A melanin koncentráló hormon morfológiai meghatározása humán, rágcsáló és madár agyban

Átírás

1 A melanin koncentráló hormon morfológiai meghatározása humán, rágcsáló és madár agyban Bencze János 1, Murnyák Balázs 1, Deák-Pocsai Krisztina 1, Nagy Katalin 1, Nagy Vanda 1, Németh József 2, Czeglédi Levente 3, Juhász Béla 2, Szilvássy Zoltán 2, Hortobágyi Tibor 1 1 Debreceni Egyetem, Pathologiai Intézet, Neuropathologiai Tanszék, Debrecen 2 Debreceni Egyetem, Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet, Debrecen 3 Debreceni Egyetem, Állattudományi, Biotechnológiai és Természetvédelmi Intézet, Debrecen

2 Absztrakt A táplálékfelvétel központi idegrendszeri szabályozása humorális faktorok és idegi impulzusok által történik. A humorális rendszer meghatározó eleme a melanin koncentráló hormon (MCH). A MCH receptorok (MCHR) két típusa ismert, az MCHR1 nagyfokú homológiát mutat gerincesekben, míg az MCHR2 funkcionális formáját számos emlősállat nem expresszálja. Az MCH rendszert befolyásolni képes molekulák a humán gyógyászat és az agrárágazat számára egyaránt előnyös lehet. A gyógyszerek szervezetre kifejtett hatásának, megbízhatóságának teszteléséhez, elengedhetetlen az MCH és MCHR1 morfológiai meghatározása különböző fajokban. Az általunk standardizált immunhisztokémiai, immunfluoreszcens és autoradigráfiás módszerek jól használhatók a hormon és receptorának lokalizálására, szemi-kvantitatív azonosítására. A morfológiai tesztek segíthetik új és biztonságos hatóanyagok kifejlesztését az elhízás, illetve a depresszió kezelésében.

3 Bevezetés A táplálékfelvétel és energiaháztartás szabályozása komplex folyamat, amelyben a perifériáról (pl. emésztőrendszer, zsírszövet felől) érkező humorális (testfolyadékok elsősorban a vér által közvetített) faktorok, valamint autonóm idegrendszeri impulzusok az agy meghatározott területein integrálódnak. Ezen információkat a hypothalamus és agytörzsi központok feldolgozzák és döntenek fokozni vagy éppen csökkenteni kell a táplálékbevitel mértékét. Ugyanakkor a rendszer komplexitását jellemzi, hogy magasabb rendű neocorticális, subcorticális és limbikus szabályozás is megvalósul (1. ábra), ezzel magyarázható, hogy hangulatunk képes befolyásolni éhségérzetünket ábra: A táplálékfelvétel központi idegrendszeri szabályozásában résztvevő területek (Humán agyfélteke középvonali nézet; A jelöletlen sematikus ábra forrása: commons.wikimedia.org)

4 Melanin koncentráló hormon (MCH) és receptorai Az MCH egy 19 aminosavból álló fehérje, amit Kawauchi és mtsai. izoláltak és karakterizáltak elsőként lazac agyalapi mirigyből, ahol a melanocyták melanin aggregációjának fokozásával szabályozza a halak bőrszínét 2. Később számos emlősállat agyában kimutatták jelenlétét, itt azonban a bőr pigmentációjának meghatározásában nincs bizonyított szerepe. Számos, elsősorban rágcsálókon végzett, tanulmány igazolta az MCH szerepét a táplálékelvétel és energia homeosztázis, emócionális állapot, stressz-válasz és alvás-ébrenlét ciklus szabályozásában 3. Patkányok agyában a hormont kifejező idegsejtek, legnagyobb mennyiségben a lateralis hypothalamus és a zona incerta területén találhatóak 4. A hypothalamus lateralis magcsoportja az elsődleges orexigén (táplálék felvételt indukáló) központ, ami széleskörű projekciót az ad idegrendszer számos területére. Az agytörzsi afferentáció útján, a X. agyideg közvetítésével befolyásolja az emésztőrendszer működését 5, továbbá kis mennyiségben a gyomor-bélrendszeren belül is detektálható MCH, ami alátámasztja az emésztésben betöltött szerepét, ugyanakkor kimutatható jelenléte a hereszövetben is, feltételezve hogy a reproduktív folyamatok szabályozásában is részt vesz 6. Ahhoz, hogy az hormon funkcióját el tudja látni szükség van olyan speciális a sejtmembránban elhelyezkedő struktúrákra úgynevezett receptorokra, amik a ligand megkötése esetén intracelluláris változások láncolatát indítják be. Az MCH első receptorát (MCHR1) 1999-ben azonosították ben karakterizálták a második receptort (MCHR2), ami meglepő módon csupán 38%-os azonosságot mutatot a MCHR1-el 8. A fajok közötti megoszlásban is jelentős eltérések tapasztalhatók, míg MCHR1 az emlősök nagy részében kifejeződik, addig az MCHR2 funkcionális formája számos élőlényből hiányzik (pl. egér patkány) 9. Kísérletes adatok bizonyítják az MCH és receptorának esszenciális szerepét a táplálékfelvétel szabályozásában. Éhezés hatására az MCH mrns szintje emelkedik rágcsálókban, ezzel összhangban az oldalkamrába közvetlenül adott hormon infúzió evést indukál 10. Transzgenikus egerekben lehetőség van egyes géneket kiütni, annak érdekében,hogy vizsgálni tudjuk milyen funkcionális következményekkel jár ez a módosítás, ami felhasználható egyes öröklődő betegségek tanulmányozására. Az MCH túlzott mértékű kifejeződése elhízást eredményez 11 Azok a transzgenikus úgynevezett knoc-out (KO) egerek, amelyekben MCH hiányzott hipofágiásak (csökkent táplálékfelvétel) és soványak voltak 12 Az MCHR1-KO egerek testtömege a normál tartományon belül mozgott, ugyanakkor soványnak imponáltak és a teljes testzsír mennyiségé csökkent., habár a receptor hiányában hiperfágia (fokozott táplálékfelvétel) alakult ki, a társuló hiperaktivitás és fokozott metabolizmus következtében ez nem járt elhízással 13.

5 Neuropatológia vizsgálatok Az MCH nemcsak a táplálékfelvétel szabályozásában, hanem a limbikus rendszerbe adott projekciói révén a különböző hangulati zavarok (pl. szorongás, depresszió) befolyásolásában is esszenciális szerepet tölt be. Az MCHR1 receptort gátolni képes (antagonista) molekulák fejlesztése ígéretes terápiás módszerek lehetnek a világszerte hatalmas problémát jelentő elhízás és depresszió kezelésében 5, ugyanakkor, az agrárágazatban a rendszer aktivitásának fokozása, ezzel együtt a gazdasági állatok testtömegének növelése a kívánatos cél. Ha sikerül olyan alapanyagokat azonosítanunk amiket a táphoz keverve az állatok saját (endogén) MCH hormon szintjét képesek megemelni, az teoretikusan magasabb hozamot eredményezhet és kiválthatja a jelenleg alkalmazott gazdaságilag és/vagy etikailag megkérdőjelezhető módszereket. Annak érdekében, hogy a különböző hatóanyagok MCH rendszerre kifejtette hatását tanulmányozni tudjuk és meggyőződjünk annak biztonságosságáról, elengedhetetlenek a morfológia vizsgálatok, amivel azonosítjuk a hormon és receptorának lokalizációját, szemi-kvantitatív képet kaphatunk az expresszió mértékéről és nyomon követhetjük a változásokat az adott táppal nem etetett, kontrol állatokhoz képest. Tudományos szempontból egyetlen vizsgálati eljárás nem elegendő, azt meg kell erősíteni több különböző patológiai technikán alapuló módszerrel Kutatócsoportunk a projekt keretén belül a korábbi tapasztalatok alapján három módszert (1. Kromogénes immunhisztokémia (IHC); 2. Receptor autoradiográfia; 3. Immunfluoreszcens immunhisztokémia (IF)) standardizált az MCH és MCHR1 morfológiai azonosítására, amely felhasználható humán, patkány és baromfi minták vizsgálatára. A minták előkészítése során formalinos fixálást és parafinba ágyazást, valamint folyékony nitrogénben (-195 C) fagyasztást egyaránt alkalmaztunk. Előző esetben 7 µm-es még utóbbi esetben 20 µm-es metszetek készültek.

6 1. Immunhisztokémia A módszer alapja a mintában keresett antigén elleni immunreakcióval. Az elsődleges antitest megjelöli az antigént, majd egy erre az antitestre spiecifikus biotinált másodlagos antitestet alkalmazunk. A biotint megköti az avidint és a reakciónak megfelelő enzimet tartalmazó polimer. A színtelen szubsztrátot az enzim hasítja, ami színes csapadékot ad a többlépéses reakció lényege a jelerősítés (2. ábra). Szubsztrát (kromogén) Antigén Színes csapadék Enzim Avidin Polimer Biotin Másodlagos antitest Elsődleges antitest Minta 2. ábra: Az immunhisztokémiai reakció felépítése A kereskedelemben kapható antitestek közül kiválasztottuk az általunk vizsgált fajokra legspecifikusabbat. Bioinformatikai analízis során az NCBI (National Center for Biotechnology Information) adatbázisból letöltött hat élőlény (ember, nyúl, patkány egér, kacsa, liba) szekvenciáinak összehasonlítása megerősítette, hogy a az MCH jelölésére alkalmazott immunhisztokémiai antitest által felismert fehérjeszekvencia nagymértékben konzervatív a vizsgált élőlényekben 17 (3. ábra). Ezen eredmények alapján az emlős mintákon kívül az antitest jól használható a vizsgálni kívánt szárnyas állatokban is. A szekvencia illesztések mellett az MCH fehérje alapján elkészítettük az előlények törzsfáját is (4. ábra). A várakozásoknak megfelelően, az emlősök MCH aminosavsorrendje nagyobb mértékű eltérést mutat a madarakban expresszálódó fehérjéhez képest.

7 3. ábra: A melanin koncentráló hormon (MCH) fehérje aminosav-szekvenciájának fajok közötti összehasonlítása. Sárgával emeltük ki az MCH fehérje azon szakaszát, melyet a kiválasztott antitest felismer. Az ábrán csak azoknak az aminosavaknak a kódját tüntettük fel, amelyek eltérést mutattak a vizsgált élőlényekben. A ponttal jelölt aminosavak identikusak mind a hat fajban. 4. ábra: Az MCH fehérje aminosavsorrendje által meghatározott filogenetikai fa

8 A mintákon való tájékozódás érdekében a patkány hypothalamust Paxinos-féle 18 anatómiai atlasz segítségével hematoxylin festett metszeteken lokalizáltuk (5. ábra). 5. ábra. Patkány lateralis hypothalamus (LH) elhelyezkedése, coronális síkú metszeten. Festés hematoxylin A kiválasztott MCH és MCHR1 antitestekkel külön végeztük egyszeres jelölést, valamint a kolokalizáció meghatározása érdekében kettős jelölést is. Utóbbi esetben a két antigén vizualizálásra eltérő színű szubsztrátot használtunk. Az általunk kidolgozott protokoll megbízhatóságát igazolja hogy MCH (6. ábra) és MCHR1 (7. ábra) antitest tekintetében erős immunpozitivitás tapasztalható patkány hypothalamusban. A kettős jelölés, más kutatócsoportok adatait alátámasztva, a hormon és receptorának nagy fokú megoszlásbeli átfedését mutatta 19 (7.D.ábra). Hasonló eredményeket adott a libából származó minták vizsgálata. A szakirodalommal összhangban humán mintákon erős pozitivitás tapasztalható hypothalamus, a híd és a nyúltvelő régióiban 20.

9 6. ábra: Formalin fixált paraffinba ágyazott patkány agyból származó minták anti-mch antitesttel jelölve barna csapadékot adó 3,3'-diaminobenzidine (DAB) reakcióval vizualizálva; kék hematoxylin magfestés. Kis nagyítással (A panel - 40x) erőteljes immunpozitivitás jelenik meg a hypothalamus területén. Nagyobb nagyítással (B panel - 100x és C panel 400x) megfigyelhető, hogy a reakció a citoplazmára lokalizálódik. 7. ábra: Formalin fixált paraffinba ágyazott patkány agyból származó minták anti-mchr1 antitesttel jelölve barna csapadékot adó 3,3'-diaminobenzidine (DAB) reakcióval vizualizálva; kék hematoxylin magfestés. Kis (A panel - 40x) és közepes (B panel - 100x) nagyítással erős immunopozitivitás jelenik meg a hypothalamus területén. Nagyobb nagyítással és (C panel 400x) megfigyelhető, hogy a reakció a sejtmembránra lokalizálódik. Anti-MCH (barna színreakció - DAB) és anti-mchr (piros színreakció - VIP ) kettős jelölés; metilzöld magfestés (D panel). A két immunpozitivitás igen nagymértékben átfed egymással.

10 2. Receptor autoradiográfia Az autoradiográfiás képalkotás alapja a radioaktív izotópokkal jelölt, a vizsgálni kívánt receptorhoz specifikusan kötődő ligandok alkalmazása. A patkány agyból készített metszeteken végzett autoradiográfiás ligand-receptor vizsgálatok lehetővé teszik a receptorok eloszlásának és relatív koncentrációjának meghatározását fiziológiás és patológiás állapotokban 21. A technika segítségével a receptorrendszerek elemezhetők egészséges és kórós körülmények között, illetve a radioligand viselkedése is tanulmányozható. Az autoradiográfiát más módszerekkel kombinálva (pl immunhisztokémia) összetett vizsgálatok is végezhetők. A MCHR specifikus ligandot a humán orvoslásban is használt rövid felezési idejű 68 Gallium 18 Fluor β-sugárzó izotópokkal jelöltük. A mintához kötődött radioligand lokalizálása sugár érzékeny fotoemulziós réteg (film) segítségével történik. A rendszer érzékenységét jelzi, hogy az immunhisztokémiai módszerre nehezen vizualizálható zona incerta területe is egyértelmű pozitivitást mutat (8 ábra). 8. ábra: Patkány agyból készült coronális síkú metszeteken, 68 Ga radioizotóppal jelölt Melanin koncentráló hormon receptor (MCHR) specifikus liganddal végzett autoradiográfia, a sötétebb területek jelzik a pozitív reakciót. A kék nyíl a plexus chorioideust, a narancssárga nyíl a zona incerta területét, a zöld nyíl pedig a hypothalamus pozitivitását mutatja.

11 3. Immunfluoreszcencia (IF) A kromogénes, illetve a fluoreszcens immunhisztokémia között alapvető különbség a reakció vizualizálásában van. A másodlagos antitestek ebben az esetben speciális fény kibocsátására képes molekulával úgynevezett fluorofórral van jelölve (9. ábra). A molekula fényérzékeny, így a labormunka és a metszetek kiértékelése egyaránt sötétben történik. A reakciót fluoreszcens mikroszkóppal tudjuk vizsgálni. Figyelembe véve, hogy a gerjesztéshez szükséges hullámhosszú fény eltér az emittált fény hullámhosszától az eszköz olyan szűrőkkel van felszerelve, ami lehetővé teszi a fény-spektrum különböző tartományainak átengedését, illetve blokkolás Fluorofór Másodlagos antitest Antigén Elsődleges antitest Minta 9. ábra: Az immunfluoreszcens immunhisztokémiai reakció felépítése Konklúzió A MCH rendszer működés kiemelt jelentőségű a táplálékfelvétel szabályozása és a kedélyállapotunk meghatározása szempontjából. Az MCHR-t szelektíven befolyásolni képes hatóanyagok fejlesztésére irányuló gyógyszeripari kutatások megoldást jelenthetnek olyan népbetegségek, mint az elhízás és depresszió kezelésébe, ugyanakkor az orexigén hatás előnyős lehet az agrárágazat számára; az MCH hatását fokozó anyagok azonosítása és a haszonállatok ilyen módon történő táplálása a jelenleginél gazdaságosabban érhetnénk el magasabb hozamot. A potenciális vegyületek élő szervezetre kifejtett hatásának és biztonságosságának tesztelésére elengedhetetlenek az általunk használt morfológia vizsgálatok elvégzése.

12 Köszönetnyilvánítás A munka az AGR_PIAC_ támogatásával valósult meg

13 Irodalomjegyzék 1. Blundell J, Halford J, King N, et al. The Regulation of Food Intake in Humans. Endotext. 2000;(1). 2. Kawauchi H, Kawazoe I, Tsubokawa M, et al. Characterization of melanin-concentrating hormone in chum salmon pituitaries. Nature. 305(5932): Verret L, Goutagny R, Fort P, et al. A role of melanin-concentrating hormone producing neurons in the central regulation of paradoxical sleep. BMC Neurosci. 2003;4(1): Bittencourt JC, Presse F, Arias C, et al. The melanin-concentrating hormone system of the rat brain: An immuno- and hybridization histochemical characterization. J Comp Neurol. 1992;319(2): Hervieu G. Melanin-concentrating hormone functions in the nervous system: food intake and stress. Expert Opin Ther Targets. 2003;7(October): Viale A, Zhixing Y, Breton C, et al. The melanin-concentrating hormone gene in human: flanking region analysis, fine chromosome mapping, and tissue-specific expression. Mol Brain Res. 1997;46(1-2): Bächner D, Kreienkamp H, Weise C, et al. Identification of melanin concentrating hormone (MCH) as the natural ligand for the orphan somatostatin-like receptor 1 (SLC-1). FEBS Lett. 1999;457(3): Hill J, Duckworth M, Murdock P, et al. Molecular Cloning and Functional Characterization of MCH 2, a Novel Human MCH Receptor. J Biol Chem. 2001;276(23): Tan CP, Sano H, Iwaasa H, et al. Melanin-concentrating hormone receptor subtypes 1 and 2: species-specific gene expression. Genomics. 2002;79(6): Qu D, Ludwig DS, Gammeltoft S, et al. A role for melanin-concentrating hormone in the central regulation of feeding behaviour. Nature. 1996;380(6571): Ludwig DS, Tritos NA, Mastaitis JW, et al. Melanin-concentrating hormone overexpression in transgenic mice leads to obesity and insulin resistance. J Clin Invest. 2001;107(3): Shimada M, Tritos NA, Lowell BB, et al. Mice lacking melanin-concentrating hormone are hypophagic and lean. Nature. 1998;396(December): Marsh DJ, Weingarth DT, Novi DE, et al. Melanin-concentrating hormone 1 receptor-deficient mice are lean, hyperactive, and hyperphagic and have altered metabolism. Proc Natl Acad Sci

14 U S A. 2002;99(5): Csonka T, Murnyák B, Hortobágyi T, et al. Assessment of candidate immunohistochemical prognostic markers of meningioma recurrence. Folia Neuropathol. 2016;54(2): Csonka T, Murnyák B, Hortobágyi T, et al. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP1) and p53 labelling index correlates with tumour grade in meningiomas. Folia Neuropathol. 2014;52(2): Szepesi R, Csokonay Ákos, Hortobágyi T, et al. Haemorrhagic transformation in ischaemic stroke is more frequent than clinically suspected - A neuropathological study. J Neurol Sci. 2016;368: Saito Y, Nagasaki H. The Melanin-Concentrating Hormone System and Its Physiological Functions. In: Orphan G Protein-Coupled Receptors and Novel Neuropeptides. Vol 46. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2008: Paxinos G, Watson CR. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. Elsevier; Luthin DR. Anti-obesity effects of small molecule melanin-concentrating hormone receptor1 (MCHR1) antagonists. Life Sci. 2007;81(6): Bittencourt JC. Anatomical organization of the melanin-concentrating hormone peptide family in the mammalian brain. Gen Comp Endocrinol. 2011;172(2): Philippe C, Haeusler D, Fuchshuber F, et al. Comparative autoradiographic in vitro investigation of melanin concentrating hormone receptor 1 ligands in the central nervous system. Eur J Pharmacol. 2014;735: