Poli(ADP-ribóz) glikohidroláz szerepe A549 sejtek oxidatív stresszérzékenységében Bai Péter 1, Szabó Csaba 2, Gergely Pál 1, Virág László 1 1 Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Orvosi Vegytani Intézet, Debrecen baip@dote.hu www.earn.dote.hu/viraggroup 2 Inotek Pharmaceuticals, Beverly, MA, USA Rövidítések GT gallotannin, PAR poli(adp-ribóz) polimer, PARG poli(adp-ribóz) glikohidroláz, PARP poli(adp-ribóz) polimeráz 1, PI propidium jodid Bevezetés A poli(adp-ribóz) polimeráz-1 (PARP) egy nukleáris enzim, mely DNS törések felismerésére képes. A PARP a törött DNS-hez kapcsolódik két aszimmetrikus cink-ujj doménjén keresztül, és így aktív állapotba kerül. Az aktivált PARP a NAD + -ot használja szubsztrátként, hogy különböz akceptor fehérjékre poli(adp-ribóz) polimereket (PAR) szintetizáljon. Az egyik legfontosabb PAR akceptor fehérje maga a PARP. A PARP-nak szerepe van még többek között az NF-κB-hez kapcsolódó transzkripció szabályzásában, a nekrotikus és az apoptotikus sejthalál folyamatában, illetve a báziskihasítási repair-ben. (1) A PAR felismerési szignálként szolgál a báziskihasítási repair beindulásához, másrészrl azonban a PARP túlzott mérték aktivációja a sejt NAD + és ATP készletét teljesen felélheti, nekrotikus sejthalálhoz vezetve. A PARP gátlása ilyen körülmények között a nekrotikus jelleg sejthalált az apoptotikus jelleg sejthalál felé irányítja, vagy lehetséget biztosít a sejtek túlélésére. (1) Az aktivált PARP önmagát is poli-adp-ribozilálja, ami a PARP gátlásához vezet. A PAR-t a poli(adp-ribóz) glikohidroláz enzim (PARG) távolítja el, így a PARP újra aktívvá válhat. A PARG gyorsan eltávolitja a PAR-t, a polimerek turnoverének ideje kevesebb, mint egy perc. (2)
Az emlsök PARG enzime egy kb. 110 kda molekulatömeg, perinukleáris elhelyezkedés fehérje, amely mrns-ét több sejtben és szövetben kimutatták. A PARGnak jelenlegi ismereteink szerint egy génje van, amelyrl számos PARG izoforma képzdik. A PARG tartalmaz egy nukleáris export és egy nukleáris import szignált, amely felveti a lehetségét a PARG ciklikus mozgásának a lehetségét a sejtmag és a citoplazma között. (3) Reaktív oxigén és nitrogén intermedierek (ROI-k és RNI-k), mint a hidrogén peroxid, a peroxinitrit a nitroxil gyök, vagy alkilálószerek képesek a DNS nagymérték, egyszálú töréseket okozni. In vivo reaktív gyökök termeldésével kell számolnunk reperfúziós károsodás, a shock egyes formái, diabétesz, illetve gyulladásos folyamatok során. Ezekben a patológiás állapotokban a PARP gátlás jótékony hatásúnak bizonyult (1). Újabb adatok azt támasztják alá, hogy a PARG gátlása hasonlóan jó hatásfokkal képes védelmet nyújtani oxidatív stressz esetében. A PARG gátlásának hatását vizsgálták oxidatív és excitotikus neuron és asztroglia károsodásban (4, 5). Ezekben a kísérletekben a PARG gátlására különböz tannin származékokat használtak, mint a gallotannint (GT), vagy a nobotannin B-t. A PARG inhibitoroknak hasonló hatásuk volt, mint a PARP inhibitoroknak, képesek voltak megakadályozni a neuronok és az asztroglia sejtek oxidatív károsodását. A tanninok polifenolok, melyek a növényi sejtek falából tisztíthatóak. Vannak adatok a tanninok gyulladásgatló hatásáról is, az eredmények azt mutatják, hogy a tanninok gyulladásgátló hatása nem köthet kizárólag a tanninok szabadgyök fogó képességéhez (6, 7). Az A549 sejtekben hidrogén peroxid kezeléssel kiváltható PARP aktiváció és ez a folyamat szerepet játszik a légzrendszerben található epitél sejtek elhalásában. Minthogy a hidrogén peroxid és a PARP aktiváció fontos mediátorai a légzrendszerben található epitél sejtek károsodásának, így célul tztük ki a PARG lehetséges szerepének vizsgálatát a hidrogén peroxid indukálta sejthalálban A549 sejteken (8). Anyag és módszer Sejtek életképességének mérése
A sejtek életképességét MTT redukcióval és propidium-jodid (PI) felvétellel vizsgáltuk. Az MTT eredményét fotometriásan, a PI felvételt pedig fluoreszens mikroszkóppal értékeltük ki. PARP aktivitás mérése A PARP aktivitás méréséhez a sejteket permeabilizáltuk, majd a hidrogén peroxidos indukció után a sejtekhez 3 H-NAD + -ot adtunk. A sejtfehérjékbe beépült tríciumot folyadészcintillációs számálóval mértük. A PARP aktivitás kimutatása in situ A vékony üveglemezen növesztett 549 sejtekben a PARP-ot a hidrogén peroxid indukció után bioniált-nad + szubsztrát jelenlétében hagytuk mködni. A beépült biotint streptavidin-peroxidázzal mutattuk ki. A PAR kimutatása immuncitokémiai módszerrel Az A549 sejtek hidrogén peroxiddal történ indukciója után a sejteket fixáltuk a PAR-ra specifikus anitesttel (10H antitest) mutattuk ki a képzdött PAR-t. Intracelluláris NAD + mérése Az indukált A549 sejtekben lév NAD + mennyiségét egy alkohol-dehidrogenáz enzimhez kapcsolt színváltozást okozó, fotometriásan mérhet reakcióval mértük. A NAD + mennyiségét a kontroll százalékában fejeztük ki. Kaszpáz-3 aktivitás mérése A sejteket a hidrogén peroxid kezelés után hat órával összegyjtöttük. A kaszpáz-3 aktivitást egy szintetikus szubsztrátból, a DEVD-AMC konjugátumból történ AMC felszabadulással mértük fluorimetriásan.
Eredmények A sejtek életképessége Hidrogén peroxid koncentrációfügg módon citotoxikus volt az A549 sejteken. GT 30 perc elkezelés után, 30 µm koncentrációban meggátolta a sejtek pusztulását. (1. ábra) A PARP inaktivációja auto-poli-adp-riboziláció hatására A hidrogén peroxid kezelés koncentrációfügg PARP aktivációhoz vezetett A549 sejtekben triciált NAD + beépülésével mérve a PARP aktivációt. GT elkezelés meggátolta a PARP aktivációját. Hasonló eredményt kaptunk, amikor a PARP aktivációt az in situ PARP assay-vel mutattuk ki. Ez a módszer az újonnan képzd PAR kimutatására alkalmas. A hidrogén peroxid kezelés hatására aktiválódott a PARP, azonban GT elkezelés mellett nem lehetett kimutatni polimer képzdést kimutatni. (2. ábra) PAR akkumuláció Bizonyítandó, hogy a GT nem rendelkezik PARP inhibitor tulajdonsággal PAR immuncitokémiai festést végzetünk. A GT elkezelés nem csökkentette a PAR képzdést, st GT elkezelés mellett olyan hidrogén peroxid koncentrációnál is PAR akkumulációt figyelhettünk meg, ahol GT nélkül nem volt PAR festdés. (3. ábra) NAD + -assay A hidrogén peroxid koncentráció emelésével párhuzamosan csökken a NAD + szintje a sejtekben a PARP aktiváció következtében. A PARG gátlás megvédte a sejteket a NAD + szint csökkenése ellen. (4. ábra) A kaszpáz-3 aktiváció mértéke A kaszpáz-3 az oxidatív stressz által kiváltott apoptózis egyik effektor kaszpáza. Azokban a sejtekben, ahol a PARG gátolt állapotban van, a kontroll A549 sejtekhez képest a kaszpáz-3 aktivitása magasabb koncentrációnál kezd el emelkedni és hosszabb ideig marad magas. (5. ábra)
Diszkusszió A PARP és a PARP gátlás hatásainak vizsgálata hosszú múltra tekint vissza. A PARG vizsgálata azonban rövid múltra tekint vissza, és inkább mechanisztikusan csak, mint a PAR eltávolítását végz enzimet vizsgálták, szerepet nem tulajdonítottak neki. Újabb kísérletsorozatok világítottak rá, hogy a PARP auto-poli-adp-riboziláltságának mértéke összefügghet oxidatív stressz elleni védelemmel (4, 5). A hidrogén peroxid in vivo termeldése többek között a gyulladásos folyamatokra jellemz. A hidrogén peroxid feladata a szervezetbe kerül baktériumok elpusztítása, azonban emellett károsítja a szervezet saját szöveteit is. A hidrogén peroxid képes a sejt DNS állományát károsítani, amivel a PARP túlzott aktivációjához vezet, ami a sejt NAD + készletének kimerüléséhez vezet és a sejt nekrotikus jelleg sejtpusztulásához, vezet a PAR szintézisén keresztül. Ha nem következik be a végzetes NAD + szint csökkenés, azonban nem javíthatóak a DNS hibái, a sejtek apoptotizálnak, amit a kaszpáz aktiváció jellemez. A nekrózis és az apoptózis közötti váltást tehát a sejt energiaraktárainak a feltöltöttsége szabja meg, amit a PARP aktivációja befolyásol (1). Eredményeink azt mutatják, hogy a PARG gátlása véd az oxidatív stresszel szemben, és hasonló jelenségekkel jár, mint a PARP gátlása (nincs de novo PAR szintézis, kontroll szinten marad a NAD + szint, illetve a kaszpáz-3 aktiváció késbb indul és hosszabban marad magas). Különbség volt azonban, hogy GT kezelés mellett is volt PAR a sejtekben. Mi ezt úgy magyarázzuk, hogy a kezdeti PARP aktivációt követ auto-poli- ADP-riboziláció miatt marad a PARP gátolt állapotában. A PARG gátlás a PARP gátlásához hasonlóan hasznosnak bizonyulhat az emelkedett oxidatív stresszel jellemezhet állapotokban, így például a gyulladás folyamatokban. Jelenlegi ismereteink alapján a PARG gátlása kevesebb mellékhatással járhat, mint a PARP gátlása. A PARP gátlása a PAR hiánya miatt lelassítja a báziskihasítási repair beindulását, ami potenciálisan mutagén hatásnak tekinthet (9, 10). Ezzel szemben a PARG gátlása nem jelenti a PAR hiányát. A tanninokra, mint kémiai vegyületcsoportra jellemz az erteljes szabadgyökfogó képesség (7). A szabadgyökfogó és a PARG gátló képesség elnyös megvilágításba helyezi a tanninokat, úgy tnik több ponton védhetik szervezetünket a túlzott oxidatív stressztl.
Irodalomjegyzék (1) Virag L and Szabo C (2002) The therapeutic potential of poly(adp-ribose) polymerase inhibitors. Pharmacol Rev 54:375 429. (2) Davidovoch, L., M. Vodenchiarov, E. B. Affar, and G. G. Poirier. 2001. Importance of poly(adp-ribose) glycohydrolase in the control of poly(adp-ribose) metabolsim. Exp Cell Res. 268(1):7-13.Shimokawa, T., M. Masutani, S. (3) Nagasawa, T. Nozaki, N. Ikota, Y. Aoki, H. Nakagama, and T. Sugimura. 1999. Isolation and cloning of rat poly(adp-ribose) glycohydrolase: presence of a potential nuclear export signal conserved in mammalian orthologs. J Biochem (Tokyo).126(4):748-755. (4) Ying, W. and R. A. Swanson. 2000. The poly(adp-ribose) glycohydrolase inhibitor gallotannin blocks oxidative astrocyte death. Neuroreport. 11(7):1385-1388. (5) Ying, W., M. B. Sevigny, Y. Chen, and R. A. Swanson. 2001. Poly(ADP-ribose) glycohydrolase mediates oxidative and excitotoxic neuronal death. Proc Natl Acad Sci U S A. 98(21):12227-12232. (6) van Molle, W., J. Vanden Berghe, P. Brouckaert, and C. Libert. 2000. Tumor necrosis factor-induced lethal hepatitis: pharmacological intervention with verapamil, tannic acid, picotamide and K76COOH. FEBS Lett. 467(2-3):201-205. (7) Vuk-Pavlovic, Z. and M. S. Rohrbach. 1990. Modulation of inflammatory cell function by cotton bract tannin: changes in the capacity of alveolar macrophages and neutrophils to produce hydrogen peroxide. Am J Respir Cell Mol Biol. 3(3):235-243. (8) Nanavaty, U. B., R. Pawliczak, J. Doniger, M. T. Gladwin, M. J. Cowan, C. Logun, and J. H. Shelhamer. 2002. Oxidant-induced cell death in respiratory epithelial cells is due to DNA damage and loss of ATP. Exp Lung Res. 28(8):591-607. (9) Ziegler, M., and S. L. Oei. 2001. A cellular survival switch: poly (ADP-ribosyl)ation stimulates DNA repair and scilences transcription. Bioessays. 23(6):543-548.
(10) Molinete, M., W. Vermeulen, A. Burkle, J. Menissier-de Murcia, J. H. Kupper, J. H. Hoeijmakers, and G. de Murcia. 1993. Overproduction of the poly(adp-ribose) polymerase DNA-binding domain blocks alkylation-induced DNA repair synthesis in mammalian cells. EMBO J. 12(5):2109-2117. (11) Bors, W., C. Michel, and K. Stettmaier. 2000. Electron paramagnetic resonance studies of radical species of proanthocyanidins and gallate esters. Arch Biochem Biophys. 374(2):347-355.
Ábrafeliratok 1. ábra Az A549 sejtek életképességének változása PARG gátlás és hidrogén peroxid kezelés hatására. A panel MTT assay, B panel PI felvétel vizsgálata. 2. ábra A gallotannin hatása a PARP aktivációjára A549 sejtekben. A panel radioaktív NAD + beépülés, B panel in situ PARP assay 3. ábra A PAR felszaporodásának kimutatása A549 sejtekben. A nyilak a pozitív sejtmagokra mutatnak. 4. ábra A NAD + szint csökkenésének megakadályozása PARG gátlásával hidrogén peroxid kezelést A549 sejtekben. 5. ábra A kaszpáz aktiváció eltolódása hidrogén peroxid kezelt A549 sejtekben PARG gátlás hatására.