A TUMOR NEKRÓZIS FAKTOR RENDSZER SZEREPE A TERHESSÉG SORÁN KIALAKULÓ INZULINREZISZTENCIA ÉS A MÉHNYAKRÁK PATOMECHANIZMUSÁBAN

Átírás

1 A TUMOR NEKRÓZIS FAKTOR RENDSZER SZEREPE A TERHESSÉG SORÁN KIALAKULÓ INZULINREZISZTENCIA ÉS A MÉHNYAKRÁK PATOMECHANIZMUSÁBAN Dr. Melczer Zsolt Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar II. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Témavezető: Dr. Cseh Károly Dr. Falus András Budapest Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris orvostudományok Tudományági Doktori Iskola /7/ Szigorlati bizottság: Dr. Fekete Béla egyetemi tanár Dr. Pajor Attila egyetemi tanár Dr. László Ádám oszt. vez. főorvos Hivatalos bírálók: Dr. Csermely Péter egyetemi tanár Dr. Pálfalvi László főorvos Biráló bizottság tagjai: Dr. Doszpod József egyetemi tanár Dr. Rosivall László egyetemi tanár Dr. Csapó Zsolt egyetemi docens Dr. Lintner Ferenc oszt. vez. főorvos Dr. Nékám Kristóf oszt. vez. főorvos

2 Rövidítésjegyzék ADAM- az intergrin kapcsolatot gátló és metalloproteáz doménekkel rendelkező enzimcsalád (a disintegrin and metalloprotease), AP-1 aktivátor protein-1, ATCC- Amerikai Sejtkultúrák Gyűjteménye (American Type Culture Collection), BAFF- B-sejt aktiváló faktor (B-cell activating factor belonging to TNF family), BCMA- B- sejt érési antigén (B-cell maturation antigen), BMI- testtömeg index (body mass index), CARD- kaszpáz toborzó domain (caspase recruiting domain), Caspase (kaszpáz)- cisztein aszpartáz, CD- a sejtfelszíni rendszer monoklonális antitestekkel történő jellemzésére használt nomenklatúra (cluster of differentiation), ConAconcanavalin-A, CV- variációs együttható (coefficient of variance), DcR- csali receptor (decoy receptor), DDhalál domén (death domain), DED- halál végrehajtó domén (death effector domain), DM- diabetes mellitus, DNS- dezoxiribonukleinsav (desoxiribonucleic acid), DR- halál receptor (death receptor), EBP- enhancer kötő fehérje (enhancer binding protein), EDA- ectodyspasin-a, EDAR- ectidysplasin-a receptor, EGF- epidermális növekedési (growth) faktor, FADD- Fas-szal kapcsolódó halál doménnal rendelkező protein (Fas-associated DD protein), FCS- borjú szérum (fetal calf serum), FFA- szabad zsírsav (free fatty acid), GITR- glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor family- related protein, GLUT-4- glukóz transzporter-4, GRBnövekedési faktor receptor kötő fehérje (growth factor receptor binding protein), HRG- heregulin, HVEMherpesz vírus belépését segítő struktúra (herpes virus entry mediator), ICAM-1- intercelluláris adhéziós molekula, IFN- interferon, IL- interleukin, IRAK- IL-1 receptorhoz kötődő kináz (IL-1-R associated kinase), IRS-1 inzulinreceptor-szubsztrát-1, JNK- cjun-n-terminális kináz, KB- kilobázis, kd- kilodalton, L- receptorokhoz kötődő molekula (ligand), LIGHT- HVEM/TNFR kapcsolódó struktúra (ligand of HVEM/TR2), LPS- lipopoliszacharid (bakteriális), LT- lymphotoxin, MAP- mitogén aktivált fehérje (mitogen activated protein kinase) enzimcsalád, MAPK- MAP kináz, MHC- fő hisztokompatibilitási osztály (major histocompatibility class), mrns- hírvivő ribonukleinsav (messenger ribonucleic acid), NF-κB- nukleáris faktor-κb, NGF- idegsejt növekedési faktor (nerve growth factor), OGTT- orális glükóz tolerancia teszt, PHA- phytohemagglutinin, PI3Kfoszfatidil-inozitol-3 kináz, PKC- protein kináz-c, PLC- foszfolipáz-c, PLE- placentáris enhancer, R- receptor, RAIDD- receptorokkal kapcsolódó halál doménnel rendelkező protein (receptor interacting protein-associated ICH homolog protein with DD), RANK- NF-κB-t aktiváló fehérje (receptor activating NF-κB), sf- felszíni (surface), SOS- ErbB jelátvivő út adaptor fehérje (son of sevenless), TACE- TNF-α hasító enzim (TNF-α converting enzyme), TACI- transzmembrán receptor (transmembrane activator and CAML [calcium modulator and cyclophyllin ligand] interactor), TALL-1/2- TNF-szerű ligand (TNF and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand-1/2), TGF- transzformáló növekedési faktor (transforming growth factor), TLR- TOLL-related receptor, TNF- Tumor nekrózis faktor, TOLL- különböző specieszek szöveti fejlődését irányító receptor, TOLLIP- TOLL receptorral kapcsolódó fehérje (TOLL interacting protein), TRADD- TNFR-rel kapcsolódó halál doménnel rendelkező protein (TNFR-associated DD protein), TRAF- TNFR-hez kapcsolódó faktor (TNFR-associated factor), TRAIL- TNF-hez hasonló apoptózist indukáló ligand (TNF-related apoptosis inducing ligand), TRAMP- TNF receptorhoz hasonló fehérje (TNF receptor-related apoptosis mediating protein) TWEAK- TNF-hez hasonló apoptózist gyengén indukáló fehérje (TNF-like weak inducer of apoptosis), TRKtirozin kináz, VEGF- éreredetű endotheliális növekedési faktor (vascular endothelial growth factor), VLDL- igen alacsony sűrűségű lipoprotein (very low density lipoprotein), WHR- derék-csipő hányados (waist to hip ratio)

3 Bevezetés A TNF rendszer biológiai szerepe A TNF rendszerrel kapcsolatos kezdeti megfigyelések a 18. század végére nyúlnak vissza. William B. Coley New York-i sebész figyelte meg, hogy bizonyos fertőzések lezajlását követően egyes daganatos betegségben szenvedő egyénekben a tumor remissziója figyelhető meg ban publikálta szarkómák kezelésében felhasznált hővel elölt streptococcusokat tartalmazó szuszpenzióval kapcsolatos tapasztalatait (1). A szerző a Coley-toxinnal 40 éves pályafutása során több mint 200 beteget kezelt. Betegeinek egy harmada - elsősorban azok, akik kötőszöveti eredetű tumorokban limfo- vagy oszteoszarkómában szenvedtek - került hosszú évekre remisszióba. A mai ismereteink alapján a bakteriális kivonat a szervezet mononukleáris sejtjeiből TNF felszabadulást indukált. A felismerés 100 éven keresztül feledésbe merült. Aggarwal és munkatársai 1985-ben közölték a bakteriális lipopoliszacharid hatására termelődő, a tumorok pusztulását okozó citokint, amelyet tumor nekrózis faktornak neveztek (2). Egyidejűleg Beutler és munkatársai igazolták, hogy bizonyos krónikus fertőző betegségben szenvedő állatokban a kachexiához vezető makrofág eredetű citokin, amelyet cachectinnek neveztek, azonos a TNF-α-val (3). Ez a munkacsoport figyelte meg elsőként a TNF-α metabolikus hatásai közül a zsíranyagcsere befolyását. Leírták, hogy az állatok szérumában a kachexia során triglicerid szint, elsősorban VLDL emelkedés figyelhető meg. A szerzők megfigyelték azt is, hogy a TNF-α gátolja a zsírsejtek differenciálódását, csökkenti az érett zsírsejtek mrns tartalmát, a zsírsejtekben lévő lipoprotein lipáz enzim bioszintézisét, a triglicerid szintézisben résztvevő enzimek, zsírsavkötő fehérjék termelődését. Az említett munkacsoport eredményei tisztázták továbbá, hogy a bakteriális fertőzéseket kísérő endotoxin kiváltotta sokk és a következményes szövetkárosodás egyik kulcsfontosságú közvetítője szintén a TNF-α (4). Az elmúlt két évtized során közlemények ezrei foglalkoztak a TNF-rendszernek a szervezet szinte valamennyi sejttípusára, szövetére, szervére gyakorolt hatásaival. A TNF-rendszerrel foglalkozó kutatások jelentősen bővítették az immunrendszer kommunikációs mechanizmusaival, elsősorban a citokinekkel és receptoraikkal, a sejtfelszíni struktúrák felszínről történő leválásával valamint a programozott sejthalállal kapcsolatos tudásunkat. A szűkebb TNF- (TNF ligand) család képviselői közül jelenleg 4 tag, a TNF-α, a LT-α (korábbi nevén TNF-β), a LT-β és az ún. LIGHT ismert. A család legnevezetesebb tagjának, a TNF-α-nak a molekulatömege 17,5 kd, 157 aminosavból épül fel. A szintézis létrejötte után egy 76 aminosavból álló szignálpeptid rész segíti elő a szekrécióját. Génje a 6-os kromoszóma rövid karján, az MHC rendszer két osztályának (az ún. class 1 és 2) génjei között, a 3-as osztály területén helyezkedik el. A fenti ligandok a TNF-R család jelenleg ismert 4 tagjával léphetnek kapcsolatba. A TNF-α az 55 kd-os R-1- gyel (CD 120a) és a 75 kd-os R-2-vel (CD 120b), az LT-α a TNFR-1-gyel és 2-vel, az LT-β az LT-βR-al, a LIGHT a HVEM-al és az LT-βR-al. A TNF-ligand és receptor família tagjai (az NGFR és ligand kivételével) trimer formában vannak jelen, ez az aktív állapotunk. Az LT-β kivételével homotrimerek, ez utóbbi egy vagy két β-variánst és kettő vagy egy α-variánst tartalmaz. A TNF-család mono-, di-, tetra-, penta- és multimer alakjait is kimutatták, ezek azonban mind inaktív formák. A TNF-α-nak membránhoz kötött és szolubilis formája egyaránt ismert, a LT-α csak szolubilis, a LIGHT és a LT-β két variánsa ( a β1α2, illetve a β2α1) csak membránkötött változatban fordul elő. A TNFR-1-t és 2-t szolubilis és membránkötött alakban egyaránt kimutatták, a HVEM és a LT-βR esetében a szolubilis változat előfordulását nem igazolták. A fenti lehetőségek nagyfokú változatosságot tesznek lehetővé a TNF-rendszer biológiai hatásait illetően. A termelődés helyén, illetve a szomszédos sejtek felszínén megjelenő TNF-, illetve TNFR-változatok auto-, juxta- és parakrin effektusokat, míg a szolubilis formák endokrin hatásokat hozhatnak létre (2, 5, 6). Tágabb értelemben bizonyos fehérjeszerkezeti rokonság alapján a TNF-családhoz számos ligand (CD27L/CD70, CD30L, CD40L/CD154, CD95L/FasL, CD134L/OX40L, CD137L, TALL-1/BAFF, TALL-2/APRIL, APO2L/TRAIL, APO3L/TWEAK, RANKL, EDA, GITRL, NGF, VEGI) és receptoraik (CD27, CD30, CD40,

4 CD95/Fas, CD134/OX40, CD 137, TACI, BCMA, DR3/TRAMP, Fn14, DR4/TRAIL-R1, DR5/TRAIL-R2, DR6, DcR1, DcR2, RANK, osteoprotegerin, EDAR, GITR és p75ngfr) tartoznak. A receptorok közös jellemzője, hogy több (általában 2-3-4) cisztein aminosavban gazdag domént tartalmaznak. A TNF család tagjainak jelölésére, a kétségtelenül zavaros fenti betűszimbólumok helyett, újabban számozást alkalmaznak a tumor nekrózis faktor családot jelképező betűk után (TNFSF a ligandok és TNFRSF a receptorok jelölésére). Az említett családtagok számos élettani és patológiás folyamatban alapvető szerepet töltenek be, így irányítják az adaptív immunválasz sejtjeinek működését, a csontrendszer, a bőr, az idegrendszer funkcióját. A ligandok egy része és receptoraik (TNF-α/TNFR-1, LTα3/TNFR-1, FasL/Fas, APO3L[TWEAK]/DR3, TRAIL/DR4, TRAIL/DR5) szerepelnek a programozott sejthalál elindításában (7, 8). Mind a TNF-ligandoknak, mind a TNFR-oknak a sejtmembránról való leválását a transzmembrán ADAM családba tartozó, metalloproteáz enzim, a TACE vagy ADAM17 végzi. A TNF-α-t számos sejttípus, elsősorban a mononukleáris fagocita rendszer sejtjei termelnek különféle stimulusokra (főleg Gram-negatív baktériumok sejtfalából származó LPS). Az LPS a TNF-α termelődését a sejtfelszínen elhelyezkedő TOLL-szerű receptor családhoz (TLR) kötődve indítja el. A TLR rendszer az IL-1 jelátviteli úton keresztül vezet transzkripciós faktorok, így az NF-κB aktiválódásához. Ezen transzkripciós faktorok indítják el azután a proinflammatorikus citokinek, így a TNF-α szintézisét is (9). A TNF promoter területén, a fenti tisztázott folyamatokban keletkező transzkripciós faktorok kötőhelyein kívül más LPS hatását közvetítő specifikus kötőterületek is találhatók (p300, CREB, CRE, Egr1, ETS, Elk1, Sp1). A citokin expresszióját különböző sejttípusokban fokozzák továbbá az NFAT, ATF2, és a LITAF is. A TNF-α gén promoterének területén több nukleotid polimorfizmus található a -163, -238, -244, -308, -574, - 851,- 856, -857, -862,- 863, pozíciókban. Jelentőségük, humán kórképekkel való asszociációjuk jelenleg nem pontosan ismert. Egyes vizsgálatokban a -238 (G/A), a -308 (G/A) és a -863 (C/A) polimorfizmusok mutattak kapcsolatot a TNF-α expresszió mértékével, asszociációt infektológiai és immunológiai kórképekkel, a citokin zsírszöveti termelődésének mértékével, obezitással, inzulinrezisztenciával (7). A TNF-α szerepe az inzulinrezisztencia kialakulásában Beutler és Cerami a cachexia kialakulását vizsgálva írta le, hogy a makrofágokból szekretálódó cachectin gátolja a zsírsejtek lipogenetikus folyamatait és fokozza a lipolitikus mechanizmusokat. Igazolták a cachectin és a TNF-α identitását (3, 4). Már ezekből a kírésletekből is gyanítható volt a citokin anyagcsere folyamatokban betöltött szabályozó működése. A XX. század 90-es éveitől kezdve irányult a figyelem a zsírszövet endokrin funkciójára és ezen belül az itt termelődő citokinek metabolikus folyamatokat irányító szerepére. Ezzel kapcsolatban a kezdeti alapvető megfigyelés az volt, hogy a TNF-α termelődik a zsírszövetben, valamint, hogy a zsírsejtek szekretálják is a proteint. Hotamisligil és munkatársai észlelték, hogy az elhízás természetesen előforduló állatmodelljeiben (ob/ob egér, db/db egér, fa/fa egér és patkány), valamint az emberi elhízásban, a zsírsejtekben a TNFα fokozott mértékben képződik (10). A munkacsoport vizsgálataiból kiderült az is, hogy a zsírszövetben termelődő TNF-α gátolja az inzulin jelátviteli folyamatait, és inzulinrezisztenciát okoz (11). Jelenleg vitathatatlan, hogy mind több adat támasztja alá a TNF-α inzulinrezisztenciával való kapcsolatát, elsősorban az elhízáshoz társuló inzulinrezisztenciában betöltött szerepét, és így az elhízás-inzulinreszisztencia-2-es típusú DM patogenetikai folyamatban való részvételét. Az összefüggések számos részlete még pontosabb tisztázást igényel, a patogenetikai kapcsolatok döntő része azonban már jelen ismereteink alapján is jól értelmezhető. Az inzulinrezisztencia mai ismereteink szerint a szervezet legtöbb szövetét érinti. 2DM-ben kitüntetett jelentősége van a zsír-, izom- és májszöveti inzulinrezisztenciának. A zsírszöveti inzulirezisztencia elsősorban a zsírsejtekben zajló lipolitikus folyamatok inzulin hatására létrejövő gátlódásának elmaradását jelenti. A zsírszövetben fokozódik a lipolízis, károsodik a glukóz-felvétel. Az izomszövetben csökken az inzulin stimulálta glukóz transzport és a glikogén szintézis, a májban pedig

5 az inzulin gátló hatása glukózkibocsátása. Az inzulinrezisztencia fokozódása egy kritikus szint felett tartós fennállás esetén károsithatja a hasnyálmirigy β-sejtjeinek inzulin termelését is. A TNF e folyamatok mindegyikében részt vesz, részben közvetlenül, auto- illetve parakrin módon, részben közvetett hatásokon keresztül. Hatásainak további része endokrin mechanizmussal érvényesül. Igy pl. a keringésbe került TNF-α a hasnyálmirigy szigetsejtjeiben gátolja az inzulin szekréciót (12). Az inzulinreceptor aktiválódása és a jelátvitel kezdeti lépései a részt vevő tényezők többszörös foszforilációján keresztül valósulnak meg. A jelátvitel során a leglényegesebb, hogy a célszervekben (pl. izom és zsírszövet) a GLUT-4 transzporter fehérje intracelluláris raktározási helyéről (a tubulovezikuláris rendszer) a membránba kerül, ahonnan a glukóz megkötődése után ismét intracelluláris helyzetbe jut. A GLUT-4 transzporterhez a jel az inzulin megkötődése után kétféle úton juthat el. Az egyik út a PI3K aktivációja révén, a másik a lipid-tutajok -ba horgonyzott adaptor fehérjékkel valósul meg. Mindkét út kezdeti közös eleme az inzulin receptorának α-láncához történő kötődése, mely a receptor β-láncában elhelyezkedő specifikus tirozin-maradékok autofoszforilációját eredményezi. Az első út esetében az aktiválódott receptorhoz az IRS-ek (-1-4) kapcsolódása jön létre, majd a szubsztrátokon specifikus tirozin-maradékok foszforilálódnak. Ezután a szubsztrátokhoz, mint dokkolásra szolgáló struktúrához számos protein kötődik a foszforilálódott tirozin-maradékokat használva kötőhelyként. Ilyen pl. a PI3K két alegységének kapcsolódása, amely az enzim aktiválódásához vezet. Ezen enzim működésének elindulása foszfoinozitid-3,4,5-trifoszfát keletkezéséhez vezet, amely a foszfoinozitid-függő kináz-1 (PDK1) aktivációját idézi elő. Ez az enzim azután foszforiláció révén aktiválja mind a PKB, mind az atípusos PKC λ/ζ enzimeket. Ez utóbbiak eddig ismeretlen tagok aktiválása révén idézik elő a GLUT-4 transzlokációját a membránba. A másik út PI3K aktiválástól független jelátviteli út. Ennek a jelátviteli útnak az aktiválódásában alapvető szerepet töltenek be a caveolae/lipid-tutaj területén elhelyezkedő fehérjék. Ezek a membránon különböző helyzetben lévő proteinekkel való kapcsolatokat alakítják ki. A lipid-tutajok biztosítják az inzulin receptorok megfelelő kompartmentalizációját a sejtmembránban és segítik elő megfelelő fehérjekomplexek felépülését. Az inzulin receptor aktiválódása kiváltja a lipid-tutajban helyet foglaló flotillin kapcsolódását a CAP (Cbl fehérjével kapcsolódó fehérje) proteinhez, ez azután elősegíti a Cbl fehérje megkötődését a komplexhez. Ez utóbbi a CrkII (Cbl toborzó kináz II) enzim megkötődését közvetíti. Ehhez kötődik a C3G (guanin nukleotid kicserélődését végző fehérje), amely a TC10 fehérjén végrehajtja a GDP GTP-re történő kicserélését. A fehérjekomplex hatására aktin polimerizáció következik be, amely végső soron a GLUT-4 membránba jutását eredményezi (13). Mindkét jelátviteli folyamat egyes tényezőinek foszforilációs változása gátolhatja az inzulin jelátvitel folyamatát. A TNF működését illetően részleteiben csak az inzulin receptor autofoszforilációjára és az IRS-k foszforilációjára gyakorolt hatás ismert. A TNF-α hatására szerin és threonin-maradékok foszforilálódhatnak elsősorban az IRS-ekben. Az IRS-ek ilyen mintázatban történő foszforilálódása gátolja a tirozin-maradékokon bekövetkező foszforilációt, megakadályozva ezzel a PI3K dokkolását, aktíválódását. A citokin gátolja továbbá az inzulinreceptor autofoszforilációját, következésképp a GLUT-4 sejtmembránba jutását. A TNF hatására létrejövő foszforilációs mintázat változás az inzulin jelátviteli út számos tényezője, valószínűleg a MAP-kináz enzimek, a szfingomielináz enzimek illetve egyes foszfatázok aktiválása következtében jön létre. A TNF-α inzulin jelátvitelt gátló hatását a zsírszövetben minden bizonnyal direkt, autokrin úton fejti ki. Erre utal, hogy a zsírsejtekben mind a citokin, mind 1 és 2 típusú receptora is megtalálható. Elképzelhető azonban parakrin és endokrin hatás is. Erre utalhat, hogy emelkedett TNF-α és TNFR-2 koncentrációkat is megfigyeltek a vérkeringésben elhízott egyének esetén. Korreláció mutatkozott ezen citokinek szintje, az elhízott egyének testtömeg-indexe és az inzulinrezisztencia mértéke között. Felvetődött, hogy az emelkedett TNFR-2 szint az inzulinrezisztencia és a 2DM megjelenését megelőzően ezen kórállapotok előrejelzésében is használható laboratóriumi paraméter lehet (14). Az izomszöveti inzulinrezisztenciát előidéző TNF hatás pontos mechanizmusa kevésbé világos. Leírták a TNF-α és receptorai kismértékű termelődését bizonyos körülmények között az izomsejtekben. Különbséget azonban sovány és elhízott egyének között ebben a tekintetben nem észleltek. Ugyanakkor gyakorolhat a szubkután és viscerális zsírszövetben termelődő TNF-α az izomsejtekre endokrin hatást. Elképzelhető egy harmadik zsírszöveti kompartment, a harántcsíkolt izomsejtek környezetében megtalálható zsírsejt-depot által termelt TNF parakrin hatása is (11).

6 A TNF zsírszöveti inzulinrezisztenciában betöltött szerepével kapcsolatban megválaszolatlan, igen fontos kérdés, hogy mi módon szabályozódik a TNF-α mrns és fehérje termelődése a zsírsejtekben, és hogyan függ ez össze a zsírsejtek proliferációjával és differenciálódásával. A zsírsejtek differenciálódását irányító tényezők közül a TNF működése szempontjából az EBP és a PPAR transzkripciós faktorokkal való kapcsolat ismert. A TNF-rendszer az EBP és a PPAR transzkripciós faktorokat gátolva fejti ki a zsírsejtproliferációra és differenciálódásra irányuló negatív szabályozó működését. A citokin gátolja a preadipociták proliferációját és differenciálódását, elősegíti az érett zsírsejtek dedifferenciálódását. Megfigyelték TNF-α hatására a preadipociták és zsírsejtek apoptózisát is. A citokin fokozza továbbá a szubkután zsírsejtekben a leptin gén expresszióját. A termelődő leptin fehérje viszont gátolja a TNF-α zsírszöveti termelődését. A tiazolidine-dionok a PPAR-γ farmakológiai aktivátorai, jelenleg az inzulinrezisztencia csökkentésére sikeresen alkalmazott gyógyszercsoport, a transzkripciós faktor működésének fokozása révén gátolják a TNF-α zsírszöveti expresszióját, növelve ezzel is az inzulin érzékenységet (15). A TNF-α indirekt módon is szerepel az inzulin érzékenység szabályozásában. Egyrészt fokozza a zsírszövetben termelődő egyéb citokinek (pl. a leptin, IL-6) termelődését és gátolhatja másokét (pl. adiponectin, resistin). Másrészt a zsírszövetben a lipolízis inzulin hatására bekövetkező gátlásának elmaradása fokozott FFA képződéshez vezet. Az FFA a májban és az izomszövetben gátolja az inzulin hatására bekövetkező glukóz felvételt és glukóz felhasználást. Újabban 2DM-ben a máj fokozott, inzulinnal nem gátolható glukóz kibocsátását a fokozott zsírszöveti lipolízis következtében termelődő FFA-val magyarázzák. Ez felvetheti a TNF-α fokozott zsírszöveti termelődésének szerepét a májszövet inzulinrezisztenciájában is (16). A TNF-rendszer és a leptin szerepe egyes szülészeti kórképek patomechanizmusában Megfigyelték mind a TNF-a, mind a TNFR-1 és 2 messenger-rns és fehérjék termelődését a méhlepényben. Elsősorban a lepényi eredetű sejtekben (szincicio- és citotrofoblasztokban, fetoplacentáris makrofágokban, spirális artériákban) illetve az érelemeszesedés korai jeleit, a vérzsírokat felhalmozó makrofágok érfali megjelenését mutató véredényekben volt kimutatható a proteinek termelődése. A TNF-rendszer legfontosabb funkciója a lepényben a párhuzamosan megjelenő α, β, γ interferonnal együtt a lepényi, nem specifikus immunológiai védekezés, elsősorban antivirális védekezés lehet (17). A TNF-rendszer termelődése és működése a magzat-méhlepény egységben valószínűleg fontos szerepet játszik a magzati fejlődés pontos szabályozásában is. Erre utalhat, hogy az 1960-as évek elején az akkor csak szedatív hatásúnak tartott thalidomidot szedő terhes nők magzatain súlyos károsodások léptek fel több mint újszülöttet érintve. A későbbiekben kiderült, hogy a szer a TNF-a termelődés erőteljes gátlója. Így összefüggésbe hozták a TNF-a termelődésének gátlását e fejlődési rendellenességek kialakulásával (18). Megfigyelték azt is, hogy a TNF-a messenger-rns és a fehérje is fokozott mértékben termelődik magas vérnyomással szövődött, preecclampsiában illetve ecclampsiában szenvedők lepényében és a citokin szintje a keringésben is emelkedett. Felvetették, hogy az emelkedett TNF szint a preecclampsia egyik korai markere lehetne. Patogenetikai szempontból a fokozott TNF termelődés elindítását a hipoxiával, az ennek következtében jelentkező oxidatív stresszel, a fokozódó lipid peroxidációval, hipoxia áltak indukált különböző faktorokkal magyarázzák. Fokozottnak találták a citokin lepényi termelődését vetélés, illetve koraszülés esetén is (19). Lényegében hasonló megfigyeléseket írtak le a leptin szerepével kapcsolatban is. Leírták a leptin teljes hosszúságú, illetve rövidebb receptorainak termelődését a magzat-lepényi egységben. Fokozott termelődést és anyai vérszintet figyeltek meg magas vérnyomással szövődött illetve preecclampsiában szenvedő terhesekben. Az emelkedés mechanizmusában ezen citokin esetében is a hipoxiának tulajdonítottak alapvető szerepet. Ugyancsak ezzel magyarázható a dohányzó terhesek esetében mért magasabb leptin szint is. A citokin legfontosabb funkciója terhességben is az anyai tápláltsági állapot és energiaraktárak optimális felhasználása a magzati növekedés biztosítása céljából. Erre utalhat az a tény is, hogy leptin hiányos állatmodellekben elmarad a menstruációs ciklus és infertilitás figyelhető meg. Serdülő lányoknál ehhez hasonlóan a pubertás során a leptin szintek drámaian növekednek párhuzamosan a test zsírtartalmának növekedésével (20). Általánosságban megállapítható, hogy a

7 leptin a szervezet anyagcsere folyamatainak, tápláltsági állapotának és az étvágy szabályozásában betöltött szerepe mellett alapvető integrátora a reproduktív és metabolikus folyamatoknak is. Az EGF-család, az erbb-2 szerepe a daganatkeletkezésben és kapcsolatuk a TNF-rendszerrel Az EGF-család tagjai közé az EGF, az amphiregulin, a betacellulin, a heparin-kötő EGF és a TGF-α tartoznak. A közeli rokon neuregulin családba (neu differenciálódási növekedési faktor család) pedig egyebek között a heregulinok (HRG-α és HRB-β) és a glia sejtnövekedési faktor tartoznak. Valamennyi említett ligand egy vagy több homológ aminosavakból álló EGF-szerű motívumot tartalmaz, amelyek kapcsolódnak a család megkötésére szolgáló sejtfelszíni receptorokkal. A család tagjai szekréciójuk során az előalak transzmembrán doménje fölött valamint az EGF-szerű motívumok között, illetve a képződött molekulák N-terminális területén további hasadásokon mennek keresztül és az így képződött molekulák egy vagy több EGF-receptor családtagot aktiválnak. A fenti hasadások jelentős számú extra- és intracelluláris molekuláris variáció kialakulását eredményezik az előalakból. Az EGF családtagok valamennyien képesek kötődni az EGF-receptorhoz, és aktívációt eredményezni. A neuregulin családtagok pedig 1 vagy több EGF-receptorral rokon sejtfelszíni struktúrához, így az erbb3 és 4- hez kapcsolódnak. A fenti rokonság alapján az EGFR család tagjait egyes szerzők HER (Humán EGF receptor) családként jelölik. A HER1 a humán EGF receptor-1, az erbb-2-4 pedig a HER2-4. A receptorok sejten belüli része protein tirozin-kináz aktivítással rendelkezik. A ligand kötődése a receptorokhoz dimerizációhoz vezet, és az inzulin receptor jelátviteléhez hasonlóan adaptor fehérjék (Grb, Sos) kötődése után aktíválódik a ras/raf kapcsoló proteineken keresztül a MAP-kináz jelátvivő út (végeredményben az elk-1 és a c- jun transzkripciós faktorok), ajak-stat jelátvivő út, illetve a PI3K-n keresztül a PLC és a PKC. Mind az EGF, mind az EGFR család tagjainak fokozott mértékű megjelenése figyelhető meg számos daganat esetében (hám eredetű tumorok, emlő, tüdő, hólyagrák) és ez a jelenség összefüggést mutat a tumorok rossz klinkai prognózisával. Újabban az EGFR család potenciális célpontja lett a daganatellenes terápiának (trastuzumab, herceptin: erbb-2-elleni humanizált monoklonális antitest) Az erbb-2/her2/neu 185 kd tömegű transzmembrán, szintén tirozin-kináz aktivítással rendelkező receptor. Erre a receptorra jellemző a család tagjai özül egyedül, hogy mostanáig még nem írták le ligandját. A heregulin családtagok (HRG-α és HRG-β 1-3 izoformok), amelyek alternatív hasadás miatt kismértékű különbséget mutatnak az EGF-szerű domének területén, az erbb-3 vagy 4 receptorokhoz kötődnek, amelyek homodimerként is képesek jelátvitelre, de az erbb-2-vel heterodimert képezve, ligandkötő aktivitásuk és jelátvivő képességük jelentősen nagyobb. Az EGFR család leglényegesebb tulajdonsága, hogy önmagukkal és egymással különböző kombinációban képesek összekapcsolódni. A különféle heterodimer receptorkombinációk ligandkötő és jelátvivő aktivitása egymástól eltérő. A receptorok aktiválódhatnak ligandok hatása nélkül is. Kritikus helyzetben lévő aminosavaik mutációja spontán dimerizálódáshoz vezethet. Úgyszintén dimerizációt eredményezhet az egyes erbbfehérjék túltermelődése, amely bizonyos daganatokban a génkópia szám felszaporodása miatt jöhet létre. A fenti folyamatok különféle daganatsejtek esetében elősegíthetik a folyamatos sejtproliferációt (21, 22). Az erbb-2 fokozott megjelenése daganatok esetében összefüggött a kemoterápiával szembeni rezisztenciával és a rossz prognózissal nőgyógyászati tumorok esetében, pl. emlő- és ovariumrákban (23). Megfigyelték azt is, hogy az erbb-2 aktíváció befolyásolhatja a TNF-α transzkripciójának alapvető szabályozó faktorát, az NF-kB aktivitását. Leírták azt is, hogy a TNF-rendszer ligandjai által elindított apoptotikus folymatot az erbb-2 fokozott termelődése és aktivítása jelentősen gátolhatja emlő- és petefészekrák esetén, és az erbb-2 gátlása monoklonális antitesttel a folyamatot megfordíthatja (24). Célkitűzések A terhesség előrehaladásával főként a terhesség III. trimeszterében jelentős inzulin érzékenység csökkenés figyelhető meg. Vizsgálataim alapvető célkitűzése a TNF-rendszer szerepének nyomon követése volt a terhességi inzulinrezisztencia alakulásában.

8 1. Célul tűztem ki a TNF-α és a TNFR-ok immunológiai koncentrációjának vizsgálatát egészséges terhesekben az I., a II. és a III. trimeszterben. 2. Tanulmányozni kívántam a citokin és receptorai kapcsolatát a terhesség során a testtömeg alakulását jelző antropometriai paraméterekkel (BMI-vel, domináns combkörfogattal valamint a vérnyomás változásával). 3. Célul tűztem ki a citokin és receptorai szintjének összevetését a szénhidrát anyagcsere különböző paramétereivel (éhomi vércukor, C-peptid koncentráció, C-peptid/vércukor hányados). 4. Értékelni kívántam a TNF-rendszer felsorolt tagjainak kapcsolatát a szervezet anyagcsere folyamatainak szabályozásában résztvevő adipocitokinnel, a leptinnel a terhesség során. 5. Vizsgálni kívántam továbbá az újszülöttek néhány antropometriai értékének, a testsúlynak, a testhossznak és a fejkörfogatnak az összefüggését az anyai inzulinrezisztencia indirekt paramétereivel (C-peptid-szint, C-peptid/vércukor hányados), a leptin és a TNF-rendszer említett tagjainak koncentrációjával, abból a célból, hogy megállapítsam e felsorolt citokinek illetve a terhességi inzulinrezisztencia magzati méretekre gyakorolt esetleges szabályozó hatását. A TNF-rendszer tagjai alapvető szerepet játszanak a daganatok elleni immunológiai védekező folyamatokban. Ezért célul tűztem ki a TNF-rendszer szerepének viszgálatát nőgyógyászati daganatok, elsősorban a méhnyakrák patomechanizmusában. Az erbb-2 protoonkogén sokirányú szerepet tölt be nőgyógyászati daganatok patogenezisében. Célul tűztem ki az erbb-2 fehérje expresszió vizsgálatát méhnyakrákban és összevetését a TNF-rendszer egyes családtagjai szintjének alakulásával. 6. Tanulmányozni kívántam a TNF-α és a stnfr-2 szintek alakulását méhnyakrákos betegekben. 7. Célul tűztem ki méhnyakrákos betegekből és egészséges kontroll személyek perifériás véréből izolált mononukleáris sejtek különféle stimulusokra (LPS, ConA, PHA) adott TNF-α termelőképességének összehasonlítását. 8. Vizsgálni kívántam méhnyakrákos betegekből szarmazó dfaganatszövetben az erbb-2 protein expresszióját immunhisztokémiai módszerrel. 9. Összehasonlítani kívántam a daganat erbb-2 fehérje expressziójának alakulását a betegek szérum TNF-α és stnfr-2 szintjének értékével, és a betegek perifériás vér mononukleáris sejtjeinek TNF termelő képességével. 10. Értékeltem az erbb-2 fehérje expresszió összefüggését a méhnyakrákos betegek daganatának stádiumával és a halálozási gyakorisággal.

9 Betegcsoportok A vizsgálatokban 45 egészséges, a terhesség különböző trimesztereiben lévő nő szerepelt. Éhomi vérmintáikból vércukor, C-peptid, szérum TNF α, szolubilis TNFR-1 és 2 valamint leptin meghatározásokat végeztünk, előzetes beleegyezés után. 12 beteg esetében ismételt mérések is történtek. Náluk a terhesség lefolyása során átlagosan 3 alkalommal került sor az említett meghatározásokra. A terhesség 20. hetében a WHO protokoll (OGTT: 75 g, 2 órás plazma glukóz-szint) alapján végzett vércukor terheléses vizsgálattal 2 esetben találtuk gesztációs diabetest, ezeknek a betegeknek az adatai ebben a vizsgálatsorban nem szerepelnek. A többi terhes szénhidrát anyagcseréje normális volt. Kontroll csoportként 25 korban illesztett normális glükoztoleranciával rendelkező egészséges nő (BMI <25 kg/m 2 ) adatait használtuk. Összehasonlításokat végeztünk a terhesek klinikai paraméterei (BMI, derék-csípő hányados, domináns alsó végtagi combkörfogat), vércukor értékei, a citokin szintek, éhomi C-peptid koncentrációk és a C-peptid/vércukor hányadosok között. A terhesség II. és III. trimeszterében lévő nők 23 újszülöttjének antropometriai adatait (testhossz, testsúly, fejkörfogat) elemeztük az anyai inzulinrezisztencia indirekt paramétereivel (éhomi C-peptid, C-peptid/vércukor hányados), valamint a citokin szintekkel (TNF-α, stnfr-1, stnfr-2, leptin) való összehasonlításban. Az inzulinrezisztencia paramétereket és a citokineket a II. trimeszter után a III. trimeszterben is megismételtük a terhességi hét között és összehasonlító elemzést ezekkel az értékekkel végeztünk. A tanulmány keretében, előzetes írásbeli beleegyezésüket követően, 91 diagnosztizált méhnyakrákos beteget figyeltünk meg között a Semmelweis Orvostudományi Egyetem II. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján, valamint a Szent István Kórház Nőgyógyászati Onkológiai Osztályán. Az erbb-2 fehérje kifejeződésének immunohisztokémiai vizsgálatára szövetmintát vettünk egyrészt nőgyógyászati vizsgálat során (a 3-4-es UICC stádiumban lévő betegeknél Volkmann-eszközzel), másrészt sebészi úton (Wertheim-műtét során UICC 1-2-es stádiumú betegeknél, a sebészileg eltávolított mintákból). A daganatos stádium meghatározását (UICC stádiumok: 1: 39, 2: 33, 3: 14 és 4: 5) ultrahang és CT vizsgálatokkal, valamint a sebészi beavatkozás során nyert minták szövettani feldolgozásával végeztük. A TNF-α és stnfr-2 meghatározására levett szérummintákat az újonnan diagnosztizált UICC 3-4-es stádiumú méhnyakrákos betegeknél minden esetben a műtét illetve esetleges sugárkezelés előtt nyertük. Bármilyen fertőzésre utaló klinikai vagy laboratóriumi lelet észlelésekor a beteget kizártuk a vizsgálatból. A betegek halálozási arányát 1995 és 2001 között követtük nyomon. A 64 egészséges, korban illesztett nő klinikai adatai szerepeltek kontrollcsoportként. A perifériás vér mononukleáris sejteket (PBMNC) 34 méhnyakrákos betegtől (16 erbb-2-pozitív és 18 erbb-2-negatív) valamint 30 kontroll személytől heparinizált kémcsőbe vett vénás vérből izoláltam. Összehasonlításokat végeztem az UICC stádiumok és a betegek TNF-α és stnfr-2 szintje, PBMNC TNF-α termelőképessége és az erbb-2 protein megjelenésének mértéke között. Módszerek A szérum TNF α szintek meghatározása (Sigma, St. Louis, USA Cat. Number CKH 200A, inter-assay CV: 7.0% intra-assay CV: 4.5% érzékenység: 0.5 pg/ml), valamint az stnfr-1-é (BenderMedSystem, Austria, inter-assay CV: 8.6%, intra-assay CV: 1.89%, érzékenység: 80 pg/ml), az stnfr-2-é (BenderMedSystem, Austria, inter-assay CV: 2.0%, intra-assay CV: 1.4%, érzékenység: 0.15 ng/ml) és a szérum leptiné (DRG, USA inter-assay CV: 6.6%, intra-assay CV: 4.6%, érzékenység: 0.20 ng/ml) ELISA módszerrel történtek, a gyártó cégek eljárási leírásainak megfelelően. A szérum bazális C-peptid meghatározást radioimmunoassay kittel (Biodata, Roma, Italy, inter-assay CV: 7.3%, intraassay CV: 5.6%, normál éhomi értéktartomány: ng/ml) történt. Az erbb-2 fehérje termelődését a daganatsejtekben paraffinba ágyazott minták metszeteinek immunfestésével, humán erbb-2 monoklonális egér antitestek segítségével vizsgáltam meg (BioGenex, Mainz, Németország, Prof. Dr. Otto Dworak patológiai laboratóriuma, Fürth, Németország). A metszeteket 0.21%-os citromsav oldattal (ph: 6.0) kezeltem és mikrohullámú sütőben 3x5 percig melegítettem. Az erbb-2 monoklonális egér antitesteket 1:180-as higításban alkalmaztam. Az antitesttel a metszeteket szobahőmérsékleten 30 percig inkubáltam. A reakció

10 kimutatása ezt követően szuperérzékeny immunodetektáló rendszerrel történt (Biogenex, Mainz, Németország). A festődés kiértékelését szemi-kvantitív eljárással végeztem. Nem festődött sejtek esetén 0 ponttal, a rákos sejtek kevesebb mint 20 %-ának pozitív festődése esetén 1 ponttal, a rákos sejtek %-ának pozitív festődése esetén 2 ponttal, ha több mint 50 %-a a sejteknek pozitívan festődött 3 ponttal értékeltem a fehérje termelődésének mértékét. A perifériás vér mononukleáris sejtek izolálása heparinizált kémcsőbe vett vénás vérből történt Ficoll- Hypacque sűrűség grádiensen centrifugálással. A sejtek életképességét tripánkék kizárásos teszttel vizsgáltam. A 10 % FCS-t tartalmazó, RPMI médiumban szétszélesztett 10 6 PBMNC-t stimuláltunk bakteriális lipopoliszachariddal (LPS, E.coli szerotípus 026:B6, Sigma, St.Louis, USA, 1 µg/ml végső koncentráció), concanavalin-a-val (ConA, Sigma, St. Louis, USA, 1 µg/ml végső koncentráció) és phytohemagglutinnal (PHA-P, Sigma, St Louis, USA, 1 µg/ml végső koncentráció) 24 órán keresztül, Greiner-lemezen, Forma Sci termosztátban 37 o C hőmérsékleten, 5% CO 2.-ban. A TNF-α termelődését az L929 sejteken (ATCC, USA) végzett citotoxicitási módszer segítségével határoztam meg. Standardként rekombináns humán TNF-α-t (Sigma St. Louis USA) használtunk. Anti-humán egér monoklonális neutralizáló TNF-α immunglobulin (Boehringer, Mannheim, Németország) segítségével határoztuk meg a minták TNF-α citotoxicitásának mértékét. A statisztikai elemzésekhez Mann-Whitney tesztet, lineáris korreláció analízist (Spearman) és a Yates által módosított Chi-négyzet tesztet alkalmaztam. Az eredmények elemzéséhez és grafikai megjelenítéséhez a Prism3 programot használtam. A multivariancia analízist SPSS10 statisztikai programmal végeztem. Eredmények Szérum TNF-α, stnfr-1, stnfr2 szintek, az stnfr1/r2 arány és a szérum leptin koncentrációk alakulása a terhesség I., II. és III. trimeszterében A szérum TNF-α szintek a terhesség során emelkedtek, szignifikánsan magasabb értékek mutatkoztak a III. trimeszterben lévő egészséges terhesek esetében (X±SD: 5,33±0,43 pg/ml, p<0,01) az I. trimeszterben lévőkhöz (4,05±0,26 pg/ml) illetve az egészséges nem terhes csoporthoz viszonyítva (4,07±0,26 pg/ml). A szérum TNF-α szintek mérsékelt emelkedését észleltem a II. trimeszterben lévő terhes anyáknál (4,35±0,28 pg/ml). A szérum stnfr-1 immunoreaktív szintek a TNF-α-hoz hasonló változást mutattak a terhesség lefolyása során. A szérum stnfr-1 koncentrációja emelkedettebb volt a III. trimeszterben lévő egészséges terhesekben (2,86±0,78 ng/ml, p<0,01) az egészséges kontrollokhoz (2,07±0,38 ng/ml), valamint az I. (1,97±0,38 ng/ml) illetve II. trimeszterben lévő anyákhoz viszonyítva ( 2,10±0,20 ng/ml). A szérum stnfr-2 koncentrációk a TNF-α-hoz és a TNFR-1-hez hasonló tendenciát mutattak a terhesség lefolyása során. Ennek megfelelően a fehérje szintje emelkedettebb volt a III. trimeszterben lévő egészséges terhesekben (5,75±2,10 ng/ml, p<0,01) az egészséges kontrollokhoz (3,27±0,76 ng/ml), valamint az I. (3,78±1,11 ng/ml) illetve II. trimeszterben lévő anyákhoz viszonyítva ( 3,89±0,62 ng/ml). A fenti megfigyeléssekkel egyező módon az stnfr-2/r-1 arány is megemelkedett a terhesség III. trimeszterében és szignifikánsan magasabbnak (2.13±1.18) bizonyult az egészséges kontrollokhoz képest (1.60±0.41 p<0.01). Az éhomi szérum leptin koncentrációk változása a TNF-rendszer tagjaihoz hasonlóan alakult, szignifikánsan emelkedett szérum leptin koncentrációk voltak észlelhetők a III. trimeszterbeli terheseknél (34.91±19.40 ng/ml, p<0,01) a kontroll csoporthoz (11.91±7.74 ng/ml) illetve az I. (11.46±5.55 ng/ml), és II. trimeszterben lévő várandósokhoz képest (11.83±5.41 ng/ml).

11 Az inzulin rezisztencia indirekt paramétereinek (éhomi C-peptid, Cp/Vc hányados), valamint a terhesek antropometriai és vérnyomás értékeinek alakulása a terhesség I., II. és III. trimeszterében Hasonlóan a citokin szintekhez, az éhomi C-peptid szintek emelkedettebbek voltak a III. trimeszterben (3.36±1.21 ng/ml p<0.01) az I. (1.34±0.59 ng/ml) és a II. (1.11±0.31 ng/ml) trimeszterhez illetve a nem terhesek csoportjához viszonyítva (1.05±0.37 ng/ml). Az éhomi C-peptid/vércukor hányados változása hasonló tendenciát mutatott (egészséges terhesek, I. trimeszter: 0.33±0.16, II. trimeszter: 0.28±0.10, III. trimeszter: 0.70±0.30, nem terhesek: 0.22±0.07, a III. trimeszterben észlelt értékek szignifikánsan magasabbak voltak a kontrollokhoz illetve az I. és II. trimeszterbeli adatokhoz képest p<0.01). A testtömeg-index, a domináns combkörfogat és a vérnyomás értékek szignifikánsan emelkedettek voltak a III. trimeszterben az I. és II. trimeszterbeli terheseknél illetve a kontrollcsoportnál nyert adatokhoz képest. Összefüggések a szérum TNF-α, szolubilis TNF receptor, leptin szintek és az inzulin rezisztencia indirekt paramétereinek alakulása között a terhesség folyamán Az egészséges egyének illetve a 24. gesztációs hétnél fiatalabb terhességi korú anyák TNF α szintje valamint bazális C-peptid szintje és éhomi C-peptid/vércukor hányadosa nem különbözött statisztikailag. A 24. hétnél idősebb korú terhesek TNF-szintje kismértékben magasabb volt a 24. hétnél fiatalabb csoporthoz képest, éhomi C-peptid szintjük és C-peptid/vércukor hányadosuk azonban szignifikánsan magasabbnak bizonyult mind a kontroll, mind a 24. hétnél fiatalabb csoporthoz képest. Szignifikáns pozitív lineáris korreláció (minden esetben Spearman szerinti r értékek) mutatkozott a terhesség során a TNF-α szintek alakulása valamint az éhomi C-peptid koncentráció (r=0.70, p<0.0001) és a C-peptid/vércukor hányados (r=0.63, p<0.0001) értékei között. Az éhomi C-peptid szintek és a C-peptid/vércukor hányadosok között szintén szignifikáns pozitív lineáris korreláció figyelhető meg ebben a csoportban (r=0.89, p<0.0001). A terhesség III. trimeszterében ugyanezen összefüggések mutatkoztak. Hasonlóképpen szignifikáns pozitív lineáris korrelációt találtam a szérum stnfr-2 szintek és az éhomi C-peptid koncentrációk (r=0.49, p<0.0005) valamint az stnfr-2 és a C-peptid/vércukor hányados között (r=0.51, p=0.0007). A stnfr-1 értékek egyik csoportban sem mutattak összefüggést az inzulinrezisztencia indirekt paramétereivel. A terhesek csoportjában szignifikáns pozitív lineáris korrelációt figyeltem meg a szérum leptin szintek és az inzulinrezisztencia indirekt paramétereinek (C-peptid: r=0.74, p<0.0001, C-peptid/vércukor hányados: r=0.63, p<0.0001) alakulása között. A fenti összefüggést nem észleltem az egészséges kontroll nők csoportjában. Összefüggés a testtömeg-index és a TNF-rendszer tagjai valamint a leptin szérum koncentrációi között a terhesség során Szignifikáns pozitív lineáris korreláció volt megfigyelhető a szérum TNF-α koncentrációk és a BMI értékek között a terhesek csoportjában (r=0.52, p=0.03). Szignifikáns korreláció mutatkozott továbbá az stnfr-2 szintek és a testtömeg-indexek között a terhesek csoportjában (r=0.31, p=0.05). Nem volt kimutatható statisztikai összefüggés az stnfr-1 koncentrációk és a testtömeg-indexek alakulása között egyik csoportban sem. Szignifikáns pozitív lineáris korrelációt találtam a szérum leptin és a TNF-α (r=0.65, p<0.0001) koncentrációk között a terhesek csoportjában Nem mutatkozott összefüggés egyik csoportban sem a TNFR-ok és a leptin szintek összehasonlításakor. Szignifikáns pozitív lineáris korreláció volt észlelhető a szérum leptin szintek és a testtömeg-index értékek alakulása között a terhesek csoportjában (r=0.73, p<0.0001). A fenti összefüggés megfigyelhető volt az egészséges kontroll nők csoportjában is (r=0.75, p<0.0001).

12 Multiplex lineáris regressziós analízis az inzulinrezisztencia indirekt paraméterei, a TNF-α, a stnfr-k, a leptin és a BMI bevonásával BMI-re történt korrekció után a leptin, az stnfr-2, az éhomi C-peptid szint valamint a C- peptid/vércukor hányados értéke szignifikánsan emelkedett maradt a terhesség III. trimeszterében. Lépésenkénti multiplex lineáris regressziós elemzéssel a C-peptidet tekintve függő változónak a szérum leptin koncentráció bizonyult meghatározónak (korrigált r 2 =0.46, p=0.0005) a citokinek (TNFα, stnfr-2) közül. Összefüggés az újszülöttek antropometriai paraméterei valamint az anyai citokin szintek (leptin, TNF-α, stnfr1 és stnfr2) és az anyai BMI értékek között A terhesség II. és III. trimeszterében lévő 23 egészséges nő újszülöttjének bizonyos antropometriai paramétereit hasonlítottam össze az anyai citokin szintekkel és az inzulinrezisztencia indirekt paramétereivel. A II. trimeszterben lévő nőket követéses vizsgálat során a szülés előtti héten is ellenőriztem, és a statisztikai számításokat az ezen időszakban végzett vérvételekből nyert értékekkel végeztem. Statisztikailag szignifikáns összefüggést a magzati fejkörfogatok valamint az anyai leptin szintek és BMI értékek között mutattam ki. Az újszülöttek fejkörfogata szignifikáns negatív lineáris korrelációt (Spearman) mutatott az anyai leptin (r=-0.58, p=0.0031) koncentrációkkal és a BMI adatokkal (r=- 0.47, p=0.0233). A szérum TNF-α, stnfr2 szintek és a stnfr-2/tnf-α arány alakulása méhnyakrákban szenvedő betegekben Méhnyakrákban szenvedő betegek szérum TNF-α koncentrációja (valamennyi érték átlag+sd, pg/ml, p<0.0001) szignifikánsan (Mann-Whitney teszt) alacsonyabban bizonyult egészséges kontroll nőkhöz viszonyítva ( pg/ml). A méhnyakrákos betegekben a TNF-α szintek a magasabb UICC stádiumban szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint a kevésbé előrehaladott esetekben (UICC 1: , UICC 2: , UICC 3: , UICC 4: ). A szérum TNF-α koncentrációkhoz hasonlóan az stnfr-2 szintek is szignifikánsan alacsonyabbaknak bizonyultak méhnyakrákos betegekben ( ng/ml, p<0.0001) a korban illesztett, egészséges kontrollcsoporthoz képest ( ng/ml). A szérum TNF-α és stnfr-2 értékek között mind a daganatos betegek (r=0.39, p<0.0001), mind a kontrollcsoportban (r=0.28, p=0.0211) szignifikáns pozitív lineáris korreláció (Spearman) volt kimutatható. Magasabb UICC stádiumokban az stnfr-2 koncentrációk is alacsonyabbnak bizonyultak a kevésbé előrehaladott esetekhez képest (UICC 1: ng/ml, UICC 2: ng/ml, UICC 3: ng/ml, UICC 4: ng/ml). A méhnyakrákos betegek csoportjában ( , p<0.0001) az stnfr-2/tnf-α arány szignifikásan magasabbnak bizonyult a kontrollcsoporthoz ( ) képest. Az egyes UICC stádiumokba sorolt betegek között az arány nem különbözött értékelhető mértékben. Méhnyakrákos betegekből származó perifériás vér mononukleáris sejtek mitogének által stimulált in vitro TNF-α termelésének vizsgálata A méhnyakrákos betegekből izolált perifériás vér mononukleáris sejtek mitogén által stimulált TNF-α termelése szignifikánsan alacsonyabb volt a kontrollokhoz képest. LPS esetében a méhnyakrákos csoportban pg/1m sejt/24h, a kontrollcsoportban pg/1m sejt/24h, ConA esetében pg/1m sejt/24h illetve pg/1m sejt/24h és PHA mitogénnel pg/1m sejt/24h illetve pg/1m sejt/24h p< TNF-α termelés volt mérhető.

13 ErbB-2 fehérje kifejeződésének vizsgálata méhnyakrákban szenvedő betegekben Az erbb-2 fehérje 16 betegből származó daganatmintából volt kimutatható. Két beteg esetében (mindkettő UICC 4 stádium) az erbb-2 fehérjét nemcsak a malignus sejtekben, hanem a szövettani vizsgálattal épnek mutatkozó sejtekben is észleltük. Az erbb-2 fehérje festődése szignifikánsan erőteljesebb volt (2+ illetve 3+ erősségű) és nagyobb számú sejtben volt kimutatható (chi-négyzet teszt Yates korrekcióval szignifikáns p<0.0001) az UICC 3-4 stádiumú betegek csoportjában (19 esetből 14-ben), az UICC 1-2 stádiumú betegekhez képest (72 esetből 2-ben, 1+ erősségben). ErbB-2 fehérje-pozitív méhnyakrákos betegek szérum TNF-α, stnfr-2 koncentrációjának és mitogének által stimulált in vitro TNF-α termelésének alakulása Az erbb-2 fehérje pozitivitást mutató méhnyakrákos betegek szérum TNF-α koncentrációja ( pg/ml, p< ) szignifikánsan alacsonyabb volt az erbb-2 negatív betegekéhez képest ( pg/ml). Hasonlóképpen az stnfr-2 szintek is alacsonyabbak voltak az erbb-2 pozitív betegekben ( ng/ml, p< ) mint az erbb-2 negatív betegcsoportban ( ng/ml). Az erbb-2 fehérje kifejeződését mutató betegek perifériás vér mononukleáris sejtjeinek mitogén indukálta in vitro TNF-α termelő képessége szignifikánsan alacsonyabb volt valamennyi vizsgált stimulusra, mint az erbb-2 negatív betegeké. LPS esetében pg/1m sejt/24h szemben pg/1m sejt/24h, ConA alkalmazásakor pg/1m sejt/24h szemben pg/1m sejt/24h, PHA stimulusra pg/1m sejt/24h szemben pg/1m sejt/24h (minden esetben p<0.0001) TNF-α termelés volt mérhető. Az erbb-2 fehérje kifejeződés prognosztikus jelentőségének értékelése követéses vizsgálat során Hét éves követéses vizsgálat során a 91 méhnyakrákban szenvedő betegből 30-an haltak meg. A 30 elhunyt betegből 14 esetében figyeltünk meg erbb-2 fehérje pozitivitást szemben a túlélő betegekkel, ahol 61 esetből 2 mutatkozott erbb-2 pozitívnak (chi-négyzet teszt Yates korrekcióval szignifikáns: p<0.0001). Az erbb-2 expresszió relatív rizikó értéke ebből a szempontból 5.36, az esély hányadosé számértéke pedig Megbeszélés (Az új eredmények összefoglalása és klinikai értéke) 1. Szignifikánsan magasabb éhomi TNF-α, stnfr-1, stnfr-2, leptin, C-peptid szinteket valamint C-peptid/vércukor értékeket figyeltem meg élettani terhesség során a III. trimeszterben lévő nőkben egészséges kontroll egyénekhez, a terhesség I és II. trimeszterében lévő várandósokhoz képest. 2. Szignifikáns pozitív korreláció mutatható ki az élettani terhesség során az inzulinrezisztencia fokozódását mutató indirekt paraméterek valamint az anyai TNF-α, stnfr-2 és leptin koncentrációk között. 3. Szignifikáns negatív korrelációt figyeltem meg élettani terhességben az anyai leptin szintek és testtömeg-index valamint az újszülött fejkörfogatának alakulása között. 4. Következtetésként felvetettem a terhességi inzulinrezisztencia létrejöttének mechanizmusában az anyai zsírszövetben termelődő citokinek - a TNF-α, a stnfr-2 és a leptin szerepét. 5. Az anyai anyagcsere állapotot szabályozó citokinek közül elsősorban az anyai leptin szint metabolikus imprintor szerepe valószínűsíthető élettani terhességben. 6. Megfigyeltem az erbb-2 onkoprotein fokozott termelődését, elsősorban előrehaladott méhnyakrákos betegekben. Összefüggés mutatkozott klinikai szempontból a daganat rossz prognózisával. 7. Méhnyakrákos betegekben szignifikánsan alacsonyabb TNF-α és stnfr-2 szérum koncentrációt figyeltem meg egészséges kontroll egyénekhez képest. Az stnfr-2/tnf-α értékek pedig statisztikailag emelkedettnek bizonyultak a daganatos betegcsoportban az egészséges kontroll egyénekhez képest.

14 8. Méhnyakrákos betegekből izolált perifériás vér mononukleáris sejtek különféle mitogénekkel (LPS, ConA, PHA) történő stimuláció után szignifikánsan kevesebb TNF-α-t termeltek azonos idő alatt, mint az egészséges kontroll egyének. A különbség még kifejezettebb volt előrehaladott stádiumokban. 9. ErbB-2 fehérje termelődését mutató daganatos betegek szérum TNF-α és stnfr-2 szintje szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az erbb-2 negatív méhnyakrákos betegeké. 10. ErbB-2 termelődést mutató méhnyakrákos betegekből izolált perifériás vér mononukleáris sejtek különféle mitogén stimulusra mutatott TNF-α termelő képessége szignifikánsan csökkentnek bizonyult az erbb-2 negatív betegekhez viszonyítva. 11. Felvetettem az erbb fehérje család és a TNF-rendszer működése közötti összefüggés lehetőségét a méhnyakrák patogenezisében. Köszönetnyilvánítás Köszönöm Dr. Paulin Ferenc egyetemi tanárnak, az orvostudományok doktorának, a Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kara II. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika igazgatójának, hogy kutatómunkám segítette, tanácsaival támogatta és jelenleg is támogatja. Hálásan köszönöm témavezetőmnek Dr. Cseh Károly osztályvezető főorvos úrnak, az MTA doktorának mindenre kiterjedő segítségét, akinek a témaválasztásban, a vizsgálatok kivitelezésében, az eredmények feldolgozásában elévülhetetlen szerepe volt. Megtisztelt barátságával, mely nyugodt életstílusával együtt rendkívül sokat jelentett számomra, és átsegített a nehéz időkön is. Köszönöm Dr. Gergely Péter egyetemi tanárnak, az orvostudományok doktorának, hogy a doktori iskola programvezetőjeként lehetővé tette, hogy munkám az általa irányított doktori tudományág keretein belül elkészülhetett. Köszönöm Dr. Falus András egyetemi tanárnak, az MTA levelező tagjának, hogy témavezetőként az általa irányított tudományos program keretében munkám elkészítését messzemenőkig támogatta. Köszönöm Dr. Romics László egyetemi tanárnak, az MTA rendes tagjának és Dr. Füst György egyetemi tanárnak, hogy munkám kivitelezését a Semmelweis Egyetem ÁOK III. sz. Belgyógyászati Klinika Tudományos Laboratóriumában lehetővé tették. Köszönöm Dr. Otto Dworak egyetemi tanárnak, a fürthi egyetemi kórház patológiai osztályának osztályvezető főorvosának segítségét, hogy az erbb-2 onkoprotein expressziójával kapcsolatos vizsgálataimat laboratóriumában elkészíthettem. Nagyon köszönöm klinikai munkatársaimnak Dr. Csömör Sándor egyetemi docensnek, Dr. Bánhidy Ferenc egyetemi adjunktusnak, Dr. Tóth Péter egyetemi adjunktusnak, hogy közös munkánkban társszerzőkként közreműködtek, tanácsaikkal segítettek, valamint Dr. Gimes Gábor egyetemi adjunktusnak, hogy a doktori pályázat megírását kritikai megjegyzéseivel támogatta. Köszönöm Dr. Siklós Pál főorvos úrnak, hogy közös munkáinkban társszerzőként nélkülözhetetlen segítséget nyújtott. Köszönöm Kovács Margit segítségét a munka laboratóriumi és technikai kivitelezésében. Köszönöm Dr. Bősze Péter egyetemi tanárnak publikációm elkészítéséhez nyújtott értékes segítségét. Tisztelettel köszönöm Dr. Winkler Gábor osztályvezető főorvos, egyetemi magántanár és Dr. Baranyi Éva egyetemi docens közös munkánkban nyújtott értékes segítségét. Köszönöm klinikánk dolgozójának, Herczeg Zsuzsánnának nélkülözhetetlen technikai segítségét munkám kivitelezésében. Köszönöm Torzsa Zoltánnak, a Semmelweis Egyetem, Képzéskutató, Oktatástechnológiai és