Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése, diagnosztikai alkalmazásai Diagnosztikai és terápiás módszerek biofizikai alapjai Tóth Mónika Ágnes PTE ÁOK Biofizikai Intézet 2010.04.19.
Az áramlási citométer és sejtszorter felépítése és működése Kereskedelmi forgalomban kapható készülékek
Fogalmak Áramlási citometria (flow cytometry) Eljárás vagy mérési módszer, amellyel folyadékáramban lévő önálló részecskék, pl. biológiai sejtek egyedi tulajdonságait fizikai, kémiai, biokémiai, biológiai jellemzőit - tudjuk lemérni Flow Sorting Sejtek vagy részecskék elkülönítése, elválasztás mért paramétereik szerint FACS: Fluorescence-Activated Cell Sorting Eredetileg csak a szorting folyamatot nevezték így, ma az analizátorokra is használják (Valójában helytelenül).
A flow citometria fejlődése
Gucker - 1947 Áramlási citométer baktériumok detektálására aeroszolban A fejlesztés a II. Világháború idején történ, 1947-ben publikálták A cél a levegőben terjedő baktériumok gyors detektálása volt, a biológiai fegyverek kimutatására Készülék: Egy sötét-látóteres mikroszkóp cellájában áramoltatták a szűrt levegőt. A lámpa a Ford autógyár reflektor-lámpája volt, detektálásra PMT-t használtak.
Wallace Coulter - Coulter orifice (1956) 1953-ban szabadalmaztatott technika Az elektromos vezetőképesség (ellenállás) változásait detektálta miközben a sóoldatban (pufferban) szuszpendált sejtek áthaladnak egy vékony nyíláson.
Photo by J.Paul Robinson Photo by J.Paul Robinson A szabadalmi bejelentés kézirata Az első kereskedelmi forgalomba került számláló (Coulter Counter)
Kamentsky (1965) Az első sejt szorter. A fényszórást HeNe lézerrel mérte. A fluoreszcenciát detektáló modell elődje.
Mack Fulwyler sorter (1965) A sejtek elválasztása térfogatuk alapján történ, a Coulter counter elv szerint. A kiválasztott sejtek elkülönítése elektrosztatikus eltérítéssel történt (a nagysebességű szorting alapja ma is ez). A felhasznált elv: Tintasugaras nyomtató (Richard Sweet, Stanford, 1965). Neutrofil sejteket és limfocitákat tudtak elválasztani vérből.
Milyen funkcókra képes egy flow citométer? Részecskék sejtek - számlálása sejtszupenzióban Biologiai és nem biologiai elkülönítése Élő és nem élő részecskék, sejtek elkülönítése 10 5-10 6 számú részecske mérése 1 percen belül Részecskék fényszórásának és/vagy belső fluorescenciájának mérése Sorting: egyedi részecskék elkülönítése
A mérések alapelvei A részecskék egy hidrodinamikailag fókuszált folyadékáramban haladnak át egy gerjesztő fénynyalábon (lézer, Hg-gőz lámpa, stb.) Fény szórásjelek detektálása Specifikus fluoreszcencia detektálása Multiparaméteres adat analízis Electrosztatikus vagy mechanikus részecske szeparálás: szorting
Technikai felépítés Fényforrás Detektáló rendszer Áramlási rendszer (folyadék) Szorting Adatgyűjtés Adat analízis Biologiai kísérleti rendszer
Az áramlási tér jelentősége, tulajdonságai: Hidrodinamikai fókuszálás
Áramlási citométer cella
Hidrodinamikai rendszer
Hidrodinamikai fókuszálás A köpenyfolyadék koncentrikus körökben veszi körül a mintafolyadékot (lamináris áramlás). Ezáltal a mintafolyadékot az áramlási fej közepére fókuszálja A hidrodinamikai fókuszálás célja: a sejtek ott haladjanak,ahol a lézer megvilágítja őket.
Sejtszeparálás - szorting A piezoelektromos kristály rezgése cseppekre bontja a folyadékoszlopot. A cseppeket a mért fényszórás és fluoreszcencia jelek alapján töltik fel pozitív vagy negatív töltéssel.
Az áramlási citométer optikai felépítése, optikai jelek detektálása
Technikai komponensek Fényforrás: Gerjesztő/megvilágító rendszer Lézerek (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag, szilárdtest Ívlámpák Higany-gőz, Hg-Xenon (megfelelő vonalak Detektáló rendszer Fotomultiplier csövek (PMTs) Fotodiódák Régebben 1-2 cső Jelenleg akár 12-15 db. Többnyire az előre irányuló szórás (FSC) mérésére
A detektor rendszer optikai elrendezésének elve Áramlási cella Dikroikus tükrök Áteresztő fényszűrők
FSC=Előreszórás (sejtméret) SSC=Oldalszórás (sejtgranuláltság)
Dikroikus tükrök
Analóg jelek FSC SSC FITC Lézer késleltetés APC
A memóriában megjelenő számok digitális készülékben
A számok konvertálása paraméterekké Jelszélesség: Mintavételek száma Csúcsmagasság: A legnagyobb számérték Terület: A számok összege Nincs holtidő!!!
Fluoreszcens jelölés A fluoreszcencia alapjai
Felületi marker analízis A leukociták és (más sejtek) jellegzetes molekula kombinációt expresszálnak a sejt felszínén,ami függ A sejtek típusától A sejtek differenciálódási stádiumától A sejtek aktivációjától, inaktivációjától A sejtek egyéb funkcionális állapotától A kóros elváltozásoktól,differenciálódási mechanizmusoktól Tipikus detektálásuk monoklonális antitestekkel történik Áramlási citometriás célra az antitesteket fluoreszcencen jelöljük: direkt, indirekt
Fluoreszcens jelölés Single fluoreszcens festékkel Tandem festékkel Akceptor Donor Akceptor Donor
Önálló (Single) festékek Tandem festékek
Fluoreszcens festékekkel szemben támasztott követelmények: Emittáljanak olyan hullámhosszon, ahol kicsi az autofluoreszcencia Az emissziós spektrumuk a lehető legkisebb átfedést mutassa a többi festék spektrumával (kompenzáció) Kvantumhatásfokuk, abszorpciós együtthatójuk legyen magas, azaz produkáljanak erős, jól detektálható fluoreszcenciát (érzékenység) Aspecifikus kötődésük legyen kicsi Legyenek olcsók A fehérjék (antitestek) jelölése egyszerű protokollal legyen megvalósítható Ne módosítsák jelentősen a jelölt molekula tulajdonságait
Fluorokrómok
Mérési eredmények tárolása, mentése
Az adatok tárolása Az adatok elmentése ún. FCS (flow cytometry standatrd) file-ban történik, ahol minden sejtről elmentik az összes mért adatot = list mode file
Az adatok megjelenítése I. Egydimenziós ábrázolási mód: hisztogram a logaritmikus skála előnye: Összenyomja a skálát a magas értékeknél Sok biológiai paraméter lognormális eloszlást mutat, ez logaritmikus skálán haranggörbének látszik. hátránya: Nulla s negatív számokat nem tuid ábrázolni Ún. binning artefaktum (úgy tűnik,hogy az alacsony intenzitású populásió elnyúlik balra,és az első csatornában sok sejt halmozódik fel.) megoldás: Olyan skála, amely alacsony értékeknél lineáris, magasaknál logaritmikus: hiperlog skála
Az adatok megjelenítése II. Kétdimenziós ábrázolási módok: 1. Dotplot: A 2 tengelyen 1-1 mért paramétert tűntetünk fel, az ábrán minden pont egy sejtnek felel meg 2. Density plot: az ábrán minden pont színe a sejtek számát jelenti. 3. Contour plot: az azonos sejtszámú pontokat vonalakkal kötik össze. 4. 3D (surface,felszín) ábra: a sejtek számát a z tengelyen ábrázolják (ritkán alkalmazott)
Kapuzás Az összes lemért FL4 eloszlása. Csak a piros kapun (limfociták) belül lévő sejtek FL4 eloszlása.
Az áramlási citométer diagnosztikai alkalmazásai
Immuntipizálás áramlási citometriával
Sejtciklus és DNS tartalom analízis 1. A sejteket fixáljuk és permeabilizáljul, hogy a DNS festék hozzáférjen a DNS-hez. 2. A DNS festék (pl. propidium jodid) eljut a sejtmagba, és ott sztöchiometrikusan kötődik a DNS-hez. 3. A mért fluorszcencia intenzitása arányos a sejt DNS tartalmával. Alkalmazási terület: Daganatos sejtek A normálisnál magasabb DNS tartalommal rendelkeznek Magasabb S és G2/M aránnyal rendelkeznek
Multiplex Microbead Assay (MMA)
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET