014.04.14. Makromolekulák analízise és elválasztása Miért van szükség centrifugára? A fehérje molekulatömege 40 kda = 40 kg/mol T= 0 C =93 K m=(40 kg/mol):(6 10 3 mol)=6,67 10-3 kg Helyzeti energia változása ΔE helyzeti =m g Δh Szedimentáció, elektroforézis Biofizika szeminárium 014.03.4. Δh=1 cm ülepedés ΔE helyzeti =6,67 10-3 kg 9,81 m/s 0,01=6,54 10-4 J Mozgási energia függőleges komponense: E 1 k T k-boltzmann állandó :1,380 10 3 J/K k,z 0,5 1,38 10 J 93K,0 10 J 3 1 K E mozgási E helyzeti =,0 10 1 J 6,54 10 4 J 309 Rotorok Erők Rotorok geometriája Kilendülő-fejes rotor Forgástengely F s :Súrlódási erő: fv részecske: m, ρ 0 F s F cf F f r max r á r min forgástengely a Nyugalomban Forgás közben Szög rotor m F f :Felhajtó erő: 0Vg 0 r F cf : ma mr r min r á r max b c r min r á r max F s =F cf -F f Ülepedési út hossz 1
014.04.14. A relatív centrifugális gyorsulás kilendülőfejes és szög rotor esetén, ha a fordulatszám 40 000 fordulat/perc (rpm) F centrifug mr Sűrűség-grádiens módszer Meselson-Stahl kísérlet (1958) Beckman SW41 kilendülőfejes rotor (13 ml) g min = 119,850g; g av = 196,770g; g max = 73,690g F felhajtó m k r Beckman 70.1Ti szög rotor (13 ml) g min = 7,450g; g av = 109,10g; g max = 146,680g Ha ρ = ρ k akkor F f = mrω = F f és v = 0! Nagy molekulatömeg, kis méret: CsCl, CsBr, glicerin, szukróz (szacharóz), fikoll Matthew Meselson amerikai biológus (1930-) Franklin Stahl amerikai biológus (199-) 14 N Számolási példa Érdekességek Nem konzervatív! Nem diszperzív! Mekkora fordulatszámot kell beállítani az 5 cm sugarú rotorral rendelkező centrifugán, ha 80000 g-t kell alkalmaznunk két fehérje elválasztásához? RCF= 80000g acp RCF g a cp r 4 n r a cp N 4 r 0,011N r 60 a=80000x10=800000 n- másodpercenkénti fordulatszám N- percenkénti fordulatszám r-sugár (m) LDL (rossz) és HDL (ún. "jó" koleszterin. Alacsony szintje esetén nő az érelmeszesedés, a szívinfarktus és az agyvérzés kockázata.)koleszterin elkülönítése. Vizelet Üledékben vörösvértestek, fehérvérsejtek, hámsejtek, fehérjecilinderek, oxalát-, húgysav-, kálcium- foszfátkristályok és baktériumok is jelen lehetnek. Vér - laborvizsgálat N a cp 0,011r N=10 415 rpm lazarsoftware.com/edu/elvalasztastechnika.pdf
014.04.14. Miért jó? Elektroforézis fajtái ESR technika (erythrocyte sedimentation rate) vagy Westergren ESR I. Szabad elektroforézis It can sometimes be useful in diagnosing some diseases, such as multiple myeloma, temporal arteritis, polymyalgia rheumatica, various auto-immune diseases, systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease[5] and chronic kidney diseases. In many of these cases, the ESR may exceed 100 mm/hour.[6] It is commonly used for a differential diagnosis for Kawasaki's disease and it may be increased in some chronic infective conditions like tuberculosis and infective endocarditis. Stages in erythrocyte sedimentation: Elektroforézis II. Gélelektroforézis 1. Agaróz gélelektroforézis. Poliakrilamid gélelektroforézis 3. Grádiens gélelektroforézis 4. Izoelektromos fókuszálás 5. Kétdimenziós elektroforézis III. Kapilláris elektroforézis There are 3 stages in erythrocyte sedimentation A részecskéknek, molekuláknak elektromos erőtér hatására bekövetkező mozgását elektroforézisnek nevezik. IV. Blotting technikák 1. Southern Blot. NorthernBlot 3. Western Blot SDS poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) Diszkontinuus PAGE stacking gél felső, ph = 6,8 Semleges forma túlsúlya, kis elektroforetikus mobilitás nátrium-dodecil-szulfát (sodium-dodecyl-sulphate) szeparáló gél, ph = 8,9 Negatív forma túlsúlya, nagy elektroforetikus mobilitás ph = 8,3 ph = 6,8 5% akrilamid ph = 8,9 8-1% akrilamid Stacking felső gélben: Cl - mobilitása sokkal nagyobb 1. alsó zónában gyorsabban, egyedül halad. a zóna elektromos ellenállása (R) kisebb Sorba kapcsolt zónákban az áramerősség (I) azonos A feszültség: V = I R tehát nagyobb lesz a glicinzónában Feszültség grádiens alakul ki. V TEMED (tetrametil-etilén-diamin) ph = 8,3 Ha egy glicinmolekula előrediffundál, a kisebb feszültség miatt lelassul Ha egy Cl - lemarad, a nagyobb feszültség miatt felgyorsul ammónium-perszulfát Így az ionfázisok szétválása és a feszültséggrádiens fokozatosan egymást erősítik 3
014.04.14. A stacking gélben a fehérjék mobilitása a Cl - és a glicin között van ezért közöttük haladnak, egy keskeny sávba tömörülve A szeparáló gélben Kapilláris elektroforézis Elektromos térben az oldott anyagok különböző sebességgel vándorolnak, töltésüknek és tömegüknek megfelelően: kis méret, nagy töltés nagy mozgékonyság/gyors nagy méret, kis töltés kis mozgékonyság/ lassú A módszer alapja: Elektroozmotikus áramlás (EOF) a nagyobb ph mellett a glicin töltése negatív, nagyobb lesz a mobilitása is Mobilitási sorrend: Cl -, glicin, fehérjék az ionfront a fehérjék előtt halad a nagyobb ph növeli a fehérjék mobilitását a kisebb pórusméret (nagyobb akrilamid %) csökkenti Az elektroforézis egy vékony, 5-75 µm belső átmérőjű, puffer-oldattal töltött kapillárisban történik. Szétválás elsősorban a méret, kisebb részt az alak és a töltés szerint Detektálás: OD, λ = 00 nm Az elektroozmotikus áramlás kialakulása negatív töltésű kvarc kapilláris belső felülete (Si-O-) hidratált kationok gyűlnek össze a felület közelében tömeg-áramlás alakul ki az elektromos tér létrehozása miatt tamop41a.ttk.pte.hu Vándorlás: 1. Kationok. Töltés nélküli részecskék 3. Anionok Kapilláris elektroforézis előnyei: Összes részecske azonos irányban mozog Csekély hőfejlődés Rövid mérési idő Nagy szelektivitás Nagy elválasztási hatékonyság Minimális mintatérfogat (1-10 nl) Könnyen automatizálható Más eszközökhöz (MS) kapcsolható Az EOF egy másik fontos előnye, hogy az gyakorlatilag az összes részecskét, függetlenül azok töltésétől, azonosirányú mozgásban tartja. Kapilláris elektroforézis hátrányai: Preparatív léptékben nem működik Megfelelő koncentráció és oldhatóság Rossz reprodukálhatóság http://camis.sr.unh.edu/camis/ce.html Kitapadó vegyületek 4
014.04.14. Blot technikák Mit? Mivel? Southern specifikus DNS-szekvencia DNS-DNS hibridizáció Northern specifikus RNS-szekvencia RNS-DNS hibridizáció Western specifikus fehérje szekvencia fehérje-ellenanyag Eastern posztszintetikus fehérjemódosítás foszfát, szénhidrát, lipid Western blot Southern/ Northern blot Edwin Southern angol biokémikus (1938-) 5