A TUMOR NEKRÓZIS FAKTOR RENDSZER SZEREPE A TERHESSÉG SORÁN KIALAKULÓ INZULINREZISZTENCIA ÉS A MÉHNYAKRÁK PATOMECHANIZMUSÁBAN

Átírás

1 A TUMOR NEKRÓZIS FAKTOR RENDSZER SZEREPE A TERHESSÉG SORÁN KIALAKULÓ INZULINREZISZTENCIA ÉS A MÉHNYAKRÁK PATOMECHANIZMUSÁBAN Dr. Melczer Zsolt Semmelweis Egyetem Általános Orvostudományi Kar II. sz. Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Témavezető: Dr. Cseh Károly Dr. Falus András Budapest Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris orvostudományok Tudományági Doktori Iskola /7/ Szigorlati bizottság: Dr. Fekete Béla egyetemi tanár Dr. Pajor Attila egyetemi tanár Dr. László Ádám oszt. vez. főorvos Hivatalos bírálók: Dr. Csermely Péter egyetemi tanár Dr. Pálfalvi László főorvos Biráló bizottság tagjai: Dr. Doszpod József egyetemi tanár Dr. Rosivall László egyetemi tanár Dr. Csapó Zsolt egyetemi docens Dr. Lintner Ferenc oszt. vez. főorvos Dr. Nékám Kristóf oszt. vez. főorvos 1

2 2 Szüleim emlékének

3 TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK BEVEZETÉS A TNF rendszer felfedezésének története A TNF család (receptorok és ligandok) Az ADAM enzimcsalád A TNF-rendszer részvétele a szervezet működésében Az apoptózis szabályozása Apoptózis indukció a Fas receptoron (TNFRSF6) keresztül Apoptózis szabályozás a TNFR-1-en (TNFRSF1A) keresztül Apoptózist gátló sejtfelszíni mechanizmusok A Kaszpáz rendszer A kaszpáz rendszer aktivációját szabályozó mechanizmusok és a kaszpáz gátlók Az apoptózis mitokondriális szabályozása Az egyes TNF családtagok szerepe a szervezet működésében Limfotoxin (α:tnfsf1 és β:tnfsf3) CD27 (TNFRSF7), CD27 ligand (CD70) (TNFRSF7) CD30 (TNFSF8), CD30 ligand (CD153) (TNFRSF8) CD40 (TNFRSF5), CD40 ligand (CD154)(TNFSF5) BB (CD137)(TNFSF9), 4-1BB ligand (TNFRSF9) OX40/CD134 (TNFRSF4) és OX40 ligand/cd134l (TNFSF4) LIGHT (TNFSF14) és receptorai, a HVEM (TNFRSF14), a LT-β R (TNFRSF3) és a DcR3 (TNFRSF6B) BCMA receptor (TNFRSF17) és ligandja, a BAFF/TANK/TALL-1 (TNFSF13B), TACI receptor (TNFRSF13B) és ligandja, a TALL-2/April (TNFSF13) DR3/TRAMP (TNFRSF12) és Fn14 receptorok és ligandjuk a TWEAK/APO3L (TNFSF12) TRAIL/APO2L (TNFSF10), DR4 (TRAILR1, TNFRSF10A), DR5 (TRAILR2, TNFRSF10B), DcR1 (TRAILR3, TNFRSF10C), DcR2 (TRAILR4, TNFRSF10D) RANK (TNFRSF11A), RANKL (TNFSF11), osteoprotegerin (TNFRSF11B) EDAR/EDA GITR (TNFRSF18) és ligandja (GITRL) (TNFSF18) p75 NGFR (TNFRSF16) és ligandja (NGF) A TNF-α (TNFSF2) A TNF-α szerkezete A TNF-α termelődés szabályozása, a TOLL-like receptor (TLR) család A TNF-α és az inzulinrezisztencia kapcsolata A TNF-rendszer és a leptin szerepe egyes szülészeti kórképek patomechanizmusában Az EGF-család, az erbb-2 szerepe a daganatkeletkezésben és kapcsolatuk a TNFrendszerrel CÉLKITŰZÉSEK BETEGCSOPORTOK MÓDSZEREK EREDMÉNYEK A terhesek és újszülöttjeik vizsgálatainak értékelése Szérum TNF-α szintek alakulása a terhesség I., II. és III. trimeszterében Szérum stnfr-1 koncentrációk a terhesség I., II. és III. trimeszterében Szérum stnfr-2 koncentrációk a terhesség I., II. és III. trimeszterében Szérum leptin koncentrációk változása a terhesség I., II. és III. trimeszterében

4 Az inzulin rezisztencia indirekt paramétereinek (éhomi C-peptid, Cp/Vc hányados) alakulása a terhesség I., II. és III. trimeszterében Antropometriai paraméterek és a vérnyomás változása a terhesség során Összefüggések a szérum TNF-α szintek és az inzulin rezisztencia indirekt paramétereinek alakulása között a terhesség folyamán Összefüggések a stnfr szintek és az inzulinrezisztencia indirekt paramétereinek változása között a terhesség folyamán Összefüggés a testtömeg-index és a TNF-rendszer tagjainak szérum koncentrációi között a terhesség során Összefüggés a szérum leptin és a TNF-rendszer tagjainak koncentrációi között a terhesség során Összefüggés a szérum leptin szintek és az inzulinrezisztencia indirekt paraméterei között terhességben Összefüggés a szérum leptin szintek és a testtömeg-index alakulása között terhesség folyamán Multiplex lineáris regressziós analízis az inzulinrezisztencia indirekt paraméterei, a TNF-α, a stnfr-k, a leptin és a BMI bevonásával Összefüggés az újszülöttek antropometriai paraméterei valamint az anyai citokin szintek (leptin, TNF-α, stnfr1 és stnfr2) és az anyai BMI értékek között A szérum TNF-α szintek alakulása méhnyakrákban szenvedő betegekben A szérum stnfr-2 szintek alakulása méhnyakrákos betegekben A szérum stnfr-2/tnf-α arány alakulása méhnyakrákos betegekben Méhnyakrákos betegekből származó perifériás vér mononukleáris sejtek mitogének által stimulált in vitro TNF-α termelésének vizsgálata ErbB-2 fehérje kifejeződésének vizsgálata méhnyakrákban szenvedő betegekben ErbB-2 fehérje-pozitív méhnyakrákos betegek szérum TNF-α és stnfr-2 koncentrációjának alakulása Az erbb-2 fehérje kifejeződés prognosztikus jelentőségének értékelése követéses vizsgálat során MEGBESZÉLÉS A TNF-rendszer szerepe a terhesség során megfigyelhető inzulin-érzékenység csökkenés patomechanizmusában Az anyai inzulinrezisztencia összefüggése a magzat antropometriai paramétereivel Az erbb-2 fehérje termelődésének kapcsolata a TNF-rendszerrel és szerepük a méhnyakrák kóreredetében KÖVETKEZTETÉSEK (AZ ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA ÉS KLINIKAI ÉRTÉKE) KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS IRODALOMJEGYZÉK SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE

5 Rövidítésjegyzék AA- aminosav (amino acid) ACE- angiotenzin képző enzim (angiotensin converting enzyme) ADAM- az integrin kapcsolatot gátló és metalloproteáz doménekkel rendelkező enzimcsalád (a disintegrin and metalloprotease) ADD- zsírsejt elköteleződést és differenciálódást irányító fehérje (adipocyte determination and differentiation) ADP- adenin difoszfát (adenin diphosphate) AIF- mitokondriális elhelyezkedésű apoptózist indukáló faktor (apoptosis inducing factor) AITR- aktiváció indukálta TNF receptorhoz hasonló fehérje apaf-1- mitokondrium membránhoz kötött apoptózist aktiváló factor (apoptosis activating factor) AP-1 aktivátor protein-1 APO- apoptózis ARC- apoptózis gátló fehérje CARD-val (apoptosis repressor with CARD) Asp- aszparaginsav ATCC- Amerikai Sejtkultúrák Gyűjteménye (American Type Culture Collection) BAFF- B-sejt aktiváló faktor (B-cell activating factor belonging to TNF family) BCMA- B-sejt érési antigén (B-cell maturation antigen) BH- Bcl-2 homológ domén BMI- testtömeg index (body mass index) BRCA- tumor szuppresszor fehérje (breast cancer) C- karboxil (carboxil) CAD/DFF- kaszpáz aktiválta DNS bontó enzim (caspase-activated DNA-se/DNA fragmentation factor) CARD- kaszpáz toborzó domén (caspase recruiting domain) Caspase (kaszpáz)- cisztein aszpartáz CD- a sejtfelszíni rendszer monoklonális antitestekkel történő jellemzésére használt nomenklatúra (cluster of differentiation) CKD- cyclin függő kináz (cyclin dependent kinase) ciap- apoptózist gátló fehérje (cellular inhibitor of apoptosis) ConA- concanavalin-a 5

6 CV- variációs együttható (coefficient of variance) DcR- csali receptor (decoy receptor) DD- halál domén (death domain) DED- halál végrehajtó domén (death effector domain) DM- diabetes mellitus DNS- dezoxiribonukleinsav (desoxiribonucleic acid) DR- halál receptor (death receptor) EBP- enhancer kötő fehérje (enhancer binding protein) EDA- ectodyspasin-a EDAR- ectidysplasin-a receptor EGF- epidermális növekedési (growth) faktor FADD- Fas-szal kapcsolódó halál doménnal rendelkező protein (Fas-associated DD protein) FCS- borjú szérum (fetal calf serum) FFA- szabad zsírsav (free fatty acid) FLIP- FLICE: ICE homológ fehérje (FLICE inhibitor protein) GITR- glukokortikoid indukálta fehérje (glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor family- related protein) GLUT-4- glukóz transzporter-4 GPI- glikozil-foszfatidil-inozitol horgony GRB- növekedési faktor receptor kötő fehérje (growth factor receptor binding protein) HRG- heregulin Hsp- hősokk fehérje (heat-shock protein) HVEM- herpesz vírus belépését segítő struktúra (herpes virus entry mediator) ICAM-1- intercelluláris adhéziós molekula ICE- interleukin-1β konvertáló enzim (IL-1 converting enzyme) IFN- interferon IL- interleukin IRAK- IL-1 receptorhoz kötődő kináz (IL-1-R associated kinase) IRS-1 inzulinreceptor-szubsztrát-1 JNK- cjun-n-terminális kináz KB- kilobázis kd- kilodalton 6

7 KUZ- egy drosophila idegrendszeri fejlődést irányító fehérje (kuzbanian) L- receptorokhoz kötődő molekula (ligand, sejtfelszínről levált formák) LIGHT- HVEM/TNFR kapcsolódó struktúra (ligand of HVEM/TR2) LPS- lipopoliszacharid (bakteriális) LRR- leucin-gazdag ismétlődést tartalmazó fehérjecsalád (leucin-reach repeat superfamily, TOLL, TOLL-related receptorok) LT- lymphotoxin MAP- mitogén aktivált fehérje (mitogen activated protein kinase) enzimcsalád MAPKKK- MAP kináz-kináz-kináz MDM2- sejtcikulszabályozásban, onkogenezisben szerepet játszó gén és fehérje (murine double minute-2) MHC- fő hisztokompatibilitási osztály (major histocompatibility class) mrns- hírvivő ribonukleinsav (messenger ribonucleic acid) MyD88- myeloid differenciálódást segítő protein N- nitrogén NAIP- idegsejtben jelenlévő apoptózist gátló fehérje (neuronal apoptosis inhibitor protein) NF-κB- nukleáris faktor-κb NGF- idegsejt növekedési faktor (nerve growth factor) NIK- NF-kB gátló fehérjét gátló kináz (NF-kB inhibitor kinase) INOS- inducibilis nitric oxid synthase OGTT- orális glükóz tolerancia teszt PHA- phytohemagglutinin PI(P 2,3 )3K- foszfatidil-inozitol-(bi-, trifoszfát)-3 kináz PKC- protein kináz-c PLC- foszfolipáz-c PLE- placentáris enhancer PPAR- peroxiszóma proliferációt aktiváló receptor (peroxisome proliferation activating receptor) PRR- mintázat felismerő receptorok (pattern recognition receptors) R- receptor (sejtfelszínhez kötött formák) RAC1- kis molekulatömegű, receptorhoz asszociált G-protein RAIDD- receptorokkal kapcsolódó halál doménnel rendelkező protein (receptor interacting protein-associated ICH homolog protein with DD) 7

8 RANK- NF-κB-t aktiváló fehérje (receptor activating NF-κB) RB- retinoblasztóma RGD- arginin(r)-glicin(g)-aszparaginsav(d) fehérje szekvencia RICK- CARD doménnel rendelkező protein-kináz adaptor molekula (receptor interacting CARD domain kinase) RIP- receptorral kapcsolódó protein (receptor interacting protein) sf- felszíni (surface) SLE- szisztémás lupus erythematodes SODD- halál domént gátló fehérje (silencer of death domain) SOS- ErbB jelátvivő út adaptor fehérje (son of sevenless) SREBP- szterol szabályozó elemet kötő fehérje (sterol regulatory element binding protein) TACE- TNF-α hasító enzim (TNF-α converting enzyme) TACI- transzmembrán receptor (transmembrane activator and CAML [calcium modulator and cyclophyllin ligand] interactor) TALL-1/2- TNF-szerű ligand (TNF and apoptosis ligand-related leukocyte expressed ligand-1/2) TGF- transzformáló növekedési faktor (transforming growth factor) TIMP- szöveti metalloproteáz gátló fehérje (tissue inhibitor of metalloprotease) TLR- TOLL-related receptor TNF- Tumor nekrózis faktor TOLL- különböző specieszek szöveti fejlődését irányító receptor TOLLIP- TOLL receptorral kapcsolódó fehérje (TOLL interacting protein) TRADD- TNFR-rel kapcsolódó halál doménnel rendelkező protein (TNFRassociated DD protein) TRAF- TNFR-hez kapcsolódó faktor (TNFR-associated factor) TRAIL- TNF-hez hasonló apoptózist indukáló ligand (TNF-related apoptosis inducing ligand) TRAMP- TNF receptorhoz hasonló fehérje (TNF receptor-related apoptosis mediating protein) TS- trombospondin (ADAMTS) motívum TWEAK- TNF-hez hasonló apoptózist gyengén indukáló fehérje (TNF-like weak inducer of apoptosis) TRK-tirozin kináz 8

9 VEGF- éreredetű endotheliális növekedési faktor (vascular endothelial growth factor) VLDL- igen alacsony sűrűségű lipoprotein (very low density lipoprotein) WHR- derék-csipő hányados (waist to hip ratio) 9

10 1. BEVEZETÉS A TNF rendszer felfedezésének története A TNF rendszer tagjairól és működésükről még nem jelent meg részletesebb hazai összefoglalás. Ez indokolja a rendszerrel kapcsolatos ismeretek kiterjedtebb áttekintését a bevezető fejezetekben. A TNF rendszerrel kapcsolatos kezdeti megfigyelések a 18. század végére nyúlnak vissza. William B. Coley New York-i sebész figyelte meg, hogy bizonyos fertőzések lezajlását követően egyes daganatos betegségben szenvedő egyénekben a tumor remissziója figyelhető meg ban publikálta szarkómák kezelésében felhasznált hővel elölt streptococcusokat tartalmazó szuszpenzióval kapcsolatos tapasztalatait (1). A szerző a Coley-toxinnal 40 éves pályafutása során több mint 200 beteget kezelt. Betegeinek egyharmada - elsősorban azok, akik kötőszöveti eredetű tumorokban limfo- vagy oszteoszarkómában szenvedtek - került hosszú évekre remisszióba. A mai ismereteink alapján a bakteriális kivonat a szervezet mononukleáris sejtjeiből TNF felszabadulást indukált. A felismerés 100 éven keresztül feledésbe merült. Aggarwal és munkatársai ben közölték a bakteriális lipopoliszacharid hatására termelődő, a tumorok pusztulását okozó citokint, amelyet tumor nekrózis faktornak neveztek (2). Egyidejűleg Beutler és munkatársai igazolták, hogy bizonyos krónikus fertőző betegségben szenvedő állatokban a kachexiához vezető makrofág eredetű citokin, amelyet cachectinnek neveztek, azonos a TNF-α-val (3). Ez a munkacsoport figyelte meg elsőként a TNF-α metabolikus hatásai közül a zsíranyagcsere befolyását. Leírták, hogy az állatok szérumában a kachexia során trigliceridszintelsősorban VLDL emelkedés- figyelhető meg. A patomechanizmust vizsgálva megállapították a citokin zsírszöveti lipoprotein lipáz enzimet szabályozó hatását. A szerzők megfigyelték azt is, hogy a TNF-α gátolja a zsírsejtek differenciálódását, csökkenti az érett zsírsejtek mrns tartalmát, a zsírsejtekben lévő lipoprotein lipáz enzim bioszintézisét, a trigliceridszintézisben résztvevő enzimek, zsírsavkötő fehérjék termelődését. 10

11 Az említett munkacsoport eredményei tisztázták továbbá, hogy a bakteriális fertőzéseket kísérő endotoxin kiváltotta sokk és a következményes szövetkárosodás egyik kulcsfontosságú közvetítője szintén a TNF-α (4). Az elmúlt két évtized során közlemények ezrei foglalkoztak a TNF-rendszernek a szervezet szinte valamennyi sejttípusára, szövetére, szervére gyakorolt hatásaival. A TNF-rendszerrel foglalkozó kutatások jelentősen bővítették az immunrendszer kommunikációs mechanizmusaival, elsősorban a citokinekkel és receptoraikkal, a sejtfelszíni struktúrák felszínről történő leválásával, valamint a programozott sejthalállal kapcsolatos tudásunkat A TNF család (receptorok és ligandok) A szűkebb TNF- (TNF ligand) család képviselői közül jelenleg 4 tag, a TNF-α, a LT-α (korábbi nevén TNF-β), a LT-β és az ún. LIGHT ismert. A család legnevezetesebb tagjának, a TNF-α-nak a molekulatömege 17,5 kd, 157 aminosavból épül fel. A szintézis létrejötte után egy 76 aminosavból álló szignálpeptid rész segíti elő a szekrécióját. Génje a 6-os kromoszóma rövid karján, az MHC rendszer két osztályának (az ún. class 1 és 2) génjei között, a 3-as osztály területén helyezkedik el. A fenti ligandok a TNF-R család jelenleg ismert 4 tagjával léphetnek kapcsolatba. A TNF-α az 55 kd-os R-1-gyel (CD 120a) és a 75 kd-os R-2-vel (CD 120b), az LT-α a TNFR-1-gyel és 2-vel, az LT-β az LT-βR-al, a LIGHT a HVEM-al és az LT-βR-al. A TNF-ligand família minden tagja trimer alakot képez. Ez az aktív forma. Az LT-β kivételével homotrimerek, ez utóbbi egy vagy két β-variánst és kettő vagy egy α-variánst tartalmaz. A TNF-család mono-, di-, tetra-, penta- és multimer alakjait is kimutatták, ezek azonban mind inaktív formák. A TNF-α-nak membránhoz kötött és szolubilis formája egyaránt ismert, a LT-α csak szolubilis, a LIGHT és a LT-β két variánsa ( a β1α2, illetve a β2α1) csak membránkötött változatban fordul elő. A TNFR-1-t és 2-t szolubilis és membránkötött alakban egyaránt kimutatták, a HVEM és a LT-βR esetében a szolubilis változat előfordulását nem igazolták. A fenti lehetőségek nagyfokú változatosságot tesznek lehetővé a TNF-rendszer biológiai hatásait illetően. A termelődés helyén, illetve a szomszédos sejtek felszínén megjelenő TNF-, illetve 11

12 TNFR-változatok auto-, juxta- és parakrin effektusokat, míg a szolubilis formák endokrin hatásokat hozhatnak létre (2, 5, 6). Tágabb értelemben bizonyos fehérjeszerkezeti rokonság alapján a TNF-családhoz számos ligand (CD27L/CD70, CD30L, CD40L/CD154, CD95L/FasL, CD134L/OX40L, CD137L, TALL-1/BAFF, TALL-2/APRIL, APO2L/TRAIL, APO3L/TWEAK, RANKL, EDA, GITRL, NGF, VEGI) és receptoraik (CD27, CD30, CD40, CD95/Fas, CD134/OX40, CD 137, TACI, BCMA, DR3/TRAMP, Fn14, DR4/TRAIL-R1, DR5/TRAIL-R2, DR6, DcR1, DcR2, RANK, osteoprotegerin, EDAR, GITR és p75ngfr) tartozik. A receptorok közös jellemzője, hogy több (általában 2-3-4) cisztein aminosavban gazdag domént tartalmaznak. A TNF család tagjainak jelölésére, a kétségtelenül zavaros fenti betűszimbólumok helyett, újabban számozást alkalmaznak a tumor nekrózis faktor családot jelképező betűk után (TNFSF a ligandok és TNFRSF a receptorok jelölésére)[1. táblázat(a)]. 12

13 1. táblázat(a) TNF-receptorok és ligandok nevezéktana Receptor Ligand TNFR-1, CD120a TNFRSF1A TNF-β, LT-α TNFSF1 TNFR-2, CD120b TNFRSF1B TNF-α TNFSF2 LT-βR TNFRSF3 LT-β TNFSF3 OX40, CD134 TNFRSF4 OX40L TNFSF4 CD40 TNFRSF5 CD40L, CD154 TNFSF5 Fas, CD95, APO-I TNFRSF6 FasL TNFSF6 DcR3 TNFRSF6B CD27 TNFRSF7 CD27L TNFSF7 CD30 TNFRSF8 CD30L, CD153 TNFSF8 4-IBB, CD137 TNFRSF9 4-IBBL TNFSF9 DR4, TRAIL-R1 TNFRSF10A TRAIL TNFSF10 DR5, TRAIL-R2 TNFRSF10B DcR1, TRAIL-R3 TNFRSF10C DcR2, TRAIL-R4 TNFRSF10D RANK TNFRSF11A RANKL TNFSF11 Osteoprotegerin TNFRSF11B DR3, TRAMP, TNFRSF12 TWEAK, APO-3L TNFSF12 APO3 TACI TNFRSF13 APRIL, TALL-2 TNFSF13 HVEM, ATAR, TNFRSF14 LIGHT TNFSF14 TR2 VEGI, TL-1 TNFRSF15? TNFSF15 p75ngfr TNFRSF16 NGF TNFSF16 BCMA TNFRSF17 BAFF, TALL-1 TNFSF17 GITR, AITR TNFRSF18 GITRL, AITRL TNFSF18 TROY TNFRSF19 13

14 1. táblázat(b) A TNF rendszer tagjainak fontosabb biológiai hatásai Receptor Funkció Ligand Funkció TNFR-1 jelátvitel/apoptózis TNF-β proliferáció/ apoptózis TNFR-2 jelátvitel/proliferáció TNF-α Sokféle LT-βR jelátvitel LT-β immunrendszer proliferáció OX40 jelátvitel OX40L immunrendszer járulékos szignál CD40 jelátvitel CD40L Immunrendszer járulékos szignál Fas jelátvitel/apoptózis FasL Apoptózis DcR3 csali receptor CD27 jelátvitel CD27L imunrendszer járulékos szignál CD30 jelátvitel CD30L immunrendszer járulékos szignál 4-IBB jelátvitel 4-IBBL immunrendszer járulékos szignál DR4 jelátvitel/apoptózis TRAIL Apoptózis DR5 jelátvitel/apoptózis DcR1 csali receptor DcR2 csali receptor RANK jelátvitel RANKL oszteoklaszt differeciálódás Osteoprotegerin csali receptor DR3 jelátvitel TWEAK apoptózis TACI jelátvitel APRIL B-sejt proliferáció járulékos szignál HVEM jelátvitel LIGHT T-sejt proliferáció járulékos szignál, apoptózis VEGI jelátvitel TNFSF15? p75ngfr jelátvitel NGF idegsejt-proliferáció BCMA jelátvitel BAFF B-sejt proliferáció járulékos szignál GITR jelátvitel GITRL T-sejt proliferáció TROY Jelátvitel 14

15 A ligandok egy része és receptoraik (TNF-α/TNFR-1, LTα3/TNFR-1, FasL/Fas, APO3L[TWEAK]/DR3, TRAIL/DR4, TRAIL/DR5) szerepelnek a programozott sejthalál elindításában (7)(1. ábra). 1. ábra (Forrás: ALEXIS) 15

16 1. 3. Az ADAM enzimcsalád A TNF rendszerrel kapcsolatos vizsgálatok is hozzájárultak e fontos, és a jövőben sokféle kórállapotban igen széleskörű terápiás lehetőséget kínáló, alapvető fontosságú enzimcsalád megismeréséhez. Mind a TNF-ligandoknak, mind a TNFR-oknak a sejtmembránról való leválását egy újabban jellemzett transzmembrán ADAM családba tartozó, metalloproteáz enzim, a TACE vagy ADAM17 végzi. Az ADAM enzimrendszer multifunkcionális gének családja, jelenleg 59 tagja ismert. Az enzimrendszer a cinkkel katalizált metalloproteázok tagja és 2 alcsaládja a membránkötött (de szolubilis változatban is észlelt) reprolysin-szerű fehérjék közé tartozó ADAM, valamint a szekretált trombospondinhoz hasonló szerkezeti motívumot is tartalmazó ADAMTS. A membránban elhelyezkedő ADAM családtagok aminosavat tartalmaznak, amelyek több doménbe rendeződnek. Az extracelluláris részen egy 200 aminosavból álló ún. prodomén, ezt követően a metalloproteáz szerkezeti egység, majd a disintegrin rész, egy cisztein aminosavakban gazdag terület, valamint az EGF homológ régió található, ezt követi a transzmembrán domén, majd a sejten belül elhelyezkedő régió, a citoszól domén. A csak szekretált változatban előforduló ADAMTS tagokban trombospondin-szerű motívumok helyezkednek el a disintegrin domén utáni területeken. A prodomén több ADAM prekurzorról leválik, amely az enzim aktiválódását eredményezi. Ezen a területen található a cisztein-kapcsoló (switch) motívum, amely a metalloproteázok inaktív állapotát tartja fenn. A metalloproteáz domén a cink megkötésére szolgáló konszenzus szekvenciát tartalmazza (HexxHxxGxxHD), amelyben a három hisztidin és egy vízmolekula tetrahedrálisan koordinálja a cinkatom helyzetét, a glutamin maradék pedig katalitikus bázisként szerepel. A disintegrin domén az ADAM családtagokban aminosavat tartalmaz és e területen 6-15 cisztein-maradék van jelen. Itt található az RGD aminosav szekvenciát tartalmazó integrinek megkötésére szolgáló hely is, amely egyebek mellett kapcsolódik a trombociták GPIIb/IIIa (α IIb β 3 ) receptorával, gátolva a trombocita aggregációt, valamint kapcsolódik a sejtek közötti kontaktusban fontos α v β 3 (vitronektin-receptor) integrinhez, befolyásolva ezzel különféle sejtek működését. Több ADAM családtag nem 16

17 tartalmaz RGD szekvenciát, de disintegrin doménjével képes integrineket megkötni. Így pl. a terhesség élettanában (a petesejt és a spermiumok kapcsolódásában alapvető mechanizmus) fontos ADAM2 a disintegrin doménen keresztül kötődik az α 6 β 1 integrinhez, amely azután a CD9 molekulával kapcsolódva segíti elő a spermiumok áthaladását a petevezetéken és a petesejttel való egyesülését. A disintegrin domén területén lévő másik konzervatív szekvencia (ECD), ezen belül is leginkább az aszparaginsav (D), felelős az ivarsejtek közötti kapcsolódásért a megtermékenyítés során. Ez, valamint az ADAM3-ban is jelenlévő hasonló peptidszekvencia képes meggátolni az ivarsejtek adhézióját és fúzióját. A cisztein aminosavban gazdag és az EGF-szerű területek a fehérjekapcsolódást és a családtagok szállítását segíthetik elő. A TACE-ban jelenlévő cisztein-gazdag domén a prodoménleválást és az enzim által végzett citokin (pl. IL-1-R) receptorok felszínről való leválasztását végzi. Az I. típusú (N-terminális rész extracelluláris) membránfehérje ADAM családtagok transzmembrán doménje a sejten belül elhelyezkedő C-terminális részhez közel helyezkedik el. Számos membránkötött ADAM családtagnak létezik alternatív hasadás útján létrejövő transzmembrán domén nélküli szolubilis, szekretált változata is (ADAM11, 12, 17, 28). Valamennyi ADAMTS családtagból hiányzik a transzmembrán domén, ezek mind szekretált változatok. A citoszól domén kb aminosavat tartalmaz. Egyes családtagok (ADAM9, 15) ezen a területen kapcsolatba lépnek SH3 domént tartalmazó sejten belüli fehérjékkel, és jeleket közvetíthetnek a sejtfelszínről. A trombospondin motívumot tartalmazó ADAMTS tagok sejten kívüli mátrix fehérjékkel, heparinnal létesíthetnek kapcsolatot és sejtadhéziót, motilitást és növekedést szabályozhatnak AZ ADAM családtagok számos élettani folyamatban vesznek részt. Az ADAM17 hasítja a membránban lehorgonyzott TNF prekurzor molekulát és eredményezi a szolubilis TNF-α változatot. Emellett képes hasítani egyéb sejtmembránban lehorgonyzott ektodomént is (TGF-β, FasL, citokin receptorok szolubilis változatai: IL-6R, TNFR-1,-2, CD16, CD30, CD44, adhéziós molekulák szolubilis változatai: L-selectin, enzimek szolubilis változatai: ACE). Több ADAM családtag irányítja a sejtek fúzióját és adhézióját (fertilin/adam1, 2; cyritestin1, 2/ADAM3a, 3b: petesejt-ondósejt kapcsolat, emberi vonatkozásban pedig az 17

18 ADAM3-7 vesz részt a spermatogenezis irányításában), a sejtdifferenciálódást (ADAM10/KUZ, a notch jelátviteli út elindításával az idegsejtek fejlődésében szerepel), a neutrofil fehérvérsejtek vándorlását (ADAM8), az izomfejlődést, a mioblaszt-fúziót (ADAM12), az oszetoblaszt differenciálódást (ADAM19). Az ADAM11 gátolja az emlő és petefészekrák kialakulását. A szekretált ADAMTS családtagok (ADAMTS1) az akut gyulladásos folyamatok szabályozásában szerepelnek, valamint részt vesznek a megtermékenyítés, az embrionális fejlődés irányításában is. Egyes ADAMTS tagok (ADAMTS58) gátolják az angiogenezist (8, 9). Az emberi TNF-α a sejt belseje felé elhelyezkedő N-terminális végtől számított 76. helyzetű alanin és a 77. helyzetű valin között hasad el, mely aminosavak a membrán külső felszínéhez képest már extracellulárisan helyezkednek el. Az ADAM család tagjai, így a TACE is különféle metalloproteáz inhibitorokkal (TIMP3, hydroxamic acid) gátolhatók. Ez új terápiás lehetőséget nyújthat különböző kórképek gyógykezelésében is (reumatoid artritisz, Crohn-betegség, cerebrális malária, szeptikus sokk, endometriózis) A TNF-rendszer részvétele a szervezet működésében Általánosságban a TNF-rendszer több irányban befolyásolja a szervezet működését [1. táblázat(b)]. A fontosabb hatástani területek szerint beszélhetünk a TNF szerepéről az onkogenezisben (így egyes daganatok keletkezésében, másrészről viszont a tumorokkal szembeni védekezésben; bizonyos tumorsejtek esetében citotoxikus hatású, más daganatsejtek vonatkozásában azok növekedését segíti elő), a vaszkuláris endothelium működésének szabályozásában (az endotoxin okozta sokkot kísérő vaszkuláris permeabilitás fokozódásának mediátora; fokozza az endothelsejtek prokoaguláns aktivitását, növeli azok citokintermelését, sejtfelszíni adhéziós molekulái pl. ICAM-1 stb. expresszióját). Részt vesz továbbá a hemopoézisben (pl. fokozza a neutrofil granulociták aktivációját - adherenciáját, kemotaxisát, degranulációját, szuperoxid gyök termelését -, hasonlóképpen az eozinofil és mononukleáris fagocita sejtek aktivációját is), befolyásolja az akut fázis reakciót (a láz egyik fontos mediátora, szabályozza a májban akut fázis fehérjék termelődését). A citokin szerepet játszik az immunrendszer szabályozásában is, elősegítve a Th1 sejtek proliferációját és 18

19 differenciálódását. Jelentős hatást gyakorol a kötőszövet működésére is (pl. fokozza a fibroblasztok, szinoviális sejtek enzimtermelését, adhéziós molekulák termelődését, és serkenti az oszteoklaszt aktivitást) (3, 4, 5, 6) Az apoptózis szabályozása A TNF rendszerrel kapcsolatos ismeretek alapvetően járultak hozzá e folyamat szabályozásának megértéséhez is. Az apoptózis elindulásának alapvetően két útja ismert. Az I. típusú út a felszíni ún. halálreceptorokon (a TNF család egyes tagjai, TNFR-1, Fas, DR3-6) keresztül történő kaszpáz rendszer aktiválódáson keresztül valósul meg. A II. típusú apoptózis út a mitokondrium szabályozó rendszerén keresztül jön létre. Az I. típusú út elindításában a TNF-α és a TNF család korábban említett tagjai töltenek be fontos élettani ligand funkciót. Az értekezés témáját tekintve az apoptózis egyaránt nagyfontosságú az elhízáshoz társuló inzulinrezisztencia, a terhesség során a magzati fejlődés szabályozása, illetve a méhnyakrák patogenezise szempontjából. A folyamat sejtfelszíni receptorok és ligandok kapcsolódása révén indul el. A folyamatot elindító ligandok egyaránt lehetnek a keringésben lévő oldott, illetve a sejtfelszínhez kötött állapotban. A receptorok és a ligandok kapcsolódása a ligandok trimer alakulata miatt a receptorok sejtfelszínen történő aggregációjához vezet, amely elősegíti a receptorok sejten belül lévő, meghatározott aminosav (80 AA) összetételt tartalmazó ún. halál (death) doménjeinek kapcsolódását a különböző, a jelátvitelt elősegítő, szintén ugyanezzel a halál doménnel rendelkező adaptor (illeszkedő) fehérjékkel. A TNF receptor család tagjai közül az említett halál doménnel a TNFR-1, a Fas/CD95, a DR3, DR4, DR5, a CAR1 (csirke fehérje) és a 75kD tömegű NGF receptor rendelkezik. Általánosságban a receptorok aktiválódása a ligand kötődése után úgy jön létre, hogy a receptorok halál doménjéhez közvetlenül kapcsolódnak a jeltovábbító, illeszkedő molekulák, a FADD, TRADD, RIP, RAIDD. A kapcsolódást a halál domének közötti homeotipikus interakció hozza létre. 19

20 Apoptózis indukció a Fas receptoron (TNFRSF6) keresztül A Fas ligand (TNFSF6) a Fas/CD95 (TNFRSF6) receptorhoz kötődik, amely azután a FADD-dal kapcsolódik. Az adaptor fehérjében a halál domén mellett még egy death effector domain (DED) is jelen van. A FADD így DED-je segítségével szintén homeotipikus kapcsolódással megköti és aktiválja a DED-del szintén rendelkező, apoptózis jeltovábbító enzimrendszer, a kaszpáz család egyik tagját a kaszpáz-8-t (2. ábra) Apoptózis szabályozás a TNFR-1-en (TNFRSF1A) keresztül A TNFR-1 jelátvitele során több adaptor proteinnel való kapcsolódás lehetséges. Az egyik a TRADD-val való interakció a proteinek halál doménjén keresztül, majd a TRADD-nak és a FADD-nak az asszociációja szintén a halál doménekkel. Ezután a FADD DED-n keresztül aktiválja a kaszpáz-8-t. A TNFR-1-en keresztül azonban bekövetkezhet egy másik, már nem az apoptózis irányába ható kapcsolat is a TRADD és a TRAF1 vagy 2 között. Ezen interakció kifejezetten antiapoptotikus mechanizmusokat aktivál (2. ábra). A TRAF fehérjék (1-6) is jellegzetes adaptor molekulái a TNF receptor családtagokon bekövetkező jelátviteli folyamatoknak. Ezen a kapcsoló fehérjék C- terminális végén jellegzetes közös szerkezeti egység, a TRAF domain található, amellyel a receptorokhoz kötődnek, az N-terminális végükön pedig cink-ujj és gyűrűs-ujj motívumok találhatók, amelyek transzkripciót szabályozó aktivitással rendelkeznek. A TRAF fehérjék az NFκB és a MAP kináz út aktiválódását indíthatják el, és gátolhatják a kaszpáz aktivációt (pl. a TRAF2 a kaszpáz 8-at) (71). A TNFR másik apoptózishoz vezető aktivációs útja a TNFR-1 és a RIP közötti interakció halál doménjeiken keresztül. A RIP ezután kapcsolódik a RAIDD-hoz halál doménjével, majd a RAIDD CARD-ja segítségével kötődik a kaszpáz-2 enzimben jelenlévő CARD-hoz ezúton aktiválva az apoptózist végrehajtó kaszpáz rendszert (2. ábra). Lényegében a többi apoptózist indukáló TNFR családtag is az említett adaptor molekulákon keresztül kapcsolja be a kaszpáz rendszert. 20

21 2. ábra (Forrás: ALEXIS) 21

22 Apoptózis indukció enzimatikus úton Citotoxikus T és NK sejtek szekretoros granuláik termékeivel a perforinnal és a granzyme-val apoptózist indukálnak kaszpáz aktiváció útján. A perforin a célsejtek membránjában a komplement rendszer 9-es komponenséhez hasonlóan egy nyílást üt, amelyen keresztül a szerin-észteráz típusú enzim a granzyme a kaszpáz-2, -3 és -9 aktiválása útján elindítja az apoptózist. A katepszin-d aszparaginsav-proteáz, valamint a szerin apoptotikus proteáz 24 szintén képes az előbb említett kaszpázok aktiválására. Az emlőssejtekben található leginkább hidrofób molekula, a ceramid szintén indukálhat pro-, illetve antiapoptotikus jelátviteli utakat. Az apoptózis szabályozás szempontjából topográfiailag igen lényeges tulajdonsága, hogy különféle membránokban keletkezik, és ott helyben is marad. Ez biztosítja a pro-, illetve antiapoptotikus jelátviteli utak szükséges helyzeti elkülönülését. A ceramid három úton keletkezhet a sejtekben. Létrejöhet egyrészt anabolikus úton, szerin és palmitoil-coa ketoszfinganinná történő szintézisével, amely utóbbi vegyület redukció, aciláció, majd ismételt redukció után alakul ceramiddá. Másrészt létrejöhet katabolikus úton, amely során vagy semleges vagy savas szfingomielináz enzimek (a foszfolipáz-c szfingomielin-specifikus formái) hozzák létre a szfingomielin hidrolízisével a ceramidot (és foszforil-kolint). A semleges szfingomielináz (a sejtmembránban lokalizált) aktivitása során nem indukálódik apoptózis, hanem a ceramid által aktivált protein-kináz elindítja a MAP-kináz utat, és a cjun-kináz és a p38 aktiválódása révén antiapoptotikus hatású. A savas szfingomielináz a lizoszomális membránban van jelen, és aktiválódása révén a keletkező ceramid apoptózis indukciót eredményezhet. Ez részben a kaszpáz-1 aktiválásával, részben a mitokondriális membrán permeábilitásának fokozása révén a mitokondriumból kiszabaduló citokróm-c/aif hatására bekövetkező kaszpáz-9 aktiváció révén történhet. A ceramid a karnitin palmitoiltranszferáz-1 aktiválódását eredményezi, amely a Bcl-2-höz kötődik. A kapcsolódás a mitokondriális változásokat elindítja. A TNF ligandok a TNFR-1-en át mind a neutrális, mind a savas szfingomielináz aktiválódását elindíthatják különböző adaptor fehérjékkel való kapcsolódás révén. 22

23 Apoptózist gátló sejtfelszíni mechanizmusok Az apoptózis szabályozás több szinten valósul meg, ezek közül a felszíni csali (decoy)-receptorok képviselik a sejtfelszíni szintet oly módon, hogy megkötve a ligandokat jelátvitel nem történik. A DcR1 és a DcR2 a TRAIL csali receptora, az első nem rendelkezik sejten belüli halál doménnel, a másodikon pedig inaktív a halál domén. A sejtfelszíni receptorok levedlett változatai szintén a felszíni apoptózis szabályozás egyik formáját jelentik megkötve a szolubilis, illetve membránhoz kötött ligandokat antagonizálva ezzel a sejtfelszíni receptorokhoz való ligand kötődést. Ilyen változatok a szolubilis Fas, a szolubilis TNFR-1, illetve a szolubilis RANK/osteoprotegerin. Ez utóbbi szolubilis receptor változat egyedülállóan halál doméneket tartalmaz, amelyek kórélettani jelentősége nem ismert (5, 9) A Kaszpáz rendszer A Kaszpáz rendszer az apoptózist végrehajtó enzimatikus kaszkád rendszer. Cisztein-aszpartázok, a nevük is ebből ered. Az enzimek tetrapeptid motívumokat ismernek fel (YVAD, DEVD). C-terminális végükön Asp-t tartalmazó zymogének, önaktivációjuk során 20 és 10 kd-os alegységekre hasadnak. Az alegységek heterodiméreket alkotnak, majd a dimérek dimérjei jönnek létre, az enzimek teljes aktiválódását eredményezve. Jelenleg 14 kaszpáz enzim ismert. Az apoptózist a sejtfelszín, illetve a mitokondriumok felől elindító iniciátor kaszpázok a kaszpáz-8,-10 (Fas és TNFR-1 aktiválja), a kaszpáz-2 (TNFR-1 és a granzyme aktiválja) és a kaszpáz-9 (mitokondriális aktiváció) (2. ábra). A fent említett kaszpázok azután a kaszkádban későbbi lépcsőn álló effektor kaszpázokat aktiválják. Ezek a kaszpáz-3, -6 és -7. Ezen enzimek az apoptotikus folyamat során a sejt élettani működésében fontos membrán, citoplazmatikus, illetve magfehérjéket, enzimeket hasítanak, létre hozva az apoptózis morfológiai jelenségeit (sejtzsugorodás, membránhólyagok, mitokondriális károsodás, nukleáris állomány feltöredezése). Az említett szubsztrátok között szerepelnek DNS javító enzimek, a poly-adp ribóz polimeráz, a lamin, a fodrin, a gelsolin, adducin, topoizomerázok, MDM2, RB, ras, MAP-kinázok, protein-kináz Cδ, 23

24 CAD/DFF. Végeredményben az apoptózisra jellemző, elektroforetikus vizsgálatban létraszerű, kisléptékű (200 bázispár) DNS fragmentálódást a CAD/DFF hozza létre oly módon, hogy a végrehajtó kaszpázok elhasítják az aktív enzimrészt (CAD/DFF 40) gátló komponenst (ICAD/DFF 45), ami az enzimet aktiválja. A Kaszpáz család több tagja részt vesz különféle citokinek termelődése során a fehérjék érett állapotának kialakításában (pl. IL-1). Ezek közé tartoznak a kaszpáz-1 (IL-1β konvertáló enzim), -5,-11,-12,-13 és -14. A kaszpáz enzimek közül CARD-el rendelkezik a kaszpáz-1,-2,-4,-9, DED-el pedig a kaszpáz-8 és 10 (5) A kaszpáz rendszer aktivációját szabályozó mechanizmusok és a kaszpáz gátlók A kaszpáz rendszernek ismeretesek természetes, sejten belül jelenlévő, gátló fehérjéi. Ismertek továbbá vírusokban jelenlévő, a kórokozó túlélését elősegítő, kaszpáz rendszert gátló fehérjék. Az utóbbi időben mesterségesen is előállítottak kaszpáz gátló peptideket. A TNFR-1 spontán, ligand kötődés nélküli multimerizáció következtében létrejövő aktivációjából eredő nem kívánatos apoptózis megakadályozásában a SODD fehérje játszik szerepet, amely a TNFR-1 közelében helyezkedik el membránközeli állapotban, és gátolja a TNFR-1 és a TRADD kapcsolódását. A fehérje gátolja a DR3 aktivációt is. A CARD-val rendelkező ARC fehérje a kaszpáz-2 és -8 enzimeket gátolja (Fas, TNFR-1, DR3 apoptózis utakban szerepel). A kaszpáz-3 és 7 általános sejten belüli gátló fehérjéi a ciap1 és 2. Az idegsejtekben ehhez hasonló a NAIP. A kaszpáz-3,-6 és -9 enzimeknek ismeretes az említettekhez hasonló, X kromoszómához kötött (Xq25 pozíció) gátló fehérjéje is (XIAP). Leírtak különféle daganatsejtekben kifejeződő apoptózis gátló fehérjét, a survivint, amely az embrionális fejlődés során jelen van a sejtekben, de nem mutatható ki terminálisan differenciálódott sejtekben. A tehénhimlő vírusban talált 38 kd-os szerin-proteáz inhibitor (CrmA fehérje) a kaszpáz-1 és -8 erőteljes gátlását okozza. 24

25 A Baculovírus 35 kd-os fehérjéje (p35) az egyik legszélesebb spektrumú kaszpáz gátló, az 1,-3,-4,-6 és 7 enzimeket gátolja. A NAIP ezzel homológ fehérje. A FLIP virális fehérje és sejten belül természetesen előforduló rövid, homológ változata a FLIPs DED-el rendelkező fehérjék. Ezen doménen keresztül gátolják a kaszpáz-8 és-10 TNFR-1 és Fas által keltett aktiválódását. A sejten belül előforduló FLIP fehérjének ismeretes hosszú változata is, amely a halál doméneken kívül kaszpázszerű domént is tartalmaz, és amelyen keresztül a kaszpáz-8-t és -10-t aktiválni képes. Megismerve a kaszpázok tetrapeptideket felismerő tulajdonságait szintetikus DEVD, YVAD, VEID aminosavakat tartalmazó fluorometilketonokat állítottak elő, amelyekkel több kaszpázt, így az 1, 3 és 6-t sikerült gátolni. Eddig az egyes kaszpázokat specifikusan gátló vegyületek még nem ismeretesek (5) Az apoptózis mitokondriális szabályozása Az apoptózis szabályozás következő igen fontos területe a mitokondriumokban elhelyezkedő programozott sejthalált elindító, illetve ezt gátló rendszer. Az apoptotikus folyamat során az első jelentős lépés a mitokondriális permeábilitás változása. A permeábilitás szabályozása részben a pro- és antiapoptotikus mitokondriális fehérjék komplex működése révén valósul meg. A programozott sejthalált gátló fehérje család a Bcl-2 homológ proteinek famíliája. Mitokondriális membránban lokalizált tagjaik a Bcl-2 (B-sejtes krónikus limfoid leukémiában észlelték először), a Bcl-X L, a Bcl-w. Ezek a fehérjék négy térszerkezeti egységet tartalmaznak (BH1-4). Az antiapoptotikus funkció szempontjából a BH4 domén a lényeges. A mitokondriális membránban az antiapoptotikus hatású Bcl-2 családtagokkal komplexben helyezkednek el a proapoptotikus családtagok is. Ilyenek a Bax (BH2-4 domének), a Bcl-X S (BH1-3 domének) és a Bid, Bad, Bik és Bim (csak 1 BH3 domén tartalmaznak). Az apoptózis szabályozás a pro- és antiapoptotikus családtagok közötti együttműködés során alapvetően valószínűleg három, egymást nem kizáró mechanizmussal valósul meg. Szerepe lehet a sztöchiometriás komplexálódásnak, a pórusformálódásnak, illetve a prionokhoz hasonló működésnek. A Bcl-2 és a Bax fehérjéknek az aránya a mitokondriális membránokban a sejtek élettartamát alapvetően befolyásolja. Bcl-2 túlsúly esetén a Bcl-2/Bax 25

26 heterodimérek helyett Bcl-2 homodimérek keletkeznek, és így a sejtek élettartama megnő (ez történik B-sejtes krónikus limfoid leukémiák egy részében), az apoptózis gátlódik. Bax túlsúly esetén Bax homodimérek keletkeznek, és apoptózis indul el. A Bax fehérje mennyiségének növelésével indukál apoptózist pl. a p53 tumor szupresszor gén. A mitokondrium külső és belső membránja között Bcl-2 pro- és antiapoptotikus családtagokkal komplexben lévő, apoptózist indukáló faktorok helyezkednek el. Ezek kikerülése a membránok közti térből a mitokondriumok külső membránjában formálódó pórusokon keresztül a citoplazmatikus térbe apoptózist indít el. A Bcl-2 és a Bax, illetve homológjaik heterodimérjeinek megfelelő aránya a mitokondriális membránban az említett pórusok kinyílását gátolja. A mitokondriális külső és belső membránok közötti területen elhelyezkedő apoptózis indukáló molekulák között a legfontosabb a citokróm-c és az AIF. Az utóbbi molekula, egy mitokondriális, oxidoreduktáz aktivitású flavoprotein, a sejtmagba transzlokálódik, és ott kromatin kondenzációt okoz, majd a nagyléptékű kb DNS fragmentációt okozza (a kisléptékűt a már említett CAD/DFF eredményezi). A citokróm-c kijutva a membránközti térből kapcsolódik a külső membránban a Bcl-2-höz rögzített apaf-1-vel, amelynek kötése ezt követően megszűnik, a mitokondrium membránból leválik, és CARD régiójának interakciója révén a kaszpáz-9 enzimet aktiválja. A proapoptotikus Bim, Bid és Bad családtagok kapcsolódása a Bcl-2-höz szintén apaf-1 leváláshoz és kaszpáz-9 aktiválódáshoz vezetnek. Ezen családtagok közül a Bid és a Bad citoplazmatikus lokalizációjú, a Bim pedig intracelluláris membránokhoz kötött. A Bid a Fas és a TNFR-1 hatására bekövetkező kaszpáz-8 aktiválódása révén hasad, és az így szabaddá váló BH3 doménje pedig a Bcl-2- höz kötődik a fent részletezett következményekkel. A Bad foszforiláció útján inaktiválódik, foszforilált változata a jelű fehérjével komplexet alkot, így nem tud a Bcl-2 homológokhoz kötődni. Defoszforilált változata kapcsolódik az antiapoptotikus családtagokhoz. A proapoptotikus családtagok, pl. a Bid vagy a Bad, a prionok működéséhez hasonlóan vezethetnek az apoptózis elindulásához. A Bcl-2/Bax hálózati sztöchiometriát már néhány Bid vagy Bad molekula kapcsolódása megváltoztathatja, ami a membránban rögzült, bonyolult makromolekuláris 26

27 komplexet felbonthatja, a citokróm-c kiszabadul, az apaf-1 leválik, és az apoptotikus folyamat elindul. Az apoptotikus folyamatot tovább erősíti, hogy a mitokondriális membrán makromolekuláris komplexének egyik tagja a Smac/Diablo is leválik, és a citoplazmába kerülve gátolja a ciap1 és -2 kaszpáz inaktiváló fehérjéket. Ez utóbbi gátló fehérjék akadályozzák meg több kaszpáz (pl. 3, 6, 7, 9) spontán aktiválódását. A fenti fejezetek megírása után jelent meg magyar nyelven az apoptózist részletesen tárgyaló monográfia (71) Az egyes TNF családtagok szerepe a szervezet működésében Limfotoxin (α:tnfsf1 és β:tnfsf3) Az LT-α (TNFSF1) és β (TNFSF3) az immunrendszer fejlődésének és működésének fontos szabályozó faktorai. A LT-α homotrimerként szekretálódó fehérje, mind a TNFR-1-hez (TNFRSF1A), mind a TNFR-2-höz (TNFRSF1B) kötődik. A LT-α membránkötött, heterotrimer fehérjét is képezhet a LT-β-val, ez esetben a heterotrimer komplex LT-α1β2 összetevőkből áll, és egy az előzőektől különböző receptorhoz, a LT-β receptorhoz (TNFRSF3) kötődik. A LT-β-nak 2 izoform változata vált ismertté. A rövidebb variáns extracelluláris darabja hiányzik, így minden bizonnyal gátlódik a LT-α-val való komplex képzése. A LTα3 a TNFR-1-en keresztül apoptózist indukálhat (10). A LT-β receptor NF-κB aktivációt eredményez, de bizonyos sejttípusokban ez a receptor is indukálhat apoptózist. A LT-β receptor pozitív CD4+/CD3- sejtek a nyirokcsomókban antigén prezentáló NK és follikuláris sejtekké differenciálódhatnak. Az LT-α1β2 változat elősegíti továbbá a lép follikulusokban lévő stroma sejtek homing kemokin receptorainak (pl. CXC receptor-5), valamint a B és T-sejtzónáknak a kialakulását. A LT gének kiütése a másodlagos limfoid szövetek fejlődésének zavarát eredményezte. A limfoid rendszer fejlődésében mind a homo-, mind a heterotrimer LT-változat fontos szerepet tölt be. A LT-α gén kiütése esetén hiányoztak az egerek nyaki és mezenteriális nyirokcsomói, valamint a nazális 27

28 területtel és a béllel asszociált limfoid rendszer fejlődése. A LT-β gén kiütése a Peyer-plaque-k, a perifériás nyirokcsomók és a lép germinatív centrumainak, valamint a follikuláris dendritikus sejteknek a hiányához vezetett. A LT-α gén hiányával szemben ezen egerekben a nyaki és mezenteriális nyirokcsomók jelen voltak. A két gén jelenléte egyaránt szükséges a nyirokrendszer fejlődéséhez, de úgy tűnik, hogy mindkettő más-más szerepet tölt be. Úgy látszik, hogy a LT-β receptor jelátviteli mechanizmusa különösen fontos a perifériás limfoid rendszer organogenezisében és affinitás érésében (11). A szekretált LT-α szerepet játszik különböző infekciók, pl. vírusfertőzések, sejten belüli bakteriális fertőzések, így a Mycobacterium tuberkulózis leküzdésében is (12). A lokálisan az agyban fokozott mértékben termelődő LT-α felelős elsősorban a cerebrális malária agyi tüneteinek létrejöttéért (13). A LT gén bizonyos polimorfizmusai összefüggést mutatnak a LT-α szintek alakulásával, felvetődött kapcsolatuk anyagcsere (elhízás, inzulinrezisztencia), autoimmun (pl. gyulladásos bélbetegség) és daganatos (pl. limfóma, myeloma multiplex) betegségekkel, illetve az arterioszklerózissal (14,15,16) CD27 (TNFRSF7), CD27 ligand (CD70) (TNFRSF7) A receptor és ligandja limfocita specifikus TNF családtagok, fontos járulékos szignált jelentenek a limfociták növekedésének és élettartamának szabályozásában. A nyugvó limfociták felszínén nincsenek jelen, expressziójuk különböző aktivációs stimulusok, antigén prezentáló sejtek, IL-1α, IL-12, TNF-α, CD28-n át történő jelátvitel hatására következik be. A CD27-CD70 kapcsolat elsősorban a T-sejt proliferációt segíti elő, és TNF-α termelődést is indukál. T-sejt eredetű citokinek - pl. IL-4 - gátolják a CD70 aktivált T-sejtek felszínén történő megjelenését. A T-sejt-T-sejt interakcióban a CD27-CD70 kapcsolat szabályozó szerepe elsősorban az immunválasz kezdeti szakaszában érvényesül. Ebben a fázisban az antigén prezentáló sejtek hatására megindul a T-sejtek elköteleződése az adott antigénnel szemben és a CD70 ligand megjelenése a keringő T-sejtek felszínén az antigénnel szembeni elköteleződést tükrözi. A CD27 jelátvitel alapvető hatásait a TRAF-2,-3,-5 adaptor molekulákkal való interakció után a JNK és NF-κB aktiváció közvetíti. Ez a folyamat antiapoptotikus hatású, a T- 28

29 sejtek túlélését segíti elő (17). A szervezet egyik alapvető védekező mechanizmusába, a veleszületett NK-sejt válasz megértésébe engedett betekintést az a megfigyelés, hogy az NK-sejtek felszínén a CD27 folyamatosan kifejeződik. Ez a magyarázata, hogy veleszületett NK-sejt válasz figyelhető meg a CD70 molekulát felszínükön hordozó daganatsejtek ellen. A receptor és ligandja igen fontos szerepet tölt be a veleszületett és az adaptív immunválasz kapcsolatában (18). A CD27-CD70 interakció szabályozó szerepet játszik továbbá a T-sejt függő B-sejtes immunválaszban is (az OX-40-OX 40 ligand és a CD40-CD40 ligand kapcsolódásokkal együtt). Ebben a folyamatban a germinatív centrumokban található B-sejtek plazmasejtekké történő átalakulását és immunglobulin termelését, továbbá a memória B-sejtek létrejöttét segíti elő. Ezen utóbbi sejtek egyik specifikus markere a CD27 felszíni antigén (19). A CD27 antiapoptotikus jellegű hatásai mellett bizonyos körülmények között programozott sejthalált is képes indukálni az újonnan felfedezett Siva proapoptotikus molekulákkal kapcsolódva (20). Emelkedett szolubilis CD27 szinteket figyeltek meg több kórállapotban, így pl. szisztémás lupus erythematodesben a vérkeringésben, meningeális lokalizációjú limfoid malignitásokban a cerebrospinális folyadékban (21) CD30 (TNFSF8), CD30 ligand (CD153) (TNFRSF8) A receptor és ligandja járulékos jeleket közvetít a T-limfociták fejlődésében, működésében, a Th1/Th2 irányú differenciálódásban, T-B-sejtek interakciójában. A CD30 Th-sejt alcsoportokon, B-limfocitákon, tímusz sejteken fordul elő, de megjelenik bizonyos malignus daganatsejtek és vírusok által transzformált sejtek felszínén is. A CD30-t Hodgkin kórban, a Sternberg-Reed sejtek felszínén is megtalálták. A CD30 Th2 differenciálódási markerként is értékelhető (22). A CD153 jelenlétét aktivált perifériás T-sejt szubpopuláció és makrofágok felszínén írták le, de megfigyelték nyugvó, normál és malignus B-sejteken is. A liganddal való interakció szintén a TRAF-2,-3,-5-n vezet a fentiekhez hasonlóan jeltovábbításhoz, a limfociták aktiválódását és túlélését elősegítve (23). A CD30 receptor azonban vezethet apoptózis indukcióhoz is. Így pl. a T-sejt receptoron keresztül érkező jeltovábbítás megszűnése után a CD30 molekulán át történő jelátvitel a T-sejtekben apoptózist indukál. A receptor és ligandja kapcsolatának 29

30 megítélése szempontjából érdekes megfigyelés, hogy a B-sejteken kifejeződő CD153 (CD30 ligand) és a T-sejtek felszínén megjelenő CD30 kapcsolódása meggátolja a B-sejtek IgD-IgM gén átkapcsolódását és az antitest termelés elindulását (24). A CD30 extracelluláris része leválhat a sejtek felszínéről, kötődhet ligandjához, a sejtfelszíni CD153-hoz, és gátolhatja annak kapcsolódását a membránkötött CD30-hoz kompetitív módon. A szolubilis CD30 szintek több kórállapotban (pl. Hodgkin-kór) mutatnak emelkedést. A CD153-nak szintén létezik szolubilis változata, amely kapcsolódhat a membránkötött CD30-hoz és apoptózist indukálhat (25). A Sternberg-Reed sejtek mellett a CD30 nagyfokban expresszálódik az anaplasztikus nagysejtes típusú limfómákban. A legtöbb T- és B-sejtes limfómában azonban nem észlelhető a molekula sejtfelszíni megjelenése. A fent említett 2 sajátos sejttípusú limfómában a CD30 ligand receptorán keresztül autokrin növekedési faktorként jelentős sejtproliferációt okoz. A CD30 ligand kifejeződését megfigyelték a Sternberg-Reed sejteken, azonban anaplasztikus nagysejtes limfómában nem. Felvetődött Hodgkin-kór esetén is a receptor és ligand autokrin proliferációt fokozó szerepe (26) CD40 (TNFRSF5), CD40 ligand (CD154)(TNFSF5) A CD40 glikoprotein a B-sejtek felszínén jelenlévő járulékos kostimulátor molekula, amely a T-sejteken lévő ligandjával kapcsolódik. Megtalálható még follikuláris dendritikus sejteken, monocitákon, fibroblasztokon, érendothel- és tímuszepithelsejteken. Fontos szabályozó szerepet tölt be a B-sejtek proliferációja és érése során, valamint az antigén prezentáló sejtek aktiválódásában. A CD40 molekulán keresztül elinduló intracelluláris jelsorozat elengedhetetlenül fontos a B-limfociták T-sejt-függő aktiválódása során a germinális centrumok kialakulásához, az immunglobulinok izotípusváltáshoz és az affinitáséréshez. Az immunglobulin nehéz láncok átkapcsolódása (IgM/IgG) során a rekombinációt és az immunglobulin termelődést az IgH 3 végén lévő enhancer aktiválásán keresztül segíti elő (27, 28). Gátolja a TRAIL/APO2L expresszióját, fokozza a TNF-α és a Fas termelődését. Gátolja a B-sejtek apoptózisát. A receptor jelátvitel itt is a TRAF-2,-3,-5 és -6 molekulákon keresztül történik, elsősorban az NF-κB aktiválásával. Szerepe van az X-kromoszómához kötött hiperigm-szindróma 30