Az MSPD módszer ábrázolása Az irodalomban több helyen találkoztam a mátrix szilárd fázisú diszperzióval tojásminták előkészítésére, azonban többnyire peszticidek [11] és szulfonamidok [12,13] meghatározására használták. Karotinoidok és vitaminok mérése során is alkalmazták már ezt a technikát, élelmiszerek [14] zöldségek [15,16,17,18], gyümölcsök [16], tejtermékek [19], fogkrém [20], ínyszövet [21] és retina [21,22] minták előkészítésére. 13

2.4. Mennyiségi meghatározásra alkalmas analitikai módszerek A kémiai- és fizikai-kémiai eljárások között a kémiai meghatározások olyan reakciókon alapulnak, amelyek során jól mérhető elszíneződés vagy fluoreszcencia lép fel. Az értékelés kolorimetriásan, fotometriásan vagy fluorimetriásan történik. A fizikaikémiai eljárások az egyes vitaminokra jellemző fizikai állandók meghatározásán alapulnak. Ilyen módszerek: a fluorimetria, polarográfia, mágneses magrezonancia, radioizotópok felhasználása, stb. A fizikai-kémiai eljárások óriási fejlődését jelentette a kromatográfia, amely víz- és zsíroldható vitaminok, prosztetikus és induktív vitaminok vizsgálatára egyaránt alkalmas. 2.4.1. Kromatográfiás módszerek 2.4.1.1. Vékonyrétegkromatográfia A vitamin-analitikában a rétegkromatográfiához az adszorpciós, megoszlásos eljárásokon kívül alkalmazható a komplexképzés ezüst-nitráttal impregnált lemezen, a poliamid és az ioncserélő kromatográfia is. Az elválasztást a vitaminok és egyéb hatóanyagok láthatóvá tétele, mennyiségi értékelés denzitométerrel vagy egyéb elúció utáni meghatározással. A legtöbb vékonyréteg-kromatográfiás módszer, amit a szakirodalomban közöltek a zsíroldható vitaminok körében történt. Ennek valószínűleg az a magyarázata, hogy a B- vitaminok meghatározására jól kidolgozott mikrobiológiai eljárások álltak rendelkezésre, a zsíroldható vitaminok vizsgálatára azonban kevés módszer volt ismert [10,23] 2.4.1.2. Gázkromatográfia A vitaminok közül az E-vitamin származékolást követően meghatározható gázkromatográfiás technikával is. Az irodalomban találkoztam trimetil-szilillel származékolt tokoferolok GC-FID analízisével [24] valamint GC-MS módszerrel, melynek során N,O-bis(trimetil-szilil)trifluoracetamidot (BSTFA) és trimetilklórszilánt alkalmaztak származékolószerként [25]. 14

Mivel a karotinoidok meglehetősen oxigén, fény- és hőérzékeny anyagok, ezért sok esetben fontos bomlástermékeik (norizoprenoidok) vizsgálata. Ilyen esetekben az irodalomban pirolízis GC-MS technikát alkalmaztak [26]. A karotinoidok hőérzékenységük miatt gázkromatográfiásan nem vizsgálhatók, ezért számomra ez a technika nem volt alkalmas. 2.4.1.3. Nagy hatékonyságú kromatográfia A folyadékkromatográfia olyan elválasztástechnikai módszer, mely a komponenseknek két egymással nem elegyedő fázis közötti eltérő megoszlásán alapul, ahol a mozgófázis folyadék. Az elválasztás a mozgófázisnak a kolonnában elhelyezkedő állófázissal való érintkezése során valósul meg. Az érvényesülő mechanizmusok alapján számos fajtája létezik: adszorpciós, ioncserés, méretkizárásos, affinitási, zárvány komplex (királis), stb. [27]. A nagyhatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC: High Performance Liquid Chromatography) az oszlopkromatográfiának egyik továbbfejlesztett változata. A hatékonyabb elválasztás érdekében egyre kisebb szemcseátmérőjű töltetek jelentek meg, azonban a részecskék átmérőjének csökkenésével az oszlop hidrodinamikai ellenállása is megnőtt, így a folyadékfázis áramlása lelassult. Ennek kompenzálására olyan pumpákat alkalmaztak, melyek a mozgófázist folyamatosan és pulzálásmentesen több száz bar nyomáson képesek áramoltatni az oszlopon. Egy átlagos HPLC-s töltet szemcseátmérője 5 µm, és a pumpa általánosan 400 bar nyomásig üzemeltethető. Az utóbbi pár évben megjelentek még magasabb nyomáson működő rendszerek, mint az RRLC (Rapid Resolution Liquid Chromatograph, Agilent, 600 bar) és az UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatograph, Waters, 1000 bar). A normál és fordított fázisú folyadékkromatográfia során kötött fázisú tölteteket alkalmaznak. Ezen tölteteknél fontos, hogy lehetőség szerint inaktív, kémiailag stabil, mechanikailag szilárd, homodiszperz méreteloszlású legyen. Az előállításuk során a szferoid hordozó szemcsékre kovalens kötéssel különböző szerkezetű és polaritású funkcionális csoportokat kötnek. A hordozó kezdetben szilikagél volt, mára azonban egyre inkább elterjednek a polimer alapú szemcsék. A kötött állófázisok a szemcsék felületén porózus réteget képeznek, ezzel növelve a fajlagos felületet és a kötési kapacitást, valamint az anyagátadási folyamatot (diffúziót) is elősegítik. 15

A kémiailag kötött állófázisok a hordozó szemcsékre felvitt funkcionális csoportok poláris v. apoláris tulajdonságainak megfelelően normál és fordított fázisú csoportokba sorolhatók. Normál fázisok a nem módosított töltetek, a ciano (-CN), amino ( NH 2, - NH), dimetil-amino (-N(CH 3 ) 2 ), diol (-OH) és nitro (-NO 2 ) csoporttal módosított töltetek. A fordított fázisú töltetek szemcséin leggyakrabban C 2-4, C 8, C 18 tagszámú paraffinláncok, illetve fenil, etil, i-propil, stb. apoláris csoportok találhatók [28]. Azt azonban, hogy normál vagy fordított fázisú kromatográfiáról beszélünk, önmagában nem a töltet minősége szabja meg, hanem az álló és a mozgó fázisok egymáshoz viszonyított polaritása. Normál fázisú kromatográfia esetén a mozgófázis minden esetben apolárisabb az alkalmazott állófázisnál, fordított fázisú kromatográfiánál pedig az állófázis az apolárisabb [29]. Azok a karotinoidok, melyeken hidroxil-csoport is található mind normál [23,30] mind fordított fázisú [23,31-38] folyadékkromatográfiával elválaszthatók. Normál fázis esetén leggyakrabban szilika az állófázis és hexánt alkalmaznak eluensként. Az irodalomban sok helyen találkoztam C 18 -as fordított fázisú elválasztással is [23,31,32,33,34], de karotinoid és vitamin izomerek elválasztására több irodalom is C 30 - as töltetű oszlopot javasolt [23,35,36,37,38]. 2.4.2. Detektálási módszerek 2.4.2.1. Fluoreszcens spektrofotometria A természetesen fluoreszkáló vegyületek többsége többgyűrűs aromás szénhidrogén, melyek konjugált elektronrendszert tartalmaznak. Fluoreszcencia jelensége akkor lép fel, mikor fény hatására a molekula gerjesztett állapotba kerül, majd úgy jut vissza alapállapotba, hogy közben fényt emittál. A besugárzás és az emisszió között rövid idő (10-15 s) telik el [29]. A mérendő vegyületek közül csak az A- és E-vitamin mérhető fluoreszcens detektálással. Az A-vitamin 325 nm hullámhosszú fénnyel való gerjesztés esetén 470 nm-es emissziós maximumon, az E-vitamin pedig 295 nm-en gerjesztve 330 nm-en fluoreszkál [39]. Mivel a célom az volt, hogy egy módszerrel határozzam meg az összes komponens koncentrációját, így ez a detektálási mód számomra nem alkalmas. 16

2.4.2.2. Tömegspektrometria Mind a karotinoidok, mind a vitaminok meghatározása lehetséges tömegspektrometriás detektálással. A karotinoidok esetén az ionizációs módszerek közül az atmoszférikus kémiai ionizáció jöhet csak szóba, mivel nagyon apoláris tulajdonságú vegyületek. A vitaminok mérése azonban lehetséges elektrospray technikával. Munkám során lehetőségem volt egy Agilent hármas kvardupól analizátorral felszerelt tömegspektrométert alkalmazni, mely egy speciális ionforrással (Multimode source) volt felszerelve (6. ábra). Ez az ionforrás képes szimultán atmoszérikus kémiai ionizációra (APCI: Atmospheric Pressure Chemical Ionization) és elektrosray ionizációra (ESI: Electrospray Ionization). 6. ábra: A speciális ionforrás felépítése 2.4.2.3. UV-VIS spektrofotometria Az UV-VIS spektrofotometria fényelnyelésen alapuló optikai módszer, melynek során a mintát meghatározott hullámhosszú és intenzitású fénnyel megvilágítva mérjük az abszorpció mértékét. Az elnyelési hullámhossz meghatározásával minőségi analízisre van lehetőség, míg az abszorbancia mértékének (extinkció) mérésével számolható az anyag koncentrációja. UV-VIS spektrofotometriás meghatározás esetén a karotinoidok elnyelését 450 nm-nél, a retinolét 325 nm-nél, az α-tokoferolét pedig 295 nm körül mérték [31-38]. 17

2.4.2.4. Diódasoros detektálás Többcsatornás detektorok azok az UV vagy UV-VIS tartományban működő spektrofotometriai érzékelők, amelyek különböző hullámhosszakon egy időben több kromatogramot képesek felvenni, valamint lehetőség van spektrum felvételére és bizonyos spektrumfeldolgozásra is. Egy részük alkalmas korlátozott csúcstisztaság vizsgálatra. A diódasoros detektoron (Diode Array Detector) azokat a többcsatornás detektorokat értjük, amelyek adott beállítási paraméterek mellett idő, intenzitás, hullámhossz adat-együttest gyűjtenek, az adatokat számítógépen tárolják, és mérés után korlátozás nélküli adatfeldolgozást tesznek lehetővé. Az analitikai módszer fejlesztése során ez a detektálási módszer bizonyult a legalkalmasabbnak [29]. 18

3. Kísérleti rész 3.1. Standard oldatok és a belső standard megválasztása Az alábbi vegyületeket vizsgáltam: α-karotin, β-karotin, β-kriptoxantin, likopin, lutein, zeaxantin, retinol és α-tokoferol. Szerkezetüket és CAS számukat a 1. Függelék tartalmazza. A karotinoid referencia anyagokat szilárd formában álltak rendelkezésemre. Analitikai pontossággal 100 µg/cm 3 koncentrációjú törzsoldatokat készítettem diklórmetánnal komponensenként; az oldatokat mélyhűtőben tároltam. A vitaminokból nagyobb mennyiség állt rendelkezésemre, ezért nagyobb koncentrációjú törzsoldatot készítettem (1 mg/cm 3 ) diklórmetánnal. Mivel a karotinoidok mennyisége kisebb a tojásban, mint a vitaminoké, ezért két kalibráló oldatsorozatot készítettem különböző koncentráció tartományban (karotinoidok: 0,1-10 µg/cm 3, vitaminok: 5-500 µg/cm 3 ). Az irodalom áttekintése alapján az echinenon és az asztaxantin jött szóba mint alkalmas belső standard [31,33]. Tekintetve a mérendő minták magas számát (200 db) és az echinenon igen magas árát, az astaxanthin mellet döntöttem. Az irodalmak alapján feltételeztem, hogy a tojássárgájában nincs astaxanthin, és ezt később a méréseim is bizonyították. 19