DNS VIZSGÁLATOK AZ IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANBAN

DNS VIZSGÁLATOK AZ IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANBAN D O K T O R I É R T E K E Z É S Dr. LÁSZIK ANDRÁS Budapest 2001 TARTALOMJEGYZÉK

2 1. BEVEZETÉS 8 2. CÉLKITŰZÉS 9 3. IRODALMI HÁTTÉR 10 3.1. A DNS molekula szerkezete és felépítése, stabilitása 10 3.2. A humán genom szerveződése, mutációk, polimorfizmusok 12 3.2.1. Miniszatelliták 15 3.2.1.1. Multi- és single lokusz szondák 16 3.2.1.2. Amplifikálható hossz-polimorf lokuszok 17 3.2.2. Mikroszatelliták 17 3.2.2.1. Short tandem repeat lokuszok 18 3.2.2.1.1. Autoszomális lokuszok 18 3.2.2.1.2. Y kromoszómális lokuszok 20 3.2.3. Szekvencia polimorfizmus 22 3.3. A DNS molekula kinyerése, tisztítása 23 3.4 A DNS polimorfizmusok vizsgálatában alkalmazott módszerek 24 3.4.1. Restrikciós fragmens hossz-polimorfizmus (RFLP) 24 3.4.2. DNS polimeráz enzimmel végzett sokszorosítás (PCR) 25 3.5. A vizsgálati eredmények detektálása 27 3.6. Mutációk és polimorfizmusok 28 3.7. Spermakimutatás előtesztek 30 3.8. A DNS vizsgálatok jelentősége az igazságügyi orvostanban 30 3.9 Statisztikai elemzések 32 4. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 35 4.1. A DNS molekula stabilitásának vizsgálata 35 4.2. Az YNZ24 és az ACTBP2 lokuszok populációgentikai vizsgálata 39 4.3. A DYS 19, DYS 390 és a DYS 389 lokuszok mutáció analízise 43 5. EREDMÉNYEK 48 6. MEGBESZÉLÉS 56 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 59 8. IRODALOMJEGYZÉK 60

3 9. AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁVAL KAPCSOLATOS SAJÁT KÖZLEMÉNYEK BIBLIOGRÁFIAI ADATAI 68 10. FÜGGELÉK 70

4 ÖSSZEFOGLALÁS DNS VIZSGÁLATOK AZ IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANBAN Szerző: Dr. Lászik András Témavetető: Dr. Falus András egyetemi tanár Készítés helye: Budapest, Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Program: A humán molekuláris genetika és a géndiagnosztika alapjai Az elmúlt évtized eredményei, mint az emberi genetikai állomány teljes feltérképezésének elindítása, valamint az új molekuláris biológiai módszerek bevezetése lehetővé tették a molekuláris biológia alkalmazását az igazságügyi orvostani gyakorlatban is. A hagyományos szerológiai elemzés az egyedi jellegeket a fehérjék, míg a DNS analízis ezeket már közvetlenül az örökítő anyag szintjén vizsgálja. A DNS analízis alkalmazásának két fő területe az igazságügyi orvostanban a származás megállapítás és a bűnügyekben biztosított biológiai nyomok alapján végzett személyazonosítás. E dinamikusan fejlődő új, objektív vizsgáló módszerrel a személyazonosítással és származás megállapítással kapcsolatban olyan fontos kérdésekre kaphatunk választ, melyeket az eddig rendelkezésre álló vizsgálati eljárásokkal nem lehetett eredményesen megválaszolni. Vizsgálataink célja az volt, hogy adatokat nyerjünk a DNS molekula egy speciális külső környezeti hatásra bekövetkező változásairól és azok jellegéről, két polimorf lokusz különböző populációk közötti allélmegoszlásáról és három Y kromoszómális lokusz meiozis során bekövetkező mutációs gyakoriságáról. Eredményeink szerint a kémiai előkezelést nem igénylő elemanalizátorral összekapcsolt scanning elektronmikroszkópos vizsgálat során a spermiummintákba zárt DNS molekulák az elektronsugárzás behatási idejével arányos, kifejezett károsodást szenvedtek el. A napjainkban használt molekuláris biológiai módszerekkel azonban eredményesen amplifikálhatók és tipizálhatók maradtak, ill. nem eredményeztek téves tipizálást sem. További vizsgálataink során az irodalomban először végeztük el a jelenleg legpolimorfabb mikroszatellita lokusz populációgenetikai vizsgálatát négy kontinens nyolc népességénél. A nyert adatainkkal bizonyítottuk, hogy e lokusz magas polimorfizmusa miatt kiválóan alkalmazható az

5 igazságügyi hemogenetikai gyakorlatban, mind a származás-megállapítás, mind pedig a személyazonosítás területén egyaránt. Az Y kromoszóma három polimorf lokuszán elvégzett mutációanalízissel bizonyítottuk ezen régiók alkalmazhatóságát főként az ún. deficiens esetek vizsgálatánál.

6 SUMMARY DNA TECHNOLOGY AND ITS APPLICATION IN FORENSIC MEDICINE Author: András Lászik, M.D. Tutor: András Falus, Ph.D, D.Sc School of Ph.D Studies of Semmelweis University Scientific research of the last decade including the introduction of new molecular biological methods and mapping of the human genome allowed the development of a revolutionary new molecular biological approach in forensic medicine. The traditional serological methods study proteins, the new DNA analysis goes further down to studies DNA structures to analyze unique individual features. The two main areas of DNA application in forensic medicine are inheritance studies and identification in criminal cases using biological remnants. Using this new, reliable and reproducible DNA method we can answer questions they were almost impossible in the past. The goals of our studies were: to obtain data on changes of DNA molecule on a specific external environmental condition, on allele distribution of two polymorph loci in different populations and occurrence of mutation of three Y-chromosomal loci during meiosis. According to our results, during X-ray diffraction elemental analysis the DNA molecules of sperms, they suffer damage proportional to the time of irradiation. Using new molecular biological methods these damaged sperms can still be used for amplification and can be typed, no false typing has occurred. Our further studies, first time in the scientific literature we genetically examined the most polymorph locus population in 8 racial groups of 4 continents. The data obtained proved that this locus could be used in ancestry and identification cases due to its high polymorphism. Our mutation analysis on three different polymorph loci of Y chromosome showed excellent usefulness of these regions mainly in the so-called deficient cases.

7 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AA A.L.F. APS BIS BSA Cy5 dntp DNS DTT DMSO EDTA Exp. FAM GEDNAP HEX JOE mtdns Obs. PAA PDA POP ROX SDS STR TAMRA TEMED UP UV akrilamid Automata Lézer Fluorescens DNS szekvenáló ammónium peroxid szulfát N,N-metilén biszakrilamid bovin szérum albumin indodikarbocianin-5 - foszforamidit dezoxiribonukleozid-trifoszfát dezoxiribonulkeinsav dithiotreitol dimethyl-sulfoxid etiléndiamin-tatraacetát várható fluorescens festék (kék) german DNA profiling fluorescens festék (zöld) fluorescens festék (zöld) mitokondriális DNS megfigyelt poli-akrylamid piperazin diakrylamid performance optimised polymer fluorescens festék (piros) nátrium dodecil szulfát rövid ismétlődési egység (short tanden repeat) fluorescens festék (sárga) N,N,N,N tetrametilén-diamin ultra tiszta (ultra pure) ultraviola

8 1. BEVEZETÉS A polimorf markerek használata az igazságügyi kérdések megoldásában korántsem új keletű, azonban a használható markerrendszerek limitált elérhetősége jó ideig nem volt megoldott. A XIX. század elején egy francia kutató azt állította magáról, hogy képes pusztán a szaguk alapján megkülönböztetni állati és emberi vérnyomokat, sőt az utóbbiaknál a nemeket is el tudja különíteni (4). Századunk elején az igazán nagy áttörést a Landsteiner és Wiener által felfedezett, szabályszerűen öröklődő AB0 vércsoportok jelentették, melyet számos, közel hasonló, kevéssé polimorf rendszer felfedezése követett (33). Közülük néhány azok környezeti hatásra bekövetkező változása miatt téves következtetések levonásához is vezetett (54). További hátrányuk az volt, hogy nagy részük csupán a vérben volt megtalálható (3). Az elmúlt évtized eredményei, mint az emberi genetikai állomány teljes feltérképezésének elindítása, valamint az új molekuláris biológiai módszerek bevezetése lehetővé tették a molekuláris biológia alkalmazását az igazságügyi orvostani gyakorlatban is. A hagyományos szerológiai elemzés az egyedi jellegeket a fehérjék, míg a DNS analízis ezeket már közvetlenül az örökítõ anyag szintjén vizsgálja. A DNS analízis alkalmazásának két fő területe az igazságügyi orvostanban a származás megállapítás és a bűnügyekben biztosított biológiai nyomok alapján végzett személyazonosítás. Az igazságügyi orvostani esetek vizsgálatakor a DNS technika a radiológiai, szövettani, toxikológiai vizsgálatok mellett mára az egyik legfontosabb boncolást kiegészítő vizsgálat lett. E dinamikusan fejlődő új, objektív vizsgáló módszer által kínált lehetőségekkel a személyazonosítással és származás megállapítással kapcsolatban olyan fontos kérdésekre kaphatunk választ, melyeket az eddig rendelkezésre álló vizsgálati eljárásokkal nem lehetett eredményesen megválaszolni.

9 2. CÉLKITŰZÉS A vizsgálataink során célul tűztük ki annak vizsgálatát, hogy: 1./ az emberi szervezet különböző sejtjeiben fellelhető DNS molekulák kémiai szerkezetükből adódóan a rájuk ható a kísérleteink során alkalmazott szélsőséges környezeti hatásokat milyen módon viselik el. Integritásuk milyen mértékben változik meg és a továbbra is pontosan tipizálhatók maradnak-e az igazságügyi haemogenetikában napjainkban használatos molekuláris biológiai módszerekkel. 2./ az elektronmikroszkóppal vizsgált spermiumok DNS molekulái milyen fokú károsodást szenvednek a nagy energiával gyorsított elektronok becsapódása következtében és ez befolyásolja-e a kinyerhető DNS minőségét, mennyiségét, sokszorosíthatóságát (amplifikálhatóságát) ill. tipizálhatóságát. 3./ a D17S30 lokuszban és az ACTBP2 pszeudogénben foglalt sokszorosítható (amlifikálható) hosszpolimorfizmus, ill. mikroszatellita short tandem repeat (STR) polimorfizmusok alléljai milyen megoszlást mutatnak a magyarországi népességben és ezek a markerek alkalmasak-e személyazonosításra. Továbbá arra, hogy a talált jellegek mutatnak-e eltérést, ill. egyezést az eddig vizsgált populációkkal. 4./ a rendkívül polimorf ACTBP2 lokusz alléljai milyen módon oszlanak meg a vizsgált, egymástól földrajzilag távol álló populációkban, ill. szükség van-e ezen polimorf lokusz esetén a különböző népességek szerint történő adatbázisok létrehozására. 5./ az Y kromoszómán kapcsoltan öröklődő DYS 19, DYS 390 és a DYS 389-es lokuszok milyen mutációs rátával rendelkeznek és így alkalmasak-e származás megállapítási vizsgálatok végzésére, főként az un. deficiens esetek esetén.

10 3. IRODALMI HÁTTÉR 3.1. A DNS MOLEKULA SZERKEZETE, FELÉPÍTÉSE, STABILITÁSA 1944-ben Avery ismerte fel, hogy az örökítő anyag a DNS molekula. 1953-ban Watson és Crick röntgendiffrakciós eljárással fedezte fel a DNS kettős spirál szerkezetét. 1961- ben Nierenberg és Mattei megfejtette a genetikai kódot. 1977-ben Sanger és munkacsoportjának új módszerével lehetővé vált a DNS molekula bázissorrendjének meghatározása, a szekvenálás. A DNS molekula a hozzá kapcsolódó hisztonokkal a kromoszómák egységeit, a nukleoszómákat alkotja. Az egymás mellett elhelyezkedő nukleoszómákat az un. spacer DNS szakaszok és a hozzájuk kapcsolódó H1-es hisztonok kötik össze. Az egymás mellett elhelyezkedő nukleoszómák alkotják a kromatinszálakat. A DNS elsődleges szerkezete egy hossztengelye körül megcsavart létrára emlékeztet. A létra szárait dezoxiribóz-foszforsavlánc, fokait pedig mindössze négy különböző és páronként egymáshoz kapcsolódó nitrogéntartalmú molekulák, az un. bázisok alkotják. Ezek az adenin, a guanin, a timin, és a citozin. Az első kettő az egy gyűrűs purin-, az utóbbiak pedig a két gyűrűs pirimidin bázisok. Az adenint és timint két, a guanint és a citozint három laza hidrogénhíd kötés, míg a cukormolekulát a foszforsav molekulával erős kovalens foszfodiészter kötések kapcsolják össze. A DNS molekula alapkövei a dezoxiribózból, foszforsavból és egy bázisból álló nukleotidok. A bázisok egymás utáni sorrendje határozza meg a genetikai kódot ( 1. ábra ).

11 1. ábra. A DNS molekula szerkezete A DNS molekula kémiai szerkezetének köszönhetően jelentős hőmérséklet, ph, só, szerves oldószer és más szélsőséges környezeti hatásnak is ellenáll, ellentétben a szerológiai markerekkel. Stabilitása főként a környezet hőmérsékletétől, nedvességtartalmától és a mikroorganizmusok aktivitásától függ. Nedves, meleg környezetben a DNS molekula a bakteriális endonukleázok által gyorsan és szinte teljesen lebomlik, degradálódik, míg a szárazság kitűnően konzerválja. A fentiekből adódóan több ezer éves egyiptomi múmiából, gyantába zárt 30 millió éves rovarból és jégbefagyott ősállatokból is sikeresen lehetett használható DNS molekulákat izolálni. Száraz környezetben elfekvő csontokból, fogakból főként mitokondriális DNS technikával évtizedek, sőt évszázadokkal később is eredményes vizsgálat végezhető (45).

12 3.2. A HUMÁN GENOM SZERVEZŐDÉSE Egy felnőtt ember szervezete kb. 10 14 sejtből áll (50). Az örökítő anyag a DNS molekula a sejtmagban (genomiális DNS) és a mitokondriumokban (mitokondriális DNS) helyezkedik el. A sejtmagban a fehérjékhez hisztonokhoz kötött DNS molekulák alkotják a kromoszómákat. A testi sejtek csaknem mind diploidok, így 22 pár anyai és apai testi kromoszómát (autoszomát) és egy pár ivari a nemek meghatározásában szerepet játszó kromoszómát (gonoszómát) tartalmaznak. Az ivari kromoszóma lehet X vagy Y. Egy női egyed 2x22 autoszómát és két X gonoszómát, míg egy férfi 2x22 autoszomát, egy X és egy Y gonoszómát hordoz. Kivételt jelentenek például a poliploid sejtek, így a tetraploid májsejtek (92 kromoszóma), a sokmagvú izomsejtek és a mag nélküli vörösvértestek. A szervezet ivarsejtjei haploidok, így 1x23 kromoszómát tartalmaznak. A testi kromoszómákat alkotó DNS láncok hossza 250 55 Mb között mozog, míg az X ivari kromoszómáé kb. 140, az Y kromoszómáé pedig 60 Mb. A sejtmag genetikai állománya kb. 50.000 100.000 gént tartalmaz. A gének a DNS molekulák meghatározott szakaszai, melyek fehérjéket vagy RNS molekulákat kódolnak, különböző kifejezésformái az allélok. Ha a genetikai állomány egy helyén a szülőktől származó allél / gén szerkezet megegyezik homozigóciáról, ha különbözik heterozigóciáról beszélünk (58). Egy diploid kromoszómaszerelvény mag DNS molekulája 2x3x10 9 bázispárból áll. A legnagyobb kromoszóma kiegyenesített kettősspirálja kb. 8,5 cm hosszú lenne. A DNS molekulába foglalt összes szekvencia információjával több százezer könyvlapot lehetne megtölteni. Ellentétben a sejtmag DNS molekulájával, a mitokondriális DNS nincs szerkezeti fehérjékhez kötve. A sejtben akár több ezer kópiában van jelen, gyűrű alakú, 16569 bázispár hosszú, anyai öröklődésű és bázissorrendje pontosan ismert (2). A mitokondriális DNS molekula 37 gént tartalmaz, melyek a különböző RNS típusok közel kétharmadát és az oxidatív foszforilációban résztvevő enzimek génjeinek közel egy harmadát kódolják (36, 58).

13 A sejtmag DNS szerkezete Az emberi genetikai állomány mindössze kb. 3 %-a kódolódik, azaz íródik át fehérje molekulákba. A nem kódoló DNS pszeudogénekből, intronokból, még nem pontosan definiált szekvenciákból és ismétlődő DNS szakaszokból tevődik össze. Az intronok a szomszédos fehérjekódoló gének kifejeződésének szabályozásában, a gének átrendeződésében és újrakombinálódásában játszhatnak szerepet. A humán genom kb. 30%-ban tartalmaz ismétlődő, un. repetitív szekvenciákat is, melyek két nagy csoportra oszthatók. Az első csoport a szatellita DNS csoport, a másik pedig a szétszóródó repetitív DNS, amely elsősorban az ún. transzpozonokból származik. A szatellita DNS sajátos szekvenciájú, rövid DNS darabokból áll, amelyek akár több ezerszer is ismétlődhetnek. Emberben elsősorban a kromoszóma centromer régiója körüli területen helyezkednek el és az ún. konstitutív heterokromatin fő alkotói. A szatellita DNS nem egységes csoport. Létezik miniszatelllita és mikroszatellita DNS is. Ahogy a nevük mutatja ezekben az esetekben a repetitív szekvencia rövidebb, mint a szatellita DNS esetében. Az eloszlásuk is más, egyenletesebben oszlanak el a genomban. A szatellita DNS szekvenciák nem íródnak át és jellemző feladataikat sem sikerült eddig megtalálni (58, 64). A mitokondriális DNS szerkezete A magasabb rendű, soksejtű élőlényekben létezik DNS a sejtmagon, a kromoszómákon kívül is. A sejtlégzést és az energiatermelést végző sejtalkotók a mitokondriumok is tartalmaznak DNS-t. Ez a DNS is örökítő anyag, bár információtartalma a kromoszómális DNS-nek csak csekély töredéke. A humán mitokondriális DNS (mtdns) körkörös, kétszálú, 16 569 bp hosszú, két riboszómális RNS-t, huszonkét transzfer RNS-t és az oxidatív foszforilációs rendszer 67 polipeptidjéből 13-at kódol. Az I komplex (NADH CoQ reduktáz) 7 alegységét, a III komplex (apocitokrom b), a IV. komplex (citokrom c oxidáz; COX) I., II. és III. alegységeit, valamint az V. komplex APT-áz 6. és 8. alegységeit (36). Erre a harminchét génre nem vonatkozik a genetika jól ismert, Mendel által megállapított törvényei. Elsősorban azért nem, mert a mtdns sejtenként több ezer példányban található meg, sőt a petesejtben több százezer

14 példányban, a spermiumok fejében viszont gyakorlatilag egyáltalán nem. A megtermékenyítéskor az új egyed mtdns-ét egyedül az anyától kapja, így az általa meghatározott tulajdonságok öröklése kizárólag anyai. A mtdns változékonyabb is, mint a mag DNS, a mutációk gyakorisága itt körülbelül tízszer nagyobb, mint a sejtmagban. Eszerint két egymással rokonságban nem álló ember összesen 16 569 nukleotidpár hosszúságú mitokondriális DNS-e átlagosan kb. 70 pontban különbözik egymástól, de a különbség akár 500 nukleotid is lehet. Minél távolabb áll egymástól két ember származástanilag, annál nagyobb a különbség. És fordítva, ha két ember mtdnse teljesen azonos, akkor biztos, hogy közöttük közvetlen anyai ágú rokonság van. Cann, Stoneking és Wilson 147 a ma élő emberiség különböző rasszait (fajtáit) képviselő személy mtdns-ét elemezték és hasonlították össze. Komputerprogramok segítségével ezek rokonsági foka megállapítható ill. valószínűsíthető volt, sőt meg tudtak állapítani egy feltételezett családfát, leszármazási sort is. Annak ismeretében, hogy milyen gyakorisággal történnek mutációk, ez a leszármazási sor, vagy családfa az idő dimenziójában is hitelesíthető, azaz megbecsülhető, hogy mikor eredtek az egyes leágazások ezen a törzsfán. Az elvégzett számítások alapján ez a törzsfa a vizsgált 147 különböző ember esetében egyetlen képzeletbeli pontból indult ki. Ennek a képzeletbeli szekvenciának az összehasonlítása a ma fellelhetőkkel egyértelműen azt igazolta, hogy a fa legelső elágazásai Afrikában történtek. Ezzel összhangban van az a tény is, hogy a ma élő afrikaiak mtdns-e sokkal több eltérést mutat egymástól, mint bármely más embercsoport egyedei, ezzel is alátámasztva, hogy ők mentek keresztül a leghosszabb ideig tartó evolúción (60). Az mtdna vizsgálatával már sejtmag nélküli biológiai anyagok ( pl. haj, szőr, csont ) felhasználásával is lehetőség nyílik anyai ágú rokonsági viszonyok tisztázására, rasszok és személyek azonosításra. 3.2.1. MINISZATELLITÁK

15 A miniszatelliták olyan hipervariábilis DNS-régiók, melyeket a human genomban elsõként Wyman és White talált meg véletlenül 1980-ban (64). Az igazságügyi orvostanban különösen nagy jelentõségük van. Nem kódolódnak, ezáltal az itt fellépett mutációk ez egyed életét nem befolyásolják hátrányosan, így generációkon keresztül igen nagy variábilitásra tettek szert. Egymás után összekapcsolt, azonos polaritású, magas guanin és citozin tartalmú, különbözõ számú DNS ismétlődési-egységekbõl (VNTR) állnak, melyek szekvenciája könnyen módosulhat. Ezek az ismétlõdések 20-100 bázispár hosszúságúak és számuk akár 230-ig is emelkedhet. Így e magas polimorfizmusú VNTR-fragmensek hossza elérheti a 23 000 bázispárt is (25). Funkciójuk jelenleg nem ismeretes, egyesek parazita, önzõ, mások másodlagos, jelentés nélküli evolúciós maradványoknak vélik õket (11). Az egyes lokuszok egyedre jellemzõ variabilitása az ismétlõdõ egységeik számbeli és szekvencia eltérése polimorfizmusa következtében jön létre (2. ábra). Jeffreys és Nakamura a mioglobin-, a zéta globin -, az inzulin gén és a hepatitisz B vírus X gén régiójának szekvenciájából olyan un. multi lokusz szondákat készítettek, melyekkel a humán genomban elszórtan elõforduló hipervariábilis VNTR lokuszallélok hossz-polimorfizmusának vizsgálatára nyílt lehetõség (25, 43). A laborok közötti információ csere szempontjából fontos lépés volt az un. single lokusz oligonukleotid szondák kifejlesztése, melyekkel egy adott lokusz két allélja egy anyai és egy apai eredetû lett azonosítható. Több lokusz vizsgálatával az egyedre jellemzõ genetikai profil un. genetikai ujjlenyomat nyerhetõ. Az allélok mendeli öröklõdést mutatnak, az utód egyiket az anyjától, másikat az apjától örökli (34, 38). lokusz A allél 1 - ------ ------ --------

16 allél 2 - ------ ------ ------------------- lokusz B allél 1 -- ----- --------- ------- allél 2 -- ----- --------- ------------- 2. ábra. A VNTR-polimorfizmus sematikus ábrázolása. A négyzetek és téglalapok a különbözõ szekvenciájú, ismétlõdõ egységeket szimbolizálják, melyeknek számbeli eltérése eredményezi az egyedre jellemzõ változatosságot. A nyilak a restrikciós endonukleáz felismerési helyeit jelölik. 3.2.1.1. MULTI- ÉS SINGLE LOKUSZ SZONDÁK A multi lokusz (MLS) génszondák minden olyan lokuszhoz hozzákapcsolódnak, ahol a szondáéval komplementer szekvencia megtalálható (26). Az így nyert profilt nevezzük fingerprintnek (25). Az igazságügyi hemogenetikai gyakorlatban főként korábban használt fontosabb ML szondákat az 1. táblázat foglalja össze. A szonda neve Kromoszómális lokalizáció Lokusz Gyártó MLS 33.15 7q31.1 D7S437 Cellmark MLS 33.6 1 cen-q24 D1S111 Cellmark (GTG) 5 Több kromoszómán Több lokuszon Fresenius 1.táblázat. Az igazságügyi hemogenetikában használt multi lokusz szondák jellemzői. 3.2.1.2. AMPLIFIKÁLHATÓ HOSSZ-POLIMORF LOKUSZOK

17 Ezeknél a lokuszoknál (pl. MCT118/D1S80, YNZ22/D17S30 stb.) 15-70 bázispár az ismétlődő DNS szakaszok hossza és a leghosszabb allél 1010 bp hosszú. Megbízható tipizálásukhoz jó minőségű DNS minta és az STR lokuszokhoz hasonlóan szekvenálással hitelesített allélkoktélok szükségesek. 3.2.2. MIKROSZATELLITÁK A mikroszatelliták 2-10 bp ismétlődő egységeket tartalmazó nem kódoló szekvenciák (59). E short tandem repeat (STR) rendszereket a DNS tipizálásban és genetikai térképezésben először Edwards és munkatársai alkalmazták 1991-ben. A genomban igen nagy számban (10 5 ) fordulnak elő és az ismétlődő egységek száma akár száz is lehet lokuszonként. Az AmpFLP-rendszerekhez hasonlóan az amplifikálható VNTRpolimorfizmusokhoz tartoznak, azoktól az ismétlődő egységek lényegesen alacsonyabb számában és az amplifikált fragmentumok hosszúságában különböznek (< 400 bp) (12). A gyakorlatban a négy bázispáros ismétlődő egységeket tartalmazó tetramer STR lokuszok vizsgálata terjedt el a leginkább, mivel a DNS-polimeráz csúszásából eredő és a kiértékelést esetlegesen zavaró aspecifikus fragmentek keletkezése ezeknél figyelhető meg a legkisebb mértékben (63). A tandem ismétlődések e csoportja a miniszatellitákkal a VNTR polimorfizmusokhoz tartozik (59, 62). Az igazságügyi hemogenetikában alkalmazásukkal lehetőség nyílt rossz minőségű, un. degradált DNS minták vizsgálatára is. Az alábbiakban néhány fontosabb, az értekezésben is vizsgált STR rendszert és azok fontosabb tulajdonságait ismertetjük. 3.2.2.1. RÖVID ISMÉTLŐDŐ EGYSÉGEKET TARTALMAZÓ ÚN. SHORT TANDEM REPEAT (STR) MIKROSZATELLITA LOKUSZOK

18 3.2.2.1.1. AUTOSZÓMÁLIS LOCUSOK HumCD4: Fragmenshossz 100 bp, viszonylag alacsony polimorfizmus a kaukazoid populációban. Igen nagy érzékenység (<50 pg templát DNS). Éles sávok és ritka műtermékek. Nagy degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál (pl. csontok). Ismétlődő egység bázissorrendje: CTTTT. Kromoszómális lokalizáció: 12p (12). P1 :5 - TTG GAG TCG CAA GCT GAA CTA GC 3 P2: 5 - GCC TGA GTG ACA GAG TGA GAA CC 3 HumF13B: Fragmenshossz 200 bp, viszonylag alacsony polimorfizmus a kaukazoid populációban. Igen nagy érzékenység (< 100 pg templát DNS). Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: TTTA. Kromoszómális lokalizáció: 1q31-q32 (43). P1 :5 - TGA GGT GGT GTA CTA CCA TA 3 P2: 5 - GAT CAT GCC ATT GCA CTC TA 3 HumFES/FPS (FES): Fragmenshossz 250 bp, viszonylag alacsony polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: ATTT. Kromoszómális lokalizáció: 15q25 (46). P1 :5 - GGG ATT TCC CTA TGG ATT GG- 3 P2: 5 - GCG AAA GAA TGA GAC TAC AT 3 HumTPOX (HTPO): Fragmenshossz 250 bp, viszonylag alacsony polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony

19 degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: AATG. Kromoszómális lokalizáció: 2p13 (43). P1 :5 - ACT GGC ACA GAA CAG GCA 3 P2: 5 - GGA GGA ACT GGG AAC CAC ACA GGT 3 HumTH01: Fragmenshossz 150 bp, közepesen nagy polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: AATG. Kromoszómális lokalizáció: 11p15-15.5 (12, 46). P1: 5 - GTG GGC TGA AAA GCT CCC GAT TAT- 3 P2: 5 - GTG ATT CCC ATT GGC CTG TTC CTC - 3 HumVWF31A (vwa): Fragmenshossz 150 bp, közepesen nagy polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Gyakori műtermékek (árnyéksávok). Alacsony degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: TCTA/TCTG. Kromoszómális lokalizáció: 12q12 (24). P1 :5 - CCC TAG TGG ATG ATA AGA ATA ATC- 3 P2: 5 - GGA CAG ATG ATA AAT ACA TAG GAT GGA TGG 3 HumFIBRA (FGA): Fragmenshossz 200 bp, viszonylag magas polimorfizmus a kaukazoid populációban. Nagy érzékenység. Éles sávok és ritka műtermékek (pl. árnyéksávok). Alacsony

20 degradációs érzékenység idős biológiai anyagoknál. Ismétlődő egység bázissorrendje: TC/TCTT. Kromoszómális lokalizáció: 4q28 (13). P1 : 5 - GCC CCA TAG GTT TTG AAC TCA- 3 P2: 5 - TGA TTT GTC TGT AAT TGC CAG C 3 HumACTBP2 (SE33): Ezt a rendkívül polimorf lokuszt dél-magyarországi populációban Csete és munkatársai natív gélen vizsgálták 1996-ban, azonban az ezzel a vizsgálati módszerrel nyert vizsgálati eredmények nem tekinthetők megfelelőnek a kellő felbontás hiánya miatt. A Genetikai disztanciák Cavalli Forza, populációk rokonsága, eredete. Adatbank egyik rendszere. A lokusz a 6. kromoszomán helyezkedik el (47). P1: 5 AAT CTG GGC GAC AAG AGT GA P2: 5 ACA TCT CCC CTA CCG CTA TA 3.2.2.1.2. Y KROMOSZÓMÁLIS LOKUSZOK Az igazságügyi hemogenetikában napjainkban használt, kapcsoltan öröklődő tetranukleotid mikroszatellita STR rendszerek az Y kromoszóma nem rekombinálódó részén helyezkednek el. Az utóbbi időben egyre nagyobb jelentőséget kapnak elsősorban az apai ágú öröklődés nyomon követése és szexuális bűncselekmények elkövetőinek azonosítása miatt. Füredi és munkatársai számos Y kromoszómális lokusz populációgenetikai adatait publikálták (18). Az irodalomban közölt nagyszámú Y kromoszómális lokuszok közül csak az általunk vizsgált DYS 19, DYS 390 és DYS 389 lokuszok kerülnek az alábbiakban részletes ismertetésre. DYS 19 ( 27H39LR) lokusz:

21 Ennél az Y kromoszóma rövid karján található lokusznál a polimorfizmus a CTAT tetranukleotid egységek számbeli variációja eredményezi / (CTAT) n /. Az ismétlődő egységek száma 10-19. Az allélok mérete 174-210 bp. Eddig az irodalomban 10 kükönböző allélt került leírásra (48). P1: 5 - CTACTGAGTTTCTGTTATAGT- 3 P2: 5 ATGGCATGTAGTGAGGACA 3 DYS 390 lokusz: Ennél az Y kromoszóma hosszú karján található lokusznál a polimorfizmus a CTGT tetranukleotid egységek számbeli variációja eredményezi / (CTGT) n /. Az ismétlődő egységek száma 18-27. Az allélok mérete 191-227 bp. Eddig az irodalomban 10 különböző allélt írtak le (49). P1: 5 TATATTTTACACATTTTTGGGCC 3 P2: 5 TGACAGAAAATGAACACATTGC 3 DYS389 lokusz: Ez a két részből álló lokusz az Y kromoszóma hosszú karján található. A polimorfizmust a CTGT / CTAT tetranukleotid egységek számbeli variációja eredményezi / (CTGT) n ill. (CTAT) n /. Az ismétlődő egységek száma 7-13 ill. 23-31. Az allélok mérete 239-263 ill. 353-385 bp. Eddig az irodalomban 7 ill. 9 különböző allélt észleltek (49). P1: 5 - TCATCTGTATTATCTATG-3 P2: 5 - JOE CCAACTCTCATCTGTAATTATCTAT-3 P3: 5 - FAM ATAAATAATATAAAATATAAATAAATAAATATAGATAGACAG

22 3.2.3. SZEKVENCIA POLIMORFIZMUS (OLIGOTYPING) A DNS szekvencia polimorfizmusok vizsgálata az igazságügyi PCR-tipizálások első fázisához tartoznak (22, 56). Ezt a tipizáló rendszert a Cetus molekuláris biológiai társaság humángenetikai részlege fejlesztette ki. Az igazságügyi DNS tipizálás céljából kiválasztott és legalaposabban vizsgált terület a HLA II osztályának D génrégiójában található HLA DQ A1-es lokusza, mely a 6. Kromoszómán helyezkedik el (5). Ez a génrégió öt egységre DP, DN, DO, DQ, DR tagozódik. Az itt elhelyezkedő exonok a- és b-glikopeptideket kódolnak, melyek variábilis régiói idegen antigének peptidfragmenseit képesek megkötni. E területnek megfelelően egy kb. 240 bp nagyságú fragmens amplifikálható, nyolc alléllal. Az allélok meghatározására szekvenciaspecifikus oligonukleotidokkal (SSO) történő hibridizálással nyílik lehetőség (14). A tipizálás az un. dot-blot technikával történik, melynél a szekvenciaspecifikus szonda egy poli-timin nyéllel nylonmembránhoz van gyárilag kötve, melyhez a biotinnal jelölt primert tartalmazó amplifikátumok kapcsolódnak. A kapcsolódást követő színreakció útján nyílik lehetőség a talált jellegek meghatározására. 3.3. A DNS MOLEKULA KINYERÉSE, TISZTÍTÁSA A DNS technika egyik legfontosabb lépése a vizsgálni kívánt DNS molekula kinyerése, lehetőleg úgy, hogy az extrahálás alkalmával minél kevésbé sérüljenek a molekulák. Az első ilyen módszert Sambrook és munkatársai fejlesztették ki, melynek során Proteináz K emésztést követően fenollal vonták ki a fehérjéket, majd etanollal csapták ki a már megtisztított DNS molekulákat (55). Jelentős lépés volt azoknak a környezet és kutatóbarát eljárásoknak a megjelenése, melyek a fenolt már nem használják (32, 61). Legújabban különböző kitek kerültek forgalomba, melyek összetételét azonban a gyártó

23 cégek nem adják meg. DNS vizsgálatra minden olyan biológiai anyag alkalmas a mitokondriális DNS vizsgálaton kívül melyben sejtmaggal rendelkező sejt található. A könny, izzadtság, szérum valamint sejtmag nélküli sejteket tartalmazó testnedvek standard DNS vizsgálatra nem alkalmasak. Az alábbi biológiai anyagokból izolálható és tipizálható eredményesen DNS a klasszikus módszerekkel: vér és vérnyomok sperma- és spermanyomok szerv és szövet csontok és fogak hajhagymás hajszál nyál, vizelet A DNS profil elkészítését számos faktor befolyásolhatja. Az első a rendelkezésre álló minta mennyisége. A második faktor a degradáció. Környezeti hatásra (pl. bakteriális kontamináció) a DNS akár még viszonylag nagy mennyiségű biológiai anyagnál is tönkremehet. A harmadik faktor a minta tisztasága. Különböző szennyeződések (pl. indigó) nagyfokban gátolhatják a tipizálást, különösen a PCR reakciót. Különböző biológiai anyagok átlagos DNS tartalmát a 2. táblázatban foglaltuk össze (37, 38). A minta típusa Vér Vérnyom (1cm 2 ) Sperma Postkoitalis hüvelykenet Haj (hagymával) -tépett -hullott Nyál Szájnyálkahártya kenet Vizelet Csont DNS mennyiség 20.000-40.000 ng /µl 250-500 ng 150.000 300.000 ng /ml 10 3000 ng 1-750 ng / gyökét 1-12 ng / gyökér 1000 10.000 ng /ml 1000 1500 ng 1-20 ng / ml 3-10 ng / mg

24 2. táblázat. Különböző biológiai anyagok átlagos DNS tartalma. A legtöbb DNS-t a Quiagen cég QIAampTissue kittel tudtuk kinyerni, ezért ezt használtuk több esetben is, amikor a fenolos módszereket el kívántuk kerülni. Az általunk használt eljárások részletes leírása a függelékben található meg. 3.4. A DNS POLIMORFIZMUSOK VIZSGÁLATÁBAN ALKALMAZOTT MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI MÓDSZEREK 3.4.1. Restrikciós fragmens hossz-polimorfizmus (RFLP) A restrikciós fragmens hossz-polimorfizmus a genomi DNS baktériumokból nyert restrikciós endonukleáz enzimekkel történt hasítása után kapott DNS fragmentumok méretében megfigyelt változékonyság. Az RFLP vizsgálat során az egész genetikai állományt vizsgáljuk és a kérdéses régiókat un. több- vagy egy lokuszos szondákkal detektáljuk. A vizsgálat lépéseit a 3. ábra szemlélteti. DNS izolálás Fotometriás mennyiség meghatározás DNS emésztés restrikciós endonukleaz enzimmel (Hinf I, Hae III, stb.) Az emésztettség vizsgálata minigélben Az emésztett DNS szétválasztása gélelektroforézissel DNS átvitel nylon membránra (Southern blotting) - DNS depurinálás - DNS denaturálás A DNS hibridizációja multi- ill. single locus szondával - prehibridizálás - hibridizálás Chemiluminescens detekció (ECL) RTG filmmel

25 Értékelés 3. ábra. Az RFLP vizsgálat lépései. Az RFLP vizsgálat nagy előnye, hogy rendkívül polimorf. Hátránya, hogy eredményes elvégzéséhez viszonylag nagy mennyiségű (> 500ng), ép DNS molekula szükséges (24). 3.4.2. POLIMERÁZ EMZIMMEL VÉGZETT DNS SOKSZOROSÍTÁS (POLYMERASE CHAIN REACTION PCR) A Nobel-díjjal jutalmazott eljárást 1986-ban K. Mullis és munkacsoportja fejlesztette ki. Ennek lényege, hogy akár rendkívül kis mennyiségű biológiai minták kivételes esetben már akár néhány sejtnyi (0,000 000 000 01g!) DNS minta vizsgálni kívánt polimorf szakaszát egy speciális, hő stabil enzim segítségével több milliószorosára lehet sokszorozni, ami ezt követően már molekuláris biológiai módszerekkel vizsgálhatóvá válik. A biológiai nyomokból (vér, ondó, nyál stb.) kinyert DNS molekulákat, a vizsgálni kívánt polimorf szakasz elejéhez kapcsolódó indító molekulákat (primerek), hő stabil polimeráz enzimet, ionokat és a DNS molekula építő köveit tartalmazó oldatban a DNS szálak egymást kiegészítő tulajdonságát kihasználva 25-40 cikluson át láncreakciószerűen felszaporítjuk (amplifikáció). Így a vizsgálni kívánt DNS szakaszok száma ciklusonként megduplázódik. Egy ciklus általában három lépésből áll. Az első lépésben a mintát 90-96 o C-ra felmelegítjük, ekkor a DNS molekulák szálai szétválnak (denaturáció). A második lépésben a reakcióelegyet 50-65 o C közötti hőmérsékletre hűtjük, ahol az indító molekulák (primerek) mindkét DNS szál vizsgálandó szakaszainak elejéhez kapcsolódnak (annealing). Az utolsó lépésben az enzim egy magasabb hőmérsékleten (70-72 o C), az építőköveket (dntp) felhasználva megszintetizálja a komplementer DNS szálakat (extension). Ezután a ciklus kezdődik előröl és ekkor már a vizsgálni kívánt ismétlődő egységeket tartalmazó új DNS szálak is mintaként szolgálnak az indító molekulák és az enzim számára. A felszaporított, az

26 egyedre jellemző ismétlődő egységeket tartalmazó DNS szakaszok ezt követően elektromos áram segítségével szétválaszthatók (elektroforézis) (42). 3.4.2.1. DNS polimerázok Ezek az enzimek a sejtben a kromoszóma replikációt és a DNS molekula helyreállítását végzik. Két szubsztrátjuk van. Az egyik a templát DNS-hez kapcsolódott, szabad 3 -OH csoportot tartalmazó egyszálú oligonukleotid primer molekula, a másik a dezoxinukleotid 5 - trifoszfát (dntp). A polimerizáció során a lánchosszabbodás 5 3 irányban történik. A polimeráz enzimek fontos tulajdonságai a percenkénti nukleotid beépítési sebesség ( turnover rate ) és az új lánc felépítési hűsége ( fidelity ). Néhány DNS polimeráznak a polimerizáción kívül más funkciója is lehet. Ilyen a 3 5 ill. 5 3 exonukleáz aktivitás, képesség RNS, mint szubsztrát elfogadására (reverz transzkripció) és templát nélküli nukleotid beépítésre. A 3 exonukleáz aktivitás lehetőséget teremt a helytelenül beépített bázisok eltávolítására és ez által a polimerizáció folytatására ( proofreading role). Taq DNS polimeráz A Taq DNS polimeráz (E.C. 2.7.7.7) enzim eredetileg hőforrásokban élő Thermus aquaticus moszatból izolált, hő stabil DNS polimeráz, mely magnézium ionok jelenlétében a duplex DNS láncba a nukleotidok primer dependens beépülését katalizálja 5 3 irányban. Az enzim működéséhez feltétlenül szükséges magnézium ionok stabilizálják a DNS kettős szálát, azonban magas (> 1,5 mm) koncentrációban a teljes denaturációt meggátolják, ezáltal a keletkezett amplifikárum mennyiségét és hamis primer / templát kapcsolódáshoz vezetve a reakció specificitását csökkentik (3. táblázat). Molekulasúly 94 kda Fél élet idő 95 o C-on 40 perc Extenziós sebsség 72 o C-on ( nukl. / sec ) 60-150

27 Reverz transzkriptáz aktivitás minimális PCR optimum :extenziós hőmérséklet 70-75 o C Mg 2+ koncentráció 1-4 mm ph 7-7.5 dntp koncentráció 40-200 µm Primer koncentráció 0.1-1 µm 5 3 exonukleáz aktivitás van 3 5 exonukleáz aktivitás nincs 3 kapcsolás van Tárolás -20 o C Koncentráció 5 U/µl 3. táblázat. A Taq DNS polimeráz enzim tulajdonságai. 3.5. A VIZSGÁLATI EREDMÉNYEK DETEKTÁLÁSA Az igazságügyi DNS vizsgálatok során keletkezett fragmenseket legegyszerűbben az un. ezüst festési technikával jeleníthetjük meg (1). Az utóbbi években megnőtt az igény olyan technológiák iránt, amelyek sebesség és érzékenység területén jobbak, mint a korábban használt technikák és ezen túlmenően használatuk nem rejt veszélyeket magában. Ilyen a fluorescens technika. A fluorescencia jelensége egyszerű: bizonyos molekulák energiát elnyelve (lézer) gerjesztődnek (elektronjaik magasabb szintre lépnek), majd bizonyos idő elmúltával, alapállapotba visszatérve a leadott energiát fény formájában kibocsátják (emisszió). Az emittált fény általában nagyobb hullámhosszú, mint az elnyelt fény (Stokes-törvény). Az igazságügyi DNS technikában főként a következő fluorescens festékeket használjuk: Cy5, FAM, HEX, JOE, NED, ROX, TAMRA (35). 3.6. MUTÁCIÓK ÉS POLIMORFIZMUSOK

28 Jelenlegi tudásunk szerint a miniszatellita szekvenciáknál az ivarsejtekkel átörökített mutációk meiozis során kiegyensúlyozatlan crossing over, míg a rövid mikrosztellitáknál a DNS replikációja során az un. polimeráz csúszás (slippage) következtében jönnek létre (59). Az autoszómális mikroszatellita lokuszok mutációs gyakorisága az STR-ek szerkezetétől, hosszától függ (9, 29). A mutációk az igazságügyi hemogenetikában kiemelt jelentőséggel bírnak, mert téves kizárást eredményezhetnek. Szerencsére a többszörös mutációk csak irodalmi ritkaságként fordulnak elő (19). A DNS molekulában kódolt öröklött egyedi különbségek (polimorfizmusok) lehetnek hossz- és szekvencia alapúak. A genetikai állományban a gének között számtalan helyen dadogásszerűen ismétlődő DNS szakaszok találhatók, melyek szabályosan öröklődnek és számuk a vizsgált egyénre jellemző. Nem kódolódnak, ezáltal az itt fellépett mutációk ez egyed életét nem befolyásolták hátrányosan, így generációkon keresztül igen nagy variabilitásra tehettek szert. Ezek az ismétlődések 20-100 bázispár hosszúságúak és számuk akár 230-ig is emelkedhet (un. miniszatellita hipervariabilis régiók). A hosszpolimorf rendszerekhez tartoznak az un. short tandem repeat locusok (STR), ahol 2-10 bp hosszúságú szakaszok ismétlődnek 400 bp-nál nem hosszabb allélokat alkotva. Funkciójuk jelenleg nem ismert, egyesek parazita, önző, mások másodlagos, jelentés nélküli evolúciós maradványoknak vélik őket. Az egyes lokuszok egyedre jellemzõ variabilitása ezen ismétlõdõ egységeik számbeli és szekvencia eltérése polimorfizmusa következtében jön létre (2. ábra). A DNS molekulában kódolt öröklött egyedi különbségek másik formája a szekvencia polimorfizmus, itt az allélok hossza azonos, azonban a DNS szekvenciájában van egy vagy több bázis eltérés. Ilyen polimorfizmus az igazságügyi hemogenetikában vizsgált néhány nukleáris DNS lokuszon és a mtdns un. kontroll (D-hurok) régiójában van (8). Y kromoszómális polimorfizmusok Az Y kromoszóma a kb. 60 millió bázispárból áll és így a 21-es kromoszóma után az ember második legkisebb kromoszómája (40). Egy heterokromatikus és egy eukromatikus részből áll. A heterokromatikus régió a hosszú kar disztális részén

29 helyezkedik el, nagyszámú ismétlődő egységet tartalmaz és hossza jelentős mértékben változhat (8). Az Y kromoszóma eukromatikus régiójának kiterjedése ezzel szemben konstans. Ide tartozik a kromoszóma rövid karja (Yp), a centromer régió és a hosszú kar proximális része. Az eukromatikus régió négy szekvenciaosztályra tagolódik: az X kromoszóma homológok, a centromer régió repetitív szekvenciái, az Y-specifikus repetitív szekvenciák és Y-specifikus egyes szekvenciák. Az Y komoszóma mindkét karjának telomer részén az X kromoszómával rekombinálódó pszeudoautoszomális részeket tartalmaz. Ezek hossza a rövid karon (PAR1) 2,6 Mb, a hosszú karon (PAR2) pedig 0,5 Mb. A PAR1 és PAR2 régiókon kívül az Y kromoszóma nem rekombinálódik. Ritkán fellépő aberráns rekombináció esetén az Y kromoszómáról örökítő anyag kerülhet át az X kromoszómára. Ha ez magában foglalja a TDF/SRY (testis determining factor/ sex determinig region Y) gént, úgy steril, 46, XX kromoszómaszerelvényű férfi és 46, XY kromoszómaszerelvényű, SRY deléciós nő keletkezik (8). 3.7. SPERMAKIMUTATÁS ELŐTESZTEK A mindennapi gyakorlatban használt un. előpróbák lehetővé teszik a vizsgálni kívánt biológiai nyomok azonosítását és ezáltal nagymértekben hozzájárulnak az eredményes DNS analízis elvégzéséhez. Számos kémiai anyag azonban csökkentheti a biológiai nyomokból kinyerhető DNS mennyiségét, sőt akár lehetetlenné is teheti annak analízisét. A mindennapi gyakorlatban elterjedt savi foszfatáz teszt mind fals negatív, mind pedig fals pozitív reakciót is eredményezhet (51). Elemanalizátorral felszerelt scanning elektron mikroszkóppal előzetes kémiai anyagokkal történt kezelés nélkül nyílik lehetőség különböző biológiai minta, így a spermanyomok azonosítására is, azok morfológiája és magas cink koncentrációjának meghatározása útján (57).

30 3.8. A DNS VIZSGÁLATOK JELENTŐSÉGE AZ IGAZSÁGÜGYI ORVOSTANBAN Az elmúlt évtized eredményei, mint az emberi genetikai állomány teljes feltérképezésének elindítása, az új molekuláris biológiai módszerek bevezetése lehetővé tették a DNS technika alkalmazását az igazságügyi orvostani gyakorlatban is. A hagyományos, a vér vizsgálatán alapuló szerológiai elemzés a egyedi jellegeket a fehérjék, míg a DNS analízis ezeket már közvetlenül az örökítő anyag szintjén vizsgálja. A PCR alapú DNS technikával a bűncselekmények helyszínén talált rendkívül kis mennyiségű (pl. köröm alatt talált hámsejtek, cigarettacsikk, egyetlen hajszál, felragasztott bélyeg stb.), akár már részben tönkrement DNS molekulákat tartalmazó biológiai mikronyomok is eredményesen azonosíthatók. A mitokondriális DNS technikával az anyai ágú rokonsági kapcsolatok több generációs feltárása, sejtmag nélküli biológiai anyagok pl. hagyma nélküli hajszálak, magnélküli hámsejtek hátrahagyóinak azonosítása is lehetővé vált. Ez a módszer idős csontok, elszenesedett holttestek vizsgálatánál is eredményesnek bizonyult, ahol a nukleáris DNS teljes degradálódása miatt az un. klasszikus DNS rendszerekkel eredmény már nem volt nyerhető. Az Y kromoszómális rendszerek szexuális bűncselekmények és deficiens esetek megoldásában adnak értékes információt. Míg a klasszikus szerológiai vizsgálatokkal a talált jellegek fenotípusát, addig a DNS technikával már a genotípusukat lehet megállapítani. A származás megállapítási perek nagy része a klasszikus szerológiai vizsgálati eljárásokkal eredményesen megoldható. A vizsgált esetek egy részében azonban az összes eddig ismert vércsoportrendszerrel melyek száma időközben a HLA-rendszerrel együtt 40 fölé emelkedett sem lehetséges

31 egyértelmű eredményt elérni (53). E vizsgálati eljárással ezek az esetek is megoldhatók. A fentieken kívül a DNS technika segítségével egyértelműen állás foglalható a származás kérdését illetően már a terhesség alatt (magzatvíz- vagy méhlepénybolyh sejtekből), szülés után, az anya ill. a vélelmezett apa halálakor (pl. rokonok vérmintáiból, archivált szövettani blokkokból, metszetekből ), családon belüli szexuális kapcsolatból (pl. após- meny, sógor anya, stb.) született gyermek származásának tisztázására vonatkozóan, valamint holttestből származó szövet- és vérmintákból. Ez az új vizsgálati eljárás forradalmasította az igazságügyi orvostani személyazonosítást, segítségével olyan kérdésekre kaphatunk választ, melyeket az eddig rendelkezésre álló vizsgálati módszerekkel nem volt lehetséges megoldani. 3.9. STATISZTIKAI ELEMZÉSEK A populációgenetikai- és mutációs vizsgálatok elemzéséhez az alábbi biometriai egyenleteket használtuk (8). Diszkriminációs index Y kromoszómális lokuszok számára: n DI(Y) = 1 - Σ fij 2 i = 1

32 DI = diszkriminációs index fij = i allél fekvenciája a./ A heterozigótasági ráta meghatározása (observed heterozygosity): C het N - C ho C ho P het = = = 1 - = 1- P ho N N N C het = Σ Σ C ij i j>i P het P ho C ho C het Cj N = heterozigóta ráta = homozigóta ráta = a homozigóta egyedek száma = a heterozigóta egyedek száma = A i A j fenotípussal rendelkező egyedek száma = a nem rokon egyedek száma b./ Megegyezési valószínűség (matching probability or probability of match pm ): n n

33 pm = ΣΣ p ij 2 i=1 j i pm = megegyezési valószínűség pj = az A i A j fenotípussal (genotípussal ) rendelkező egyedek gyakorisága n = a különböző allélok száma c. / Általános apasági kizárási esély (mean exclusion cance - MEC): MEC = Σpi 3 (1-pi) 2 +Σpi(1-pi) 3 +Σpipj(pi+pj)(1-pi-pj) 2 I i i< j MEC = általános apasági kizárási esély p i,p j = az Ai ill. az Aj allélok gyakoriságai d. / A polimorfizmus információtartalmának meghatározása (polymorphism information content - PIC): n n n PIC = 1-Σpi 2 (Σpi 2 ) 2 +Σpi 4 i=1 i=1 i=1 PIC = a polimorfizmus információtartalma pi = az A i allél gyakorisága n = az egymástól különböző allélok száma

34 e / A mutációs ráta kiszámítása: µ = X M X = a mutációk száma M = a független meiózisok száma Alkalmazot számítógépes programok: 1. DNA view ( Charles Brenner, USA ) 2. RxC -1.3 verzió ( M. Miller, USA ) 3. Hardy-Weinberg-Analysis- 3.2 verzió ( C.Puers, Németország ) 4. VIZSGÁLATI ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. A DNS MOLEKULA STABILITÁSÁNAK VIZSGÁLATA A két véletlenszerűen kiválasztott személy friss, ép, átlagos mennyiségű spermiumokat tartalmazó spermájából 7-7 cseppet ( kb.100µl-t ) steril, fehér vászonra cseppentettünk, majd szobahőmérsékleten megszárítottuk. Mindegyik minta közepéből 1x1cm nagyságú darabot vágtunk ki, majd 6-6 darabot szénszalaggal a SEM tárgytartójára rögzítettünk. Egy-egy mintát kontrollként félretettünk. A mintákat JEOL JEE 4B vákuum gőzölőben 6x10-4 -Hgmm-es vákuumban 50 Å vastag szénréteggel - 10 cm távolságból 30 másodpercen át 45 amperrel és 220 V-al izzított 5mm átmérőjű spektrál grafit katóddal - fedtük. Ezt követően mindkét személy egy-egy mintáját EDAX detektorral felszerelt DSM OPTON 940 digitális szkenning elektronmikroszkóp vákuum terébe helyeztük és

35 1, 5, 10, 15, 20 és 25 percig 20.000 Volttal gyorsított elektronsugárral bombáztuk 10-5 Hgmm vákuumban, 64 µa áramerősség mellett (4. ábra). 4. ábra. Spermium minta EDAX spektruma, 20 kev gyorsító feszültség mellett, a spermára jellemző cinkkel (nyíl). A mintákat külön-külön Eppendorf csövekbe helyeztük és 500µl extrakciós pufferben (0.01M Tris-HCl, 0.01M EDTA, 0.1 M NaCl, 0.039 M DTT, 2% SDS ph 8.0) 12 µl (20mg/ml) Proteináz K-val 56 o C-on egy éjjelen át emésztettük. Másnap a mintákhoz még 5-5µl Proteináz K-t adtunk és 3 órán át 56 o C-on tovább emésztettük, majd a DNSt standard fenol/kloroform módszerrel extraháltuk (lásd a függelékben). A kinyert DNS mennyiségét és minőségét 0.8 %-os ethidium bromidot tartalmazó agaróz gélben UV fénnyel kontrolláltuk és ismert mennyiségű DNS-t tartalmazó standardok mellett DNS koncentrációjukat szemikvantitatív úton meghatároztuk. Ezt követően egy AmpFLP (D1S80 - Perkin Elmer, USA), 4 STR (CD4, TH01, VWA, F13B - SERAC, Németország ) és egy szekvencia polimorf rendszerben (HLA DQA1 - Perkin Elmer) vizsgáltuk polimeráz láncreakció (PCR) segítségével, PTC 200 (U.S.A.) DNS sokszorozóval. Az alkalmazott rendszerek amplifikációs paramétereit a 4. sz

36 táblázatban foglaltuk össze. Az amplifikációhoz szükséges összetevők és azok mennyisége az alábbiak voltak: - PCR végtérfogat: 25 µl - Genomi DNS: 1-5 ng - PCR puffer: Perkin Elmer - 10x PCR Puffer II (MgCl 2 nélkül) (100mM Tris-HCl ph 8.3, 500mM KCl) - Nukleotidok: 2 µl (SERAC) - MgCl 2 : 1,5 µl 25mM (Perkin Elmer) - Primer mix : 0,5 µl (SERAC) - Taq-polymeráz: 1 U (Perkin Elmer 5 U/µl) - UP H 2 O: ad 25 µl D1S80 és a HLA DQA1 rendszereknél a Perkin Elmer gyártó cég utasításai szerint játunk el. PCR rendszerek CD4 F13B TH01 VWA D1S80 HLADQA1 Denaturáció 94 o C 60 s 96 o C 30 s 90 o C 30 s 94 o C 60 s 95 o C 60 s 94 o C 60 s Annealing 63 o C 60 s 59 o C 30 s 64 o C 30 s 50 o C 30 s 66 o C 60 s 60 o C 60 s Extension 72 o C 90 s 72 o C 60 s 72 o C 60 s 72 o C 30 s 72 o C 90 s 72 o C 90 s Végtérfogat 25µl 25µl 25µl 25µl 50 µl 50µl Ciklusszám 30 30 30 30 30 32 Hot start + + + + - - 4. táblázat. A vizsgált lokuszok amplifikációs paraméterei.

37 Az amplifikációkat követően a DNS hozamokat 2 %-os agarózgélben ellenőriztük és azok mennyiségét szemikvantitatív úton megállapítottuk és lefényképeztük. A különböző nagyságú PCR termékek méret szerinti elválasztására poliakrilamid gélelektroforézist (hd-page), majd a fragmentumok ezt követő detektálására ezüstfestést alkalmaztunk. A kérdéses fragmentumok nemzetközileg egységesített nevezéktan szerinti tipizálása minden egyes rendszer esetében hitelesített allél-koktél egyidejű alkalmazásával történt. A HLADQA1 szekvencia polimorf rendszer detektálása enzimatikus úton történt a Perkin Elmer gyártó cég utasításának megfelelően. Horizontális natív discontinous elektroforézis Pharmacia Multiphor rendszerrel: A minták GEL-FIX (Serva) fóliára öntött natív, PAA/ PDA gélen kerültek futtatásra 1000 V, 40 ma, 10 W-on. A gélt hűtő termosztátot 15 o C-ra állítottuk be. Az egyes rendszerek esetében alkalmazott natív gélek összetételét az 5. táblázatban foglaltuk össze. PCR UP H 2 O Trishangyasav CHES AA/PDA APS TEMED lokusz Puffer (29.1: 0.9) (10%) CD4 13.5 ml 5 ml 3 ml 8.5 ml 300µl 15µl F13B 13.0 ml 4 ml 2.5 ml 5.5 ml 300µl 10µl vwa 12.2 ml 4 ml 2.5 ml 6.3 ml 300µl 10µl TH01 12.7 ml 4 ml 2.5 ml 5.8 ml 300µl 10µl D1S80 15.0 ml 3 ml - 7.0 ml 300µl 10µl 5. táblázat. A CD4, F13B, vva, TH01 és a D1S80 lokuszok vizsgálatához szükséges natív gélek összetételének adatai ( AA/BIS (29.1: 0.9)).

38 PAA gélek ezüstfestése: - Fixálás 1 %-os salétromsavval 5 perc - Mosás UP H 2 O-el 1 perc - Festés 0.2 %-os ezüst nitrát oldattal 10 perc - Mosás 2x UP H 2 O -val a fólia alatt is - Elõhívás 0.28M nátriumkarbonát / 0,037 %-os formaldehid oldattal. - Leállítás 10 %-os ecetsavval 3 perc - Mosás UP H 2 O-el 2 perc - Impregnálás 7 %-os glicerin oldatban 5 perc - A géleket száradás után jelöljük (dátum és rendszer), nylon fóliába csomagoljuk és archiváljuk. 4.2. Az D17S5 (YNZ22) ÉS AZ ACTBP2 LOKUSZOK POPULÁCIÓGENETIKAI VIZSGÁLATA 4.2.1. A D17S5 ( YNZ22 ) lokusz populációgenetikai vizsgálata 209 nem rokon magyar nemzetiségű személy lenvásznon beszárított vérmintájából 5x5 mm nagyságú darabokat külön-külön Eppendorf csövekbe helyeztünk és 500µl extrakciós pufferben (0.01M Tris-HCl, 0.01M EDTA, 0.1 M NaCl, 2% SDS ph 8.0) 12 µl (20mg/ml) Proteináz K-val 56 o C-on egy éjjelen át emésztettünk. Másnap a mintákhoz még 5-5µl Proteináz K-t adtunk és 3 órán át 56 o C-on tovább emésztettük, majd a DNS-t standard fenol/kloroform módszerrel extraháltuk (lásd a függelékben). A kinyert DNS mennyiségét és minőségét 0.8 %-os ethidium bromidot tartalmazó agaróz