A vastagbélhám sejtkinetikai változásainak vizsgálata gyulladásos vastagbélbetegségekben a gyulladás szövettani aktivitásának függvényében

Átírás

1 A vastagbélhám sejtkinetikai változásainak vizsgálata gyulladásos vastagbélbetegségekben a gyulladás szövettani aktivitásának függvényében Írta: Dr. Sipos Ferenc Témavezető: Dr. Molnár Béla PhD. Programvezető: Prof. Dr. Tulassay Zsolt II. sz. Belgyógyászati Klinika Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Gasztroenterológia alprogram Szigorlati bizottság tagjai: Opponensek: Bíráló bizottság tagjai: Prof. Dr. Szalay Ferenc egyetemi tanár Dr. Kovalszky Ilona egyetemi tanár Dr. Herszényi László egyetemi adjunktus Prof. Dr. Banai János egyetemi tanár Dr. Peták István tudományos munkatárs Prof. Dr. Schaff Zsuzsa egyetemi tanár Dr. Bálint András egyetemi tanár Dr. Lakatos László osztályvezető főorvos Prof. Dr. Papp János egyetemi tanár Dr. Székely György osztályvezető főorvos Budapest

2 TARTALOMJEGYZÉK 1. ÖSSZEFOGLALÁS Magyar 4 Összefoglalás Angol 5 2. RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 6 3. BEVEZETÉS A gyulladásos bélbetegségek jelenlegi ismereteink szerinti pathogenesise A vastagbélhám normális és kóros sejtkinetikája Sejtkinetikai változások vizsgálatára alkalmas paraméterek Apoptosis Az apoptosis gyulladásos bélbetegségekben Apoptosis kimutatására alkalmazható módszerek Sejtosztódás Proliferációs sejtmagantigén Ki Proliferáció kimutatására alkalmas módszerek p A p53 sejtfunkcióban betöltött szerepe A p53 expresszió immunhisztokémiai vizsgálata Növekedési faktor receptorok Epithelialis növekedési faktor receptor EGFR fehérje expresszió vizsgálata es típusú inzulin-szerű növekedési faktor receptor Az IGF1R rendszer gátló hatása az apoptosis folyamatára Hepatocyta eredetű növekedési faktor receptor A sejtöregedés Telomeráz reverz transzkriptáz es típusú telomeráz asszociált fehérje CÉLKITŰZÉSEK BETEGEK ÉS ANYAGOK A gyulladás szövettani súlyosságának patológiai megítélése MÓDSZEREK TUNEL-reakció Proliferációs sejtmagantigén immunhisztokémia 34 2

3 6.3. p53 onkoprotein immunhisztokémia Epitheliáis növekedési faktor receptor immunhisztokémia Inzulin-szerű növekedési faktor receptor immunhisztokémia Hepatocyta eredetű növekedési faktor receptor immunhisztokémia TERT immunhisztokémia TP-1 immunhisztokémia Többszörös immunfluoreszcens jelölés Kiértékelés Statisztikai elemzés EREDMÉNYEK TUNEL pozitivitás PCNA expresszió p53 expresszió EGFR expresszió IGFR expresszió C-met expresszió TERT és TP1 expresszió Korreláció analízis MEGBESZÉLÉS LEGFONTOSABB ÚJ MEGFIGYELÉSEK ÉS MEGÁLLAPÍTÁSOK IRODALOM SAJÁT KÖZLEMÉNYEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 80 3

4 1.0. ÖSSZEFOGLALÁS A gyulladásos vastagbélbetegségek (colitis ulcerosa, Crohn-betegség) pathogenezisének kezdeti lépése a vastagbélhám barrier funkciójának megbomlása, ami lehetővé teszi, hogy a nyálkahártya alsóbb rétegeibe immunogén faktorok jussanak, és ott aktív epizódokkal kisért krónikus gyulladásos folyamatot tartsanak fent. Az aktív epizódok okozta specifikus betegség tünetek mellett ennek a mechanizmusnak hosszútávú veszélye az, hogy a vastagbélhámban malignus jelenségek kialakulásának kedvez. Munkám során azt vizsgáltam, hogy az alapvető sejtkinetikai paraméterek (apoptosis, proliferáció, tumorszuppresszió, regeneratív folyamatok, és sejtöregedés), amelyek egyensúlyának megbomlása a hámréteg barrier funkciójának zavarát okozza, miként változnak a gyulladásos reakció szövettani aktivitásával párhuzamosan. Megállapítottam, hogy a vastagbélhámsejtek apoptosisa és proliferációs aktivitása a gyulladás szövettani aktivitásának mértékével párhuzamosan fokozódik, és független a gyulladásos betegség típusától. Az apoptosis fokozódása a gyulladásos vastagbél nyálkahártya sérülékenységét jelzi, míg a fokozott proliferációs aktivitás az aktív gyulladás során jelentkező regeneratív válasz. A proliferációs aktivitás fokozódása már enyhe gyulladásban is kimutatható. A hámsejt regenerációt elősegítő szignálok (növekedési faktor receptorok; EGFR, IGFR, HGFR), valamint a sejtöregedés ellen ható telomeráz aktivitás is enyhe, esetenként mérsékelt gyulladásban növekednek leginkább. A funkciója vesztett p53 tumorszuppresszor fehérje kifejeződése szintén a gyulladásos aktivitással párhuzamosan növekedik. Az aktív gyulladásos epizódok során a vastagbélhám proliferatív zónája begyűjti a p53-at érő genetikai ártalmakat, majd a betegség hosszan fennálló, enyhe gyulladással kisért kiégett szakaszában a genetikailag károsodott hámsejtek, elvesztvén apoptosissal szembeni érzékenységüket, és a folyamatosan jelenlévő, túlélést biztosító mitogén faktorok hatására, valamint az immortalizációban nélkülözhetetlen telomeráz aktivitás növekedésének segítségével kórosan osztódnak. Ezzel megteremthetik a későbbi malignus folyamat kialakulásának lehetőségét. 4

5 Summary Assay of changes in colonic epithelial cell kinetics in inflammatory bowel diseases allowing for the histological activity of inflammation The initial step of the pathogenesis of inflammatory bowel diseases (ulcerative colitis and Crohn s disease) is the loss of epithelial barrier function, which allows immunogenic factors to penetrate into the deeper layers of the mucosa where they sustain a chronic inflammatory process accompanied by active flares. Beside the specific symptoms of active inflammation this longstanding inflammatory process subserves the development of malignant epithelial changes. I studied the changes developing in paralell with the histological activity of inflammation of such basic cell kinetical parameters (apoptosis, proliferation, tumor suppression, regenerative mechanisms, cell aging) that are responsible for the altered epithelial barrier function. I showed that apoptosis and proliferation of colonic epithelial cells is independent from the type of the disease, only increase in line with the degree of inflammation. The inreased apoptosis indicates the vulnerability of the inflamed mucosa, while the elevated proliferative activity is a regenerative response to active inflammation. The elevated proliferation is already present in mild inflammation as well as the expression of regenerative signals (growth factor receptors: EGFR, IGFR, HGFR) and anti-aging factor telomerase. The function-lost p53 tumor suppressor protein expression is also increasing in line with the inflammatory activity. The proliferative zone of the colonic epithelium collects genetic harms of p53 in the active phase of inflammation, then in the longstanding mild phase of the disease the genetically impaired epithelial cells becoming apoptosis resistant, surviving and imortalized starts pathological proliferation. With these characteristics these cells make the opportnity of a later malignant transformation. 5

6 2.0. Rövidítésjegyzék ABL: Abelson murine leukemia onkogén AC: aspecifikus colitis Akt: protein kináz; onkogén AP2: transzkripciós faktor; activating enhancer-binding protein 2 Apaf-1: apoptotic protease activating factor 1 Bad: Bcl2 halál antagonista; Bcl2 antagonist of cell death BAD: bcl-asszociált halál promoter Bax: BCL2-asszociált X fehérje; proapoptotikus fehérje Bcl2: B-sejtes CLL/lymphoma 2 BH3: Bax halál domain 3 Bid: BH3-interacting domain death agonist Bik: Bcl2-interacting killer Bim: Bcl2-interacting fehérje C: kaszpáz CARD15/NOD2: kaszpáz-aktiváló és összegyűjtő /recruitment/ domain CC: citokróm C CD: Crohn-colitis CDK: ciklin-függő kináz CRC: colorectalis rák CrmA: citokin-válasz módosító A DAG: diacil-glicerol DAXX: halál-asszociált fehérje; death-associated protein DcR: ál-halál receptor, decoy receptor DD: halál domain; death domain DISC: death-inducing signaling complex DR: halál receptor; death receptor E2F: transzkripciós faktor EGF: epitheliális növekedési faktor EGFR: epithelialis növekedési faktor receptor eif4e-4e-(bp1): eukarióta iniciációs faktor 4 (és kötőfehérjéje) ELK1: ETS onkogén család tagja; transzkripciós aktivátor ER: endoplazmás retikulum 6

7 ERK: extracelluláris szignál szabályozta kináz (MAP-kináz) FADD: Fas-asszociált halál domain FasL: Fas-ligand FLIP: FLICE-gátló fehérje FOXO: forkhead transzkripciós faktorok Grb2: növekedési faktor receptor kötő fehérje GSK3β: glikogén szintáz kináz 3β HGF: hepatocyta eredetű növekedési faktor HGFR (C-met): hepatocyta eredetű növekedési faktor receptor IAPs: apoptotikus fehérjék inhibitorai; inhibitors of apoptotic proteins IGF-1: 1-es típusú inzulinszerű növekedési faktor IGF1R: 1-es típusú inzulin-szerű növekedési faktor receptor IGFBPs: IGF1 fehérjékhez kötődve IKKα: conserved helix-hurok-helix ubikviter kináz (CHUK) IL: interleukin IP2: inozitol-biszfoszfát IP3: inozitol-3-foszfát IRS: inzulin receptor szubsztrát ISNT: in situ nick transzláció JAK: janus tirozin kináz JAK1: Janus kináz 1 JNK: Jun N-terminális kináz LOH: heterozigótaság elvesztése; loss of heterozygosity MAd1: mitotikus arrest-deficient 1 MAPK: mitogén aktivált fehérje kináz Mdm2: mouse double mimic 2 MDR1: multidrug resistance 1 MEK: extracelluláris szignál szabályozta kináz MEKK-1: mitogén-aktivált protein kináz kináz kináz-1 MKK-2: tirozin kináz receptor mtor: mammalian target of rapamycin NF-κB: nukleáris faktor- κb (proinflammatorikus transzkripciós faktor) PC: prokaszpáz PDK: foszfoinozitol-függő kináz 7

8 PI3K: foszfoinozitol 3-kináz PIP2: foszfoinozitol-biszfoszfát PIP3: foszfoinozitol-3-foszfát PKB: protein kináz B PKC: protein kináz-c PLC: foszfolipáz-c prb: retinoblastoma fehérje PTEN: 10-es kromoszómán mutálódott foszfatáz; fosztfatáz és tenzin homológ Raf: onkogén Ras: onkogén ROS: reaktív oxigén gyökök S6K: p70s6k, riboszómális fehérje S6 kináz SH2: Src homológ 2 SP1: transzkripciós faktor STAT: szignál transzducer és transzkripciós aktivátor Tdt: terminális dezoxinukleotidil transzferáz TERT: telomeráz reverz transzkriptáz TGF: transzformáló növekedési faktor TLR4: Toll-like receptor 4 TNF: tumor nekrózis faktor TNFR1: tumor nekrózis faktor receptor-1 TP-1: 1-es típusú telomeráz asszociált fehérje TRADD: TNFRSF1A-asszociált halál domain TSC: tuberous sclerosis gén TUNEL: terminalis-dezoxiribonukleotidil transzferáz mediált dutp nick-end labeling UACL: ulcer-associated cell lineage UC: colitis ulcerosa 8

9 3.0. BEVEZETÉS A colitis ulcerosa és a Crohn-betegség idiopathiás gyulladásos bélbetegségek, amelyek a fejlett országok morbiditási adatainak jelentős tényezőjeként szerepelnek. Földrajzi előfordulásuk eltérő: életmód, társadalmi helyzet, népcsoportbeli különbségek befolyásolhatják. Hazánkban évente új megbetegedéssel kell számolni. Az utóbbi években a két betegség előfordulásának aránya is változott: két újonnan felfedezett colitis ulcerosás megbetegedésre jut egy újonann diagnosztizált Crohn-betegség. (1) Az etiológiájuk, az egymáshoz való viszonyuk, valamint más betegségekkel való kapcsolatuk évek óta intenzív kutatás tárgyát képezik. A Crohn-betegség és a colitis ulcerosa közötti kapcsolat kettős természetű. Mindkét betegségre jellemző a krónikus gyulladás, és számos extraintesztinális manifesztáció megléte (iridocyclitis, uveitis, pyoderma gangrenosum, erythema nodosum, izületi gyulladás stb.). Az esetek többségében a két betegség egymástól mégis elkülöníthető. A Crohn-betegség a gasztrointesztinális traktus bármelyik szakaszát érintheti, míg a colitis ulcerosa a vastagbélre lokalizálódik. Crohn-betegségben jellemző a bélfal egészére kiterjedő, transzmurális gyulladás, valamint a gyulladt és ép szakaszok éles elkülönülése és váltakozása. Colitis ulcerosában a gyulladás a vastagbél nyálkahártyára lokalizálódik, és a rectumtól kezdődően folyamatos kiterjedést mutat. (2) Az esetek 10%-ában azonban még alapos szövettani vizsgálat után is nehéz különbséget tenni a két betegség között. Ilyenkor meghatározatlan colitisről (indeterminate colitis) beszélünk. (2) A legújabb eredmények bepillantást nyújtanak a két betegségek pathogenezisébe. A kezdeti kísérletek, amelyek arra irányultak, hogy specifikus kórokozót vagy immunológiai eltérést igazoljanak a krónikus folyamatok hátterében, sikertelenek voltak. Ma már tudjuk, hogy a tünetek aktiválódásában környezeti faktorok, pszichés tényezők, fertőzéses állapotok, stresszhelyzetek, gyógyszeres behatások (pl.: antibiotikumok), és veleszületett adottságok mellett még számos felederítésre váró komponens játszhat szerepet. (2) 3.1. A gyulladásos bélbetegségek pathogenesise jelenlegi ismereteink szerint A fekélyképződést közvetlenül kiváltó ok gyulladásos bélbetegségekben nem ismert. Jelenlegi tudásunk szerint a nyálkahártya sérülése a hámfelszín alatt zajló immunológiai folyamatok eredménye. (3) 9

10 1. ábra: A gyulladásos bélbetegségek pathogenezisének lépései Jelenlegi ismereteink szerint a gyulladásos bélbetegségek pathogenezise az alábbi lépések sorozatából áll (1. ábra). 1: A bélflóra összetételének megváltozása változásokat eredményez a hámrétegben, és ezzel megzavarja annak barrier szerepét. 2: A sérülés következtében fokozódik a baktériumok transzlokációja a hámrétegen keresztül a subepitheliális szövetek felé. 3: Ez a nyálkahártyához kötődő immunrendszer aktiválódását eredményezi. 4: A lamina propriába vándorolt makrofágok ill. dendritikus sejtek bekebelezik a baktériumokat ill. azok bizonyos sejtfelszíni komponenseit, és a CARD15/NOD2-höz kötődnek. 5: Funkcióvesztéssel járó mutáció következtében nincs hatékony NF-κB aktivitás, ezért a hámsejt rétegen átjutott bakteriális termékek eliminációja lelassul. Azoknak a fehérjéknek a mutációja, amelyek potenciálisan képesek arra, hogy bakteriális termékeket juttassanak ki a sejtből (pl: MDR1) fontos lehet ezen a ponton. A sejtmembrán bakteriális érzékelőinek hatástalan működése is ezen a ponton játszik szerepet (pl.: TLR4 mutálció). 6: Másik lehetőség magának az NF-κBnak a mutációja. Ez gátolhatja, illetve késleltetheti a gyors eliminációt. Ha az aktiváló inger eltávolítása nem kellő gyorsaságú, az antigén prezentáló sejtek működésbe lépnek, és Th1 sejteket aktiválnak. 7: Ezáltal a normális körülmények között alulszabályozott társingerekkel együtt T-sejt osztódást indukálnak, valamint megindul a Th1 ösztönző citokinek termelése is (IL-12, IL-23, IL-18). A meghibásodott veleszületett immunválasz így kompenzálódik. 8: A 10

11 szabályozó T-sejtek elégtelen működése hozzájárulhat a megnyúlt Th1 aktivitáshoz, ezáltal a krónikus gyulladás kialakulásához A vastagbélhám normális és kóros sejtkinetikája A vastagbél mirigyeiben a hámsejt migráció, differenciáció és apoptosis szigorú szabályok szerint, az axiális tengely mentén halad. A crypta bázisán helyezkednek el az epitheliális őssejtek, ezt követi a proliferációs és differenciációs zóna, majd a crypta luminális szájadékánál, valamint a felszínes nyálkahártyán helyezkednek el az érett, valamint az elöregedett, eliminálódó sejtek. (4) Kis számban a vastagbélben is előfordul gyomormirigy típusú migrációs mintázat: a vastagbél bizonyos szakaszain az őssejtek a crypta középső részén helyezkednek el, és két irányban vándorolnak a crypta bázisához és luminális felszínéhez. Az őssejtek száma kisebb a proliferáló sejtekhez képest, mégis elegendő számban vannak jelen ahhoz, hogy sérülést követően a crypta regenerálódjon. Az epitheliális őssejtekre más proliferáló sejteknél hosszabb sejtciklus jellemző. Az osztódásuk is aszimmetrikus. Egy osztódás után keletkezhet két pluripotens őssejt, egy őssejt és egy multipotens utódsejt, és két multipotens leánysejt. A pluripotens őssejtből kialakulhat a vastagbél nyálkahártya négy fő jellegzetes sejtfélesége: a hengerhám, a mucint szekretáló kehelysejt, az enteroendokrin sejtek és a Paneth-sejt. Speciális, krónikus fekélyek körül megjelenő, és a regenerációt elősegítő fehérje faktorokat termelő UACL (ulcer-associated cell lineage)-sejtek is képződhetnek belőlük. (5,6) A crypták hasadása határozza meg a bélhám crypta-sűrűségét. Hasadásra akkor kerül sor, ha a crypta elegendő számú őssejtet tartalmaz. Ez általában a kiinduló sejtszám kétszeresét jelenti. A crypta bazális vége behúzódik, majd hosszirányú hasadással kettéválik. Egészséges vastagbélben előfordul aszimmetrikus crypta hasadás is, azonban rákmegelőző állapotokban ez gyakrabban és nagyobb számban látható. (5) Az őssejtek differenciációjának irányát és proliferációjának mértékét a genetikai programon kívül külső, eddig nem kellőképpen megismert tényezők is befolyásolják. Valószínű, hogy mesenchymalis faktorokról van szó, mivel in vitro és in vivo kísérletekben a mesenchyma endodermális differenciációt indukált. (5) A humán vastagbélben a mirigyhámsejtek turnoverének mértéke számottevő. 2-3 nap alatt az egész vastagbélhám megújul. (7) Ez a folyamat a nyálkahártya szöveti integritásának megőrzése miatt nélkülözhetetlen, ugyanis ennek segítségével a bakteriális, toxikus ill. mitogén faktorok által kiváltott genetikai defektusok felhalmozódása elkerülhető. 11

12 A gyulladásos bélbetegségek pathogenezisének első lépése, azaz az epitheliális turnover zavarának elsődleges oka részleteiben ma még nem ismert. Kóros körülmények között megváltozik a bélhám sejtkinetikája, ami fekélyképződéshez ill. kóros sejtosztódáshoz vezethet. Gyulladásos bélbetegségekben szenvedő betegek között, főként a colitis ulcerosásoknál, szignifikánsan magasabb a colorectalis rákok kialakulásának kockázata, különösen a betegség hosszabb, 10 éven túli fennállása esetén. (8) Feltételezhető, hogy a sejtkinetikai egyensúly zavara szoros összefüggésben van a submucosalis immunitás eltéréseivel. A tudományos irodalomban nem található egyértelmű adat arra nézve, hogy a krónikusan aktív gyulladás során miként változik a hámsejtek osztódása, apoptosisa, öregedése, valamint az epitheliális regeneráció. Szintén ismeretlen ezeknek a sejtkinetaikai paramétereknek a betegség-specificitása. (7,9,10) A nyálkahártya turnover zavarának megismerése nélkülözhetetlen a pathogenezis pontosabb leírása, valamint a malignus transzformáció kezdeti lépéseinek megismerése szempontjából Sejtkinetikai változások vizsgálatára alkalmas paraméterek A szöveti integritás megőrzését két alapvető folyamat határozza meg: a sejtosztódás és a sejtpusztulás. Eukarióta szomatikus sejtek osztódása kromoszómaszámot megtartó módon, mitózissal történik. A sejthalál genetikailag programozott módja az apoptosis. A sejtosztódást-sejtpusztulást befolyásoló alapvető tényezők közé tartozik a sejt genetikai épségét felügyelő p53 tumorszuppresszor gén. A p53-nak többféle szerepe is van a sejtek életében. A vad típusú p53 fokozott kifejeződése a sejtciklust gátolja, esetenként a sejt apoptosisához vezet. Genotoxikus stresszre, DNS-károsító anyagokra adott válaszként a p53 vészfékként reagál, és leállítja a sejtciklust, vagy apoptosist indukál. Ezáltal megvédi a genomot a mutációk felszaporodásától. Azok a sejtek, amelyekben nem található meg a p53, genetikailag instabilak és gyakran daganat képződik belőlük. (11) A szöveti károsodás utáni regeneratív folyamatok, valamint genetikailag károsodott sejtek túlélésének szempontjából, többek között, a növekedési faktorok által közvetített túlélési szignáloknak (pl.: EGFR, IGFR, C-met) és a sejtöregedés ellen ható telomeráz aktivitásnak is fontos szerepe van. 12

13 3.4. Apoptosis A sejthalálnak két fő típusa létezik. Az egyik a nekrózis, amely során külső ártalom hatására pusztul el az érintett sejt. Jellemzője, hogy gyulladásos reakció kíséri. A sejthalál másik fő típusa a programozott sejthalál, az apoptosis. Ennek során a sejtben lévő és az örökítő anyag védelmét és genetikai sérülés nélküli továbbadását felügyelő, védő mechanizmusok hatására dönt a sejt a saját haláláról. Gyulladás nélkül lezajló, akár egy sejtre lokalizálódó aktív folyamat, mely során sejtzsugorodás, kaszpáz-kaszkád (cisztein-aszpartát specifikus proteázok) aktiváció, az örökítő anyag fragmentációja, a sejtszervecskék aktív módon történő lefűződése következik be. Végül az apoptotikus sejt a külvilág felé távozik (exfoliáció) a szervezetből, vagy a környező, fagocitózisra képes sejtek takarítják el. Az apoptosis speciális esete a sejt-extracelluláris mátrix kapcsolat megszakadásán alapuló programozott sejthalál, az anoikis. Az apoptosis általánosan jellemző az eukarióta élőlényekre. Az emlős sejtekben az apoptosisnak két fő jelátviteli útja van. Az egyiknél külső jelek, halálligandok-halálreceptorok kapcsolódásának hatására indul el az eseménysor. Ez a külső út vagy halálreceptor út. A másik a mitokondriális út, amely során intracelluláris károsodás után aktiválódik a folyamat (2. ábra). A halálreceptorok (TNFR1, Fas, DR3, -4, -5, -6) és ál-halálreceptorok (decoy receptor, DcR; DcR1, -2, -3) a TNF-receptor családba tartozó I-es típusú transzmembrán glikoproteinek közé tartoznak és ciszteinben gazdag extracelluláris doménnel rendelkeznek. Az ál-halálreceptorok kivételével legtöbbjük homológ citoplazmatikus haláldomain (DD, death domain) részen keresztül közvetíti a halál-szignált a sejt belseje felé. Ezekhez adapter fehérjék kapcsolódnak, és így alakul ki a jeltovábbító fehérje komplex (DISC, death-inducing signaling complex). A halálreceptorok aktiválódásához több receptornak kell összekapcsolódnia: homo- ill. multimerek képződésére van szükség. A receptor ligandok, avagy halálligandok II-es típusú transzmembrán glikoproteinek (pl.: TNF-α, TRADD, FasL, FADD, DAXX), amelyek trimerként keresztkötést hoznak létre a receptorokon, így aktiválván azokat. (12,13) Az apoptosist elindító ligand-receptor kötés pro- és antiapoptotikus Bcl-2 fehérjék közreműködésével a feleslegessé vált, elöregedett, vagy genetikailag károsodott sejtek eltávolítását biztosítja. A proapoptotikus fehérjék (Bax, Bad, Bid, Bik, Bim) tartalmaznak egy α-helikális szerkezetű BH3 haláldomaint, amely kapcsolódni képes az anti-apoptotikus Bcl-2 és Bcl-XL fehérjék hidrofób BH3 zsebéhez. Ezzel olyan heterodimereket alkotnak, amelyek 13

14 gátolják a Bcl-2 és XL fehérjék túlélést biztosító hatását. A pro- és antiapoptotikus fehérjék relatív aránya határozza meg a programozott sejthalál bekövetkeztének valószínűségét. A proapoptotikus fehérjék a mitokondriumok felszínén hatva csökkentik a mitokondriális transzmembrán potenciált, és elősegítik a citokróm C elfolyását. Dezoxi-ATP jelenlétében a citokróm C az Apaf-1-gyel (apoptotic protease activating factor 1) komplexet alkot, és aktiválja azt. Az aktivált Apaf-1 inaktív kaszpázokhoz kötődik (pl: prokaszpáz-9), és aktiválja azokat. Az így elinduló kaszkpáz-kaszkád apoptosist eredményez. (6,14,15,16) 2. ábra: Az apoptosis két fő útvonalának (egy receptoriális- és a mitokondriális út) sematikus ábrája A 9-es és 8-as iniciátor kaszpázok aktiválódása további kaszpáz aktivációt és visszafordíthatatlan sejthalált eredményez. A mitokondriális utat a Bcl-2 család pro- és antiapoptotikus tagjainak relatív expressziója szabályozza. A proapoptotikus fehérjék citokróm C és Apaf-1 felszabadulást eredményeznek a citoszól felé, és ez aktiválja a kaszpázkaszkádot. 14

15 Az apoptosis gyulladásos bélbetegségekben Számos, az apoptosis indukciójában résztvevő mechanizmust azonosítottak emlős sejtekben. Ide tartoznak a mitokondrium membránjának permeabilitását okozó tényezők, vagy olyan faktorok, amelyek közvetlenül aktiválják a halál receptor család tagjait. Gyulladásos bélbetegségekben a Fas/FasL (CD95/CD95L) rendszer által közvetített apoptosisnak van jelentős szerepe. (7,17) A Fas a TNF receptor szupercsalád tagja. A FasL Fas fehérjén keresztül a célsejt membránjában Fas trimerizációt okoz. A fehérje-komplex a Fas-asszociált fehérje halál domainhez (FADD) kapcsolódik. Ezt követően a FADD halál-effektor domainje (DED) prokaszpáz-8-ból proteolitikus hasítással aktív kaszpáz-8-at képez. Ez az enzim indítja el azt a kaszpáz-kaszkádot, ami aztán végül az örökítő anyag feldarabolódásához, és apoptosishoz vezet. A kaszpáz-8 Bid fehérje aktivációja átal is okozhat apoptosist. (18) A Fas-indukálta apoptosist számos lépésben gátolhatja a FLIP (FLICE-gátló fehérje), a Bcl-2 vagy a CrmA (citokin-válasz módosító A). A kaszpáz-3 kaszpáz-9 általi történő aktiválása gátolhatja az apoptosist gátló fehérjéket (Inhibitors of apoptotic proteins, IAPs). Az Akt fehérjét (protein kináz) számos növekedési faktor aktiválhatja, a PTEN pedig gátolhatja. Az Akt két különböző útvonalon biztosítja a sejt túlélését. Foszforilálja a Bcl-2 családba tartozó Bad fehérjét, így az a mal együtt működve, és a Bcl-xL-ről leválva elősegíti a sejt túlélést. Az Akt fehérje az IKKα (Conserved Helix-hurok-helix Ubikviter Kináz; CHUK) aktivátora is. Ennek segítségével NFκB aktivációt okoz, és segíti a sejt túlélését. A proapoptotikus Bcl-2 család tagjai (Bax, Bak) elősegítik a mitokondrium membrán permeabilitásának növekedését. A Bcl-2 gátolja a hatásukat. A mitokondrium membrán permeabilitásának növekedése az intermembrán térből apoptosist elősegítő anyagok citoszólba való jutását eredményezi. Ilyen anyag például a citokróm C. Ez elősegíti a proteáz aktivátorok (kaszpázok) felszabadulását, és a DNS fragmentációjával ill. mutációk kialakításával apoptosishoz vezet. Ezzel párhuzamosan Smac/Diablo felszabadulás is történik, ami gátolja a kaszpázok IAPs általi gátlását, tehát serkenti a kaszpáz működést. A mitokondrium membrán permeabilitásának növekedése reaktív oxigén gyökök (ROS) képződéséhez vezet. Ezeknek az apoptosis degradációs fázisában (pl: sejtmembrán eltérések) van szerepe. (18,19,20,21) 15

16 Apoptosis kimutatására alkalmazható módszerek Az apoptosis kulcsfontosságú biokémiai történése az endonukleolízis, amely során a DNS oligonukleoszóma méretű fragmentumokká darabolódik fel. Ezt a folyamatot gyakran alkalmazzák az apoptosis kimutatására. Agaróz gélen történő elektroforézis során típusos DNS létra jelenik meg. Ez az eljárás azonban nem ad felvilágosítást az egyedi sejtekben végbemenő változásokról, ill. az apoptosis szöveti lokalizációjáról, vagy a sejtdifferenciációval való kapcsolatáról. A feltöredezett DNS szálak enzimatikus in situ jelölésével azonban információt kaphatunk erről a folyamatról. DNS polimeráz (ISNT: in situ nick translation) vagy tdt (terminális dezoxinukleotidil transzferáz) segítségével biotinilált nukleotidok építhetők be (TUNEL: Tdt-mediated dutp nick end labeling) a tört DNS végekbe. Az utóbbi enzim használatával azonban nagyobb jelölési sűrűség érhető el, a reakció kinetikája gyorsabb, mint ISNT esetén, valamint a TUNEL metodika specifikusabb az apoptotikus sejtekre, mint a nekrotikusakra. Gyulladásos bélbetegségekben a Fas/FasL (CD95/CD95L) rendszer által közvetített apoptózisnak jelentős szerepe van. (22,23) A TNF/TNF-receptor családhoz tartozó fehérjék immunhisztokémiai vizsgálata lehetőséget biztosít a bélhámsejtek és a lamina propria lymphoid sejtjeinek sejtkinetikai jellemzésére. A Fas-fehérjét elsősorban a bélhámsejtek, a Fas-ligandot inkább a nyálkahártyát infiltráló lymphocyták expresszálják. (17,22,24) A bcl-2 géncsalád tagjainak működési zavara is megtalálható gyulladásos bélbetegségekben. A géncsaládba tartozó bcl-2 és bax gének által termelt fehérjék részt vesznek az apoptosis/proliferáció szabályozásában. A Bcl-2 antiapoptotikus hatású fehérje, a ceramidok által közvetített apoptotikus jelátvitelt gátolja. A Bax-fehérje ezt a hatást gátolja, tehát apoptotikus hatású. (25,26,27) Anti-Bcl-2- és anti-bax-antitestekkel következtetni lehet a szöveti egyensúlyi zavarra. (27) Természetesen az itt felsorolt módszereken kívül egyéb, apoptosis kimutatásra alkalmas technikák is léteznek (pl: M30 Cytodeath-a kaszpázok által degradált citoszkeletális fehérje töredékek kimutatása; kaszpázok immunhisztokémiai kimuttása stb.), azonban ezeket a technikákat elsősorban sejtkultúrában alkalmazzák. Vastagbél nyálkahártyában, főleg fagyasztott mintákban és formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszetek esetében használatuk nincs megfelelően kidolgozva. 16

17 3.5. Sejtosztódás Eukariótáknál két fő sejtosztódási forma ismeretes. Az egyik az ivarsejtekre jellemző, kromoszómaszám feleződést eredményező meiózis. A másik a szomatikus sejtekre jellemző, kezdeti kromoszómaszámot megtartó mitózis. A sejtek életét nyugalmi és osztódási ciklusok jellemzik. A nyugalmi fázis a sejt látszólagos nyugalmi állapota. Ilyenkor végzi a sejt a rá jellemező működéseket, valamint ekkor zajlanak a sejtosztódást előkészítő folyamatok. Három fázisa van. A G1 fázis a preduplikációs fázis. Ebben a sejt felkészül a következő, szintetikus (S) fázisra, amelyben a sejtmag DNS állománya megkétszereződik, és ekkor szintetizálódnak a sejtosztódás enzimei is. Ezt követi a G2 fázis, ami felkészülés az osztódásra, azaz az M-fázisra. Mind a G1-, mind a G2-fázisban van egy kontroll pont, amikor a sejt ellenőrzi a saját genetikai állományát, és ha hibát észlel, akkor leáll a sejtciklus. Ennek a folyamatnak az egyik kulcsfontosságú eleme a p53 gén. Osztódást követően a sejt belép a sejtciklusba, vagy ún. G0 (posztmitotikus)-fázisba kerül. Ez egy olyan nyugalmi fázis, melyekben a sejt a rá jellemző funkciót végzi, de osztódásra nem készül fel. A sejtciklus szabályozását elsősorban ciklinek és ciklin-fügő kinázok végzik. A ciklin D1, D2 és D3 a G1-fázisban, a ciklin A az S-fázisban, a ciklin E a G1 és S fázisban fejti ki hatását. A ciklin B1 a G2, a ciklin B2 a G2 és M fázisban hat Proliferációs sejtmagantigén A proliferációs sejtmag antigén (PCNA) a sejtciklussal összefüggő sejtmagfehérje, az exonukleáz aktivitással rendelkező δ-típusú DNS polimeráz kofaktora, és mint ilyen, nélkülözhetetlen az emlős sejtek DNS replikációja során az eredeteiség megőrzésében. (28,29,30,31) Főként a sejtciklus S fázisában szintetizálódik, a nyugvó sejtekben csak kis mennyiségben található meg Ki-67 A G0 fázis kivételével a sejtciklus minden fázisában megtalálható proliferációs marker. A szintetizált fehérje mennyisége az S fázis második felében kezd el növekedni, csúcskoncentrációját a G2 és az M fázisban éri el. (30) A Ki-67 antigén ellenes antitest egy ismeretlen funkciójú kromatin fehérjéhez kötődik. (32,33) Mivel antisense oligonukleotidok 17

18 alkalmazása dózisfüggő módon gátolja a sejtosztódást, feltételezhető, hogy a Ki-67 fehérje expressziója a sejtproliferáció abszolút feltétele. (34) Proliferáció kimutatására alkalmas módszerek A colorectalis nyálkahártya proliferációs aktivitásának mérésére számos eljárást kidolgoztak. A bélhámsejtek triciált-timidin vagy bróm-dezoxi-uridin felvételének autoradiográfiás vizsgálata például colitis ulcerosás betegek rákkockázatának meghatározására ill. a gyulladás fokának megállapítására alkamazható. (35,36) Az anti-ki-67 antitest használatát proliferáció kimutatására eleinte az korlátozta, hogy csak fagyasztott mintákon lehetett alkalmazni, mivel a fixálás elfedte az antigén megfelelő epitópját. A Ki-67-es gén egyes szakaszainak klónozása és szekvenálása azonban lehetővé tette a MIB 1 antitest kifejlesztését. PCNA és Ki-67 antigének elleni monoklonális antitestek segítségével lehetőség nyílt fagyasztott vagy formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetmintákon a sejtosztódást tanulmányozására, valamint az adott szövet proliferációs indexének meghatározására. (32,30) A sejtosztódásra az apoptosis folyamatában bekövetkező változások indirekt módon történő kimutatásával is következtethetünk. A programozott sejthalál több gén által szabályozott mechanizmus. A kontrollpontok hibája fokozott sejtproliferációt okozhat. Számos daganatos elváltozásban igazolták már a tumorszuppresszor gének szerkezeti elváltozásait. A p53 gén ezeknek az egyik legismertebb képviselője. Fiziológiás körülmények között a sejtciklus G1 fázisában találkozhatunk a p53 fehérje fokozott expressziójával. Ez a fehérje felelős azért, hogy a sejtciklust lassítva lehetővé tegye a sérült sejtben a DNS repairt. A heterozigótaság elvesztése (loss of heterozygosity: LOH) vagy pontmutáció által kialakult génszerkezeti elváltozások detektálásával (pl.: kromoszóma analízis, PCR) lehetővé válik az apoptosis zavarának kimutatása. A hibás gén által termelt p53 onkoprotein lassan bomlik le, ezért immunhisztokémiailag is detektálható. (37,38) 3.6. p53 A p53 tumor antigén nagy mennyiségben található meg különböző transzformált sejtekben. A fehérje kimutatható aktívan osztódó, nem transzformálódott sejtekben is, de hiányzik vagy csak kis mennyiségben van jelen a nyugvó sejtekben. 18

19 A bp hosszúságú p53 gén a 17-es kromoszóma rövid karján helyezkedik el (17p13.1). Az exonok és az intronok összesen bp-t tesznek ki. (39) A p53 gén egy 393 aminosavból álló fehérjét kódol. Tetramerizációt követően négy összekapcsolódott p53 molekula tud specifikusan a DNS-hez kötődni. A fehérjének több funkcionális domainje van. Az N-terminális végen transzkripciót aktiváló domain található. A középső, magi rész, a megfelelő bázissorrendű DNS-szakasz kiválasztásáért, és a fehérje kötődéséért felelős. Ez a DNS-kötő domain ellenálló a fehérjebontó enzimekkel szemben. A p53 fehérje C-terminálisán egy szabályozó domain található, amely a középső, magi domain specifikus kötődését befolyásolja. Közvetlenül mellette a tetramerizációért felelős domain helyezkedik el (39). A p53 fehérje a p53 kötő helyhez (p53 binding site) kapcsolódva aktiválja a downstream géneket, amelyek a növekedést és/vagy az inváziót gátolják. (40) A p53 transzkripciós aktivátora azoknak a géneknek, amelyek p53 kötőhellyel rendelkeznek, és erős traszkripciós inhibitora azoknak a géneknek, amelyek nem rendelkeznek ilyen kötőhellyel. A növekedést gátló gének expresszióját csökkentheti a p53 egyik vagy mindkét alléljének az elvesztése, amely a tetramer expressziót csökkenti. A p53 fehérje transzkripciós faktorként a sejtmagban fejti ki hatását. Ahhoz, hogy a p53 a mag közelébe kerülhessen, kapcsolódnia kell a mikrotubuláris hálózathoz és a dineinhez. Ezután transzportreceptorokra kerül, melyek a magpórusokon keresztül a magba juttatják. Ez a mikrotubuláris hálózaton történő szállító mechanizmus csak a sejtet ért stressz hatására aktiválódik. A normálisan osztódó sejtekben a fehérjének ki kell kerülnie a magból ahhoz, hogy a működését gátolni lehessen. Stressz hiányában a p53 aktivitását a sejt úgy szabályozza, hogy gátolja a sejtmaghoz való szállítását, és serkenti az exportját a magból. Stressz hatására ezzel szemben aktiválódik a p53 sejtmag felé irányuló szállítása, miközben az onnan történő eliminációja csökken. Ennek eredményeként a molekula felhalmozódik a magban, és kifejtheti a hatását. (41) A p53 sejtfunkcióban betöltött szerepe A p53 fehérje jelenléte nem szükséges normális fejlődés esetén, de DNS-károsodás, vagy a sejtet érő stressz a p53 gyors indukcióját váltja ki, amely többek között a ciklin dependens kinázt gátló p21 fehérje átíródását serkenti. A p21 a G2 fázisban gátolja a sejtciklust. DNS károsodás után a sejt csak akkor marad G2 fázisban, ha a p53 jelen van a sejtben és aktiválni képes a p21 transzkripcióját. (42) Mind a p53, mind a p21 gén esszenciális a G2 ellenőrző- 19

20 pont fenntartásában. Segítségükkel a károsodott DNS-szakaszt a sejt még osztódás előtt kijavíthatja. A p53 elvesztése miatt lehetetlenné válik a sejtciklus megállítása, amely növeli a mutációs gyakoriságot, és a sejt genomjának instabilitásához vezet. (39) A sejtciklus megszakításán kívül a p53 DNS-sérülés hatására apoptosist is elindíthat. Ez a mechanizmus eltávolítja a károsodott DNS tartalmú sejteket, megakadályozva ezzel kóros sejtosztódás kialakulását. Azok a sejtek, amelyekből a p53 hiányzik, DNS-károsodás esetén nem képesek apoptózisra. A p53 elvesztése a valószínűleg más hatásokra (pl.: növekedési faktor megvonás hatására) beinduló apoptózist is megakadályozza. (41,43,44) A p53 a redox-rendszerrel kapcsolatban levő gének transzkripciójának indukálásával, reaktív oxigén gyökök képződésének elindításával, valamint mitokondriális komponensek oxidatív degradációjával okozhat apoptosist. (39) A p53 citoszólban való elhelyezkedése szükséges az apoptosis elindításához. Bizonyos fehérjék hiányában a p53 aktiválja a proapoptotikus BAX fehérjét, és ezáltal a mitokondriumok membránja átjárhatóvá válik, és elindulhat az apoptosis. (45) A p53 képes közvetlenül is fokozni a külső mitokondriális membrán permeabilitását. Komplexet képez a védő szerepű BCL-XL és BCL2 fehérjékkel, ezáltal citokróm C felszabadulás következik be. (46) A sejtet érő stressz hatására a p53 fehérje összekapcsolódik a BAK fehérjével. Az interakció során a BAK fehérje oligomerizálódik és citokróm C szabadul fel a mitokondriumokból. A p53-bak komplexek kialakulása azzal jár, hogy gyengül a kapcsolat a BAK és az MCL1 antiapoptotikus fehérje között. Valószínű, hogy a p53-nak és az MCL1-nek a BAK aktivitás befolyásolásán keresztül ellentétes hatása van a mitokondriális apoptózisra. (47) A p53 jelátviteli útvonal sematikus vázlata a 3. ábrán látható. 20

21 3. ábra: A p53 jelátviteli út Genotoxikus ártalamak (pl.: irradiáció) p53 aktiváción keresztül fokozzák a p21 CIP 1 transzkripciót, ami gátolja a ciklin-függő kinázokat (CDK), és ezáltal a retinoblastoma fehérje (prb) foszforilációja csökken. A hipofoszforilált retinoblastoma fehérjéről így nem szabadul fel az E2F transzkripciós faktor, és a sejtciklus G1-S átmenete gátlódik. A p53 néhány intracelluláris hatását gátolhatja a c-myc, Bcl-2 vagy E2F alulszabályozott génexpressziója. A p53 aktivitás egy autoreguláló hurkon keresztül is szabályozott. Ennek kulcseleme az Mdm2 (mouse double mimic 2) gén, és terméke, a p53 egyik legfontosabb negatív szabályozó fehérjéje. Ez a p53 fehérjéhez kötődve elősegíti annak ubikvitinációs lebontását, és így gátolja a p53-indukálta sejtciklus leállást, valamint az apoptosist. (48,49,50) A p53 inaktivációja elősegíti a tumorképződést. A p53 allél egyikének vagy mindkettőnek a deléciója csökkent tetramerképződést eredményez, és ez a növekedést gátló gének expresszióját csökkenti. Ritka mechanizmusról van szó, alkalmanként bizonyos tumorokban kimutatható folyamat. Nonsense vagy hasítási oldali mutációk trunkált, csonka p53 fehérje képződéséhez, és így az oligomerizáció csökkenéséhez vezethetnek. Főként a tüdő és a nyelőcső rákjaiban van jelen ez a folyamat. Hasonlóképpen, missense mutáiók a funkcionálisan aktív tetramerek számának csökkenéséhez vezetnek. Agy-, tüdő-, hólyag-, mell-, bőr-, és vastagbélrákokban írták le ezt a mechanizmust. Méhnyakrákban jellemző az a 21

22 folyamat, amelyben a humán papilloma vírus E6 génjének expressziója funkcionálisan inaktiválja a p53-at (hozzákötődik és gyorsítja a lebontását). Az MDM2 (mouse double mimic 2) negatív szabályozó fehérje génjében bekövetkező változások is a p53 működésének zavarát okozhatják. (40) A p53 expresszió immunhisztokémiai vizsgálata A p53 fehérjének két típusa létezik. Normális körülmények között a vad típusú fehérje található meg a sejtben. Ez a fehérje tumor-szuppresszor hatással rendelkezik, azaz képes ellátni az eredeti funkcióját. Ha a p53 génben károsodás következik be, a képződő mutáns fehérje nem képes az eredeti feladatát ellátni. A kezdetben kialakított p53 ellenes antitestek mind a vad, mind a mutáns típusú fehérje kimutatására alkalmasak voltak (pl: DO-7 klón). Specifikusan a mutáns fehérje kimutatására alkalmas antitesteket az utóbbi néhány évben kezdtek el forgalmazni (pl: PaB240). Sajnos ezek az antitestek sem 100%-osan specifikusak a mutáns fehérjére, keresztkötnek a vad típusú p53 epitópjaival is Növekedési faktor receptorok Epitheliális növekedési faktor receptor Az epitheliális növekedési faktor receptor családnak négy tagja ismert. Ezek az EGFR-1 (HER-1), a HER-2 (neu; c-erb B2), a HER-3 (c-erb B3) és a HER-4 (c-erb B4). A receptoroknak 3 fő része: egy extracellularis ligandkötő-, egy transzmembrán lipofil-, és egy citoplazmatikus tirozin-kináz domainje van. Ligandjai az epidermális növekedési faktor (EGF) és a transzformáló növekedési faktor (TGF)-α. (51) Ligandkötés hatására a receptor dimerizálódik, és ez intrinszik tirozin kináz aktivációt, autofoszforilációt eredményez. Ezután intracelluláris kapcsoló fehérjék aktivációja révén a fő jelátviteli útvonalak aktivációja következik be (mitogén-aktivált protein kináz, MAPK, foszfoinozitol 3-kináz, PI3-K stb.). (52,53) Az EGFR-1 expresszió változása fekélyképződéshez, valamint daganatok kialakulásához vezethet. Colorectalis rákban (CRC) az expressziója fokozott. (54) Gyulladásos bélbetegségekben, valamint colorectalis rákban a többi EGF receptornak a szerepe nem tisztázott. A receptorok aktivációja különböző intracelluláris stimulust okoz (fokozódó DNS szintézis, metabolikus és motilitási változások). A receptor aktiváció 22

23 sejtproliferációt és tumornövekedést eredményez ráksejt-vonalakon. Jelenlegi ismereteink szerint egyik EGFR altípus sem mutat IBD vagy CRC specificitást. (55,56) Az α- és β-típusú transzformáló növekedési faktor (TGF-α és -β) különböző módon szabályozza a bélhámsejtek osztódását és pusztulását. A TGF-α stimulálja a sejtproliferációt, a TGF-β pedig hatékonyan gátolja a sejtciklust. Ez utóbbi konstitutívan expresszálódik a cryptában, és hatása felülmúlja a TGF-α hatását. Ez arra utal, hogy a bélnyálkahártya remodeling folyamatait részben a TGF-β gátló aktivitása szabályozza. (7,57) Az EGF-EGFR jelátviteli útvonal sematikus vázlata a 4. ábrán látható. 4. ábra: Az EGFR rendszer működése EGF-EGFR keresztkötés hatására az EGFR homo- vagy heterodimereket alkot más EGFR családba tartozó receptor tirozin kinázokkal. Minden dimerizált receptor komplex meghatározott jelátviteli utat indít el, Src homológ 2 (SH2)-tartalmú végrehajtó fehérjék aktiválásán keresztül. A dimerizáció egy belső eseménysort elindító autofoszforilációt eredményez, és kialakul a megfelelő sejtválasz (sejtosztódás, apoptosis). Az aktivált EGFR dimerek a Grb adaptor fehérjével hozzákapcsolódnak az SOS guanin nukleotid felszabadító faktorhoz. A Grb-SOS komplex közvetlenül a receptor foszfotirozinjához, valamint Shc fehérjén keresztül is képes a receptrohoz kapcsolódni. Ez a fehérje interakció elősegíti az SOS 23

24 közvetítette Ras aktivációt, ami azonnal aktiválja az ERK és JNK jelátviteli utakat. Ezek hatására transzkripciós faktorok (c-fos, AP-1, Elk-1) aktiválódnak, amelyek fokozzák a génexpressziót és a sejtproliferációt. (58,59,60,61) EGFR fehérje expresszió vizsgálata A károsodott bélhám regenerációjára az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) sűrűségéből is következtethetünk. Anti-EGFR antitest alkalmazásával következtetni lehet a nyálkahártya proliferációs aktivitására. (7) es típusú inzulin-szerű növekedési faktor receptor Az I-es típusú inzulinszerű növekedési faktor receptor (IGF1R) az inzulin receptor tirozin kináz család tagja, 21 exont tartalmaz, és körülbelül 100 kb hosszúságú. (62) A promóter régiójának 5 -, nem kódoló vége GC-gazdag, számos potenciális SP1 (transzkripciós faktor), AP2 (transzkripciós faktor, activating enhancer-binding protein 2) és pajzsmirigy válasz kötőelemet tartalmaz. (63) Az IGF1R kiemelkedő jelentőségű transzformációs folyamatokban. Expressziója jelentősen fokozott a legtöbb daganatos szövetben, ahol anti-apoptotikus faktorként elősegíti a sejtek túlélését. A mutáns p53 fehérje IGF1R promóter aktivitást serkentő, a vad típusú fehérje pedig gátló hatású. A p53-nak az IGF1R-rel való kölcsönhatása az alaptranszkripciós szintet befolyásolja a sejtekben. Mivel az IGF1R központi szerepet játszik a sejtciklus folymatában és a transzformációban, a mutáns p53 okozta derepresszió a tumorigenezisben fontos lépést jelent. (64) Az IGF1R egyik legfontosabb ligandja az I-es típusú inzulinszerű növekedési faktor (IGF-1). A proinzulinnal homológiát mutató fehérje 70 aminosavból áll, és 7.6 kda molekulatömegű. Három diszulfid-híd kapcsolja össze a polipeptid láncot. (65) A keringésben IGF-kötő fehérjék szállítják, amelyek egyben a féléletidejét is megnövelik. (66) Legfőbb forrása a máj. Az exogén eredetű IGF-1-nek alapvetően négy fő hatása van: serkenti a sejtosztódást, elősegíti a sejtek túlélését, elősegíti a sejtek növekedését, és metabolikus hatásai vannak. (67) Az IGF-IGF1R rendszernek szerepe van az alacsony születési súly, az inzulin-rezisztencia, és a 2-es típusú diabetes mellitus kialakulásában. (68) Az IGF1R gén mutációi felelősek lehetnek a pre- és postnatális növekedési zavarokért. (69) Az IGF1 jelátviteli útvonal zavara vagy az IGF1 szérumszintjének csökkenése megnövekedett élettartamot eredményezhet. (70) Az 24

25 IGF1R nélkülözhetetlen a férfi nemiszervek kialakulása és a férfiak szexuális differenciációja során is. (71) A keringő IGF1-nek szerepe van bizonyos kognitív funkciók idősödéssel összefüggő csökkenésében, különösen az információ feldolgozás sebességében. (72) Az IGF1 E-cadherinnel és β-cateninnel történő interakciója ez utóbbi tirozin foszforilációját és stabilizációját okozza colorectalis ráksejtekben. Ez elősegíti a sejtek transzformációját, migrációját és a metastasis képzést. (73) Az IGFR közvetítette jelátviteli útvonal sematikus ábrája az 5. ábrán látható. 5. ábra: Az IGF-IGFR rendszer intracelluláris alkotóelemeinek sematikus ábrája. Az IGFR aktivációja az intracitoplazmatikus domain foszforilációja után a tirozin kináz aktivitás növekedését eredményezi. Inzulin receptor szubsztrát (IRS) fehérjékkel történő kölcsönhatás után a foszfoinozitol 3-kináz (PI3K) a sejtmembrán inozitol-biszfoszfátját (IP2) foszfoinozitol-3-foszfáttá alakítja. Ez foszfoinozitol-függő kináz (PDK) és protein kináz B (PKB) aktivációt okoz. Ezt követően transzkripciós szabályozó mechanizmusok (FOXO: forkhead transzkripciós faktorok), metabolikus folyamatok (GSK3β: glikogén szintáz kináz 3β), az apoptosis folyamata (BAD: bcl-asszociált halál promoter), a sejtnövekedés és a transzláció folymatai (mtor: mammalian target of rapamycin; TSC: tuberous sclerosis gén; eif4e-4e-bp1: eukarióta iniciációs faktor 4 és -kötőfehérjéje; S6K: p70s6k, riboszómális 25

26 fehérje S6 kináz) aktiválódnak. Hasonló receptor-fehérje interakciók segítségével RAS- GTPáz mediált úton sejtosztódás következik be (MAPK: mitogén aktivált fehérje kináz család). A rendszer negatív szabályzó elemei a növekedési faktor receptor kötő fehérje (Grb2), a janus tirozin kináz rendszer (JAK) és a 10-es kromoszómán mutálódott foszfatáz (PTEN) Az IGFR rendszer apoptosis gátló hatása Az IGFR rendszer közvetett úton hatással van az apoptosis folyamatában közreműködő kaszpázokra, ezáltal az apoptosis folyamata ellen hat (6. ábra). 6. ábra: Az IGFR rendszer apoptosist gátló hatása Az IGF1 fehérjékhez kötődve (IGFBPs) vannak jelen a keringésben. A szállító fehérjék juttatják el a receptorhoz. A receptor aktivációja inzulin receptor szubsztrát fehérje interakció révén foszfoinozitol-3-kináz úton Akt aktivációt eredményezve gátolja az iniciátor kaszpázok működését. Ugyanezt a hatást fejti ki az aktivált receptor a Bcl-2/Bcl-XL antiapoptotikus fehérje családok aktivációjával, valamint a proapoptotikus Bax/Bcl-XS hatásainak gátlásával. 26

27 Az iniciátor kaszpázok gátlása β-catenin stabilizációt, valamint a sejtmagban endonukleáz aktivitás csökkenést okoz, elősegítve ezzel a sejt túlélését Hepatocyta eredetű növekedési faktor receptor A c-met proto-onkogén által kódolt hepatocyta eredetű növekedési faktor receptor fehérje egy 50 kda molekulasúlyú α és egy 145 kda-os β alegységből álló, sejtfelszíni heterodimer, amelynek tirozin-kináz aktivitása van. (74,75) A receptorfehérje α-alegysége extracelluláris helyzetű, míg a β-alegységnek egy extracelluláris, egy transzmembrán és egy intracelluláris, tirozin-kináz aktivitással, valamint tirozin-foszforilációs helyekkel rendelkező része van. Szerkezete hasonlóságot mutat a humán inzulin receptor és az ABL onkogén szerkezetéhez. Ligandja a hepatocyta eredetű növekedési faktor (HGF), ami a máj regenerációjában kiemelkedő jelentőségű, parakrin módon ható trophikus faktor. A HGF a HGFR β- alegységéhez kötődik. (76) A HGF fehérje megtalálható a nem-parenchymás májsejtekben, a hasnyálmirigy acinus sejtjeiben, a nyálmirigyek ductalis sejtjeiben, a duodenum Brunner mirigyeinek sejtjeiben, az emésztőtraktus hámsejtjeibena pajzsmirigy perifollicularis sejtjeiben, a csontszövet sejtjeiben és bizonyos neuronokban. (77,78,79,80) A HGF a hámsejtek egyik legerősebb mitogén hatású faktora. C-met-et expresszáló sejteknél fokozza a sejt motilitását, jelentős szerepet játszik az emésztőrendszer sebgyógyulásában. Morfogenetikus hatású: epitheliális tubuláris és mirigy-struktúrák kialakítását szabályozza. A c-met-hez kapcsolódva transzformációs aktivitású. (81) A HGF-c-met rendszernek fontos szerepe van a bélrendszer homeosztázisában. A hámeredetű sejtek invazív növekedése során a HGFR a semaphorin 4D receptor és a plexin B1-gyel kölcsönhatásba lép. Ezek hatására aktiválódik és foszforilálódik. (82) Olyan HGF transzfektált sejtek, amelyek endogén módon C-Met-et expresszálnak, transzformációs aktivitást mutatnak. (81) A c-met többféle rákban, köztük colorectalis rákban is felülexpresszált, és mennyisége növekedik a metasztázisképzés folyamán. A HGF-c-met rendszernek szerepe van a bélrendszer daganatainak kialakulásában. (83,84,85) 3.8. A sejtöregedés A kromoszómák végein található telomérák rövid, ismétlődő, guaninban gazdag /(TTAGGG)n/ tandem repeat szekvenciák, amelyek a sejtosztódások során fokozatosan rövidülnek. Többek között ezek a szakaszok tehetők felelőssé a sejtöregedésért. (86,87) 27

28 Telomeráz reverz transzkriptáz A telomeráz gén egy 1132 aminosavból álló polypeptidet kódol, amelynek a becsült molekulatömege 100 kda. A telomeráz egy olyan ribonukleoprotein, amelyik képes felismerni az egyszálú, guaninban gazdag teloméra végeket, és katabolikus alegységének segítségével (telomeráz reverz transzkriptáz; TERT) RNS templátokat alkalmazva, többszörösen ismétlődő szekvenciákat épít a teloméra 3 -végéhez. Ezzel a telomérák rövidülése ellen hat. A teloméra DNS-ének mennyisége telomeráz által történő kiegészülés nélkül- a sejt hátralévő élettartamát jelzi. A telomérák de novo szintetizálásához is nélkülözhetetlen a telomeráz. A telomeráz által történő kromoszóma repair a törött kromoszómák stabilizálásában is nélkülözhetetlen. Ezáltal az öröklődés stabilitásában fontos szerepe van. A humán sejtek halhatatlanná válásában és a carcinogenezisben is jelentőséggel bír a telomeráz-aktiváció. Normális sejtekben TERT aktivitás csak azokban mérhető, amelyeknek hosszútávú proliferációs aktivitása van. (88) A TERT expresszió a tumorigenezis kezedetén preinvazív változásokkal együtt jelenik meg vastagbél- és emlőszövetekben in vivo. A mennyisége a sejtekben, valamint a TERT-et expresszáló sejtek száma fokozatosan növekedik a progresszió folyamán. A myc protoonkogén egy olyan alapvető transzkripciós faktort kódol, ami a sejtproliferáció és -differenciáció kontrolljában vesz részt. A myc expresszió génamplifikáció, retrovírus inszerció vagy kromoszóma transzlokáció által történő túlszabályozása összefügg a tumorképződéssel. A myc-nek közvetlen hatása van a telomeráz aktivációra. (89) A TERT promóter számos Myc-fehérje kötő helyet tartalmaz, amelyek a TERT transzkripciós aktivitását közvetlenül szabályozzák. Ez jelzi, hogy a sejtproliferáció és a kromoszóma integritás megőrzése között direkt kapcsolat van a normális és a daganatos sejtekben egyaránt. Ez azt is jelenti, hogy a TERT által okozott sejtosztódás nem genoprotektív hatású, mert myc onkogén aktivációval függ össze. (89,90,91) Bár a telomeráz aktiváció önmagában nem felelős a tumorképző fenotípus kialakulásáért, a telomeráz általi genetikai karbantartás in vivo együttműködhet további onkogén hatású mutációkkal a malignusan transzformált klónok létrehozásában. (92) A telomeráz szabályozásának három fő útvonala van. (93) Az egyik az előbb ismertetett Myc útvonal (MAd1/May). A másik a TGF-β transzkripciós célpontjaként ismert SIP1, ami a TERT TGF-β által történő repressziójáért felelős. A harmadik a tumor szuppresszor menin, ami a TERT közvetlen negatív szabályozója. 28

29 es típusú telomeráz asszociált fehérje Az emlősökben található telomeráz funkcionális komplex másik alegysége a telomerázasszociált protein 1 (TP1). Ez a fehérje homológ a Tetrahymena p80 telomeráz fehérjével, és interakcióba lép az emlősökben található telomeráz mrns-sel. (94,95,96,97,98,99,100) 29

30 4.0. CÉLKITŰZÉSEK Vizsgálataimban a vastagbélnyálkahártya barrier funkció megváltozásának hátterében álló sejtkinetikai okokat, valamint a gyulladással összefüggésben lévő, és hosszú távon kóros sejtproliferációhoz vezető, fehérje szinten megnyílvánuló epithelialis eltéréseket kerestem. Célkitűzéseimet az alábbi négy pontban foglaltam össze: 1. A gyulladásos vastagbélbetegségekben tapasztalt nyálkahártya barrier funkció megváltozás fehérjeszinten jelentkező sejtkinetikai okainak leírása. 2. A gyulladásos aktivitás hatásának vizsgálata a vastagbél hámsejtek proliferációját és apoptosisát elsődlegesen és másodlagosan meghatározó tényezőkön. 3. Az egyes sejtkinetikai változások betegség-specificitásának vizsgálata. 4. A hosszú távon fennálló, aktív epizódokkal kísért krónikus gyulladással összefüggésben lévő, és hosszú távon kóros sejt-túléléshez és sejtproliferációhoz vezető, fehérje szinten megnyilvánuló epitheliális eltérések vizsgálata. 30

31 5.0. BETEGEK ÉS ANYAGOK Előzetes felvilágosító és beleegyező nyilatkozat kitöltését követően rutin diagnosztikai célzatú vastagbéltükrözések során hasi fájdalomra, gyakori székelésre, esetenként véres székletre, lázra panaszkodó betegektől vastagbél nyálkahártya biopsziás minták vétele történt a betegség által leginkább érintett vastagbél területekről. Összesen 33 colitis ulcerosás, 26 Crohn-colitises, 30 ún. aspecifikus colitises beteget és 10 egészséges, nem colitises, nem vastagbélrákos egyént vontunk be vizsgálatainkba. 8 colitis ulcerosás és 8 Crohn-colitises betegnél első diagnózisként lett megállapítva a betegség. Fenntartó gyógyszeres kezelésben (aminoszalicilsav-vegyületek) 43 beteg részesült. Az aktuális vizsgálat előtt 3 hónappal kortikoszteroid, antibiotikus, ill. immunszupprimáns szerek adásában egyik beteg sem részesült. Egészséges kontrollként hasi fájdalom miatt vastagbéltükrözésen átesett, sem makroszkópos, sem mikroszkópos eltérést nem mutató, 5 férfi és 5 nőbetegtől származó biopsziás mintákat használtunk. Rectumból származó biopsziás mintát nem vizsgáltam. A vizsgálatba bevont betegek adatait az 1. táblázatban foglaltam össze. Ép, egészséges Colitis ulcerosa Crohncolitis Aspecifikus colitis ESETSZÁM NŐ/FÉRFI ÉLETKOR (ÉV; ÁTLAG) 10 5/5 50%/50% / %/54% / %/35% / %/54% 40.4 BETEGSÉG FENNÁLLÁSÁNAK IDEJE (ÉV; ÁTLAG) BIOPSZIA HELYE (JOBB COLONFÉL/ BAL COLONFÉL) 5-ASA KEZELÉS (ESETSZÁM) 3 HÓNAPON BELÜL EGYÉB KEZELÉS / / / / táblázat: A vizsgáltba bevont egyének adatai Apoptosis, proliferáció, p53 és EGFR kimutatás összesen 345 formalin fixált, paraffinba ágyazott szövettani metszeten történt. További vizsgálataimat összesen 160 (IGF1R, C-met, TERT és TP1) colitis ulcerosás és egészséges mintán végeztem. A minták betegségcsoportonként és vizsgált paraméterenként való megoszlása a 2. táblázatban látható. 31

32 APOPTOSIS PROLIFERÁCIÓ P53 EGFR IGFR C-MET TERT TP1 Normális [10] Colitis Enyhe ulcerosa Mérsékelt [33] Súlyos Crohncolitis Enyhe Mérsékelt [26] Súlyos Aspecifikus Enyhe colitis Mérsékelt [30] Súlyos Összesen táblázat: A vizsgált minták száma betegség csoportonként és technikánként Minden szám önálló szövettani mintát jelent. A szögletes zárójelben lévő szám a vizsgálatba bevont beteg egyének számát jelenti A gyulladás szövettani súlyosságának patológiai megítélése A gyulladás súlyosságának meghatározása az alábbi három fő szempont szerint történt: 1. Az epithelium és a lamina propria mononukleáris sejtes (neutrophiles és eosinophiles) infiltrációjának kiterjedése. Pontértékek: 0-3. A 0 pont a gyulladásos sejtek hiányát jelenti, az pont pedig az enyhe-mérsékelt-súlyos sejtes beszűrődést jelenti. 2. A crypta csavarodás mértéke. Pontértékek: 0-3. A 0 pont egyenes cryptákat jelent, az pont pedig enyhe-mérsékelt-súlyos crypta csavarodást jelent. 3. Az epithelium pusztulásának a súlyossága. Pontértékek: 0-3. A 0 pont folyamatos, sérülés nélküli, egybefüggő hámréteget jelent. Az pont pedig enyhe-mérsékelt-súlyos hámpusztulást és fekélyképződést jelent. A colitis ulcerosára és Crohn-betegségre specifikus szövettani eltérések mellett, mint a crypta tályog vagy a granuloma, ez utóbbi két szempont szintén jellemzi a gyulladásos bélbetegségeket. A pontértékek meghatározása a Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben dolgozó, tapasztalt patológus kolléga véleményén alapult, és a Magyar Gasztroenterológiai Társaság Colon Szekciója által honosított hisztopatológiai irányelvek figyelembevételével történt. (101) 32

33 A gyulladás szöveti aktivitása enyhe volt, ha az epithelium és a lamina propria neutrophiles és eosinophiles beszűrődése elhanyagolható volt, a legtöbb crypta lefutása egyenes volt, és az epithelium folytonossága megőrzött volt. Az összpontszám 2-4 volt. A súlyos fokú gyulladást az epitheliumban és a lamina propriában jelentkező kiterjedt eosinophiles és neutrophiles beszűrődés, súlyos crypta torzulás (csavarodott, kitágult crypták), a cryptasűrűség kiterjedt csökkenése, valamint szakadozott, szétszabdalt epitheliális felszín jellemezte. Az összpontszám 8 vagy 9 volt. A gyulladás közepes fokúnak minősült, ha a két szélső eset közötti állapotot találtunk. Az összpontszám 5-7 volt. Az aspecifikus colitis elnevezés arra utal, hogy a gyulladásos bélbetegségekre jellemző patognomikus szövettani eltérések hiányoztak a colitises mintában. Aspecifikus colitisben a vastagbélhám mirigyeinek szűk a lumene, a crypták egyenes lefutásúak, és cryptatorzulás nem található meg. A gyulladásos folyamat csak a nyálkahártya felső egyharmadát érinti. Aspecifikus colitisben a gyulladásos folyamat nem sorolható be az idült, idiopathiás gyulladásos bélbetegségek csoportjába, amelybe a colitis ulcerosa és a Crohn-colitis tartoznak, mint alcsoport. Az aspecifikus colitist más, specifikus gyulladásos csoportba, mint a mikroszkópos colitis vagy az ischaemiás colitis sem sorolhatjuk, és különbözik az ún. indeterminate colitistől is. Ez utóbbiban sem lehetséges a colitis ulcerosa és a Crohn-colitis között különbséget tenni, de a beteg panaszai, az endoszkópos kép, valamint a szövettani vizsgálat együttesen mégis gyulladásos bélbetegség fennállását igazolják. Az aspecifikus colitises mintákat gyulladásos kontroll csoportként alkalmaztam. 33

34 6.0. MÓDSZEREK A vizsgálataimban alkalmazott technikák kivitelezésénél a gyártó cég ajánlásait vettem alapul, de minden esetben a II. sz. Belgyógyászti Klinika Sejtanalitika Laboratóriumában vastagbél nyálkahártyára specifikusan kidolgozott módszerekről van szó TUNEL reakció A 4μm vastagságú metszeteketből a beágyazásra szolgáló paraffint eltávolítottam (ún. deparaffinálás) (2x5 perc xilol, 2x3 perc abszolút etanol, 2x3 perc 96%-os etanol) és a mintákat rehidráltam (2x5 perc PBS-phosphate buffered saline). Az antigén feltáráshoz ph 6.0-ás citrát pufferbe helyeztem a mintákat, majd 5 percig 750W teljesítménnyel forraltam őket mikrohullámú sütőben. Forralást követően a mintákat szobahőmérsékleten hűtöttem le (kb. 30 perc), majd PBS-be helyeztem őket. Ezután, az antigénfeltárás részeként, nukleáz mentes proteináz K-val (Roche) emésztettem a mintákat 20 percig szobahőmérsékleten. Kétszeri alapos PBS-ben való mosást követően a mintákra 30μl TUNEL higító oldatot (TUNEL Dilution Label, Roche) és 50 μl TUNEL reakció elegyet (5μl 10x TdT enzim oldat, és 45μl dutp oldat, Roche) vittem fel. A mintákat 120 percig inkubáltam 37 C-on, sötétített nedves kamrában. Kétszeri PBS mosás után az endogén peroxidáz aktivitást 30 percig tartó, szobahőmérsékleten zajló 3%-os hidrogén-peroxidos kezeléssel gátoltam. Az aspecifikus kötődés megelőzéséhez szobahőmérsékleten, 10 percig 1%-os borjú szérum albumin (BSA) oldattal kezeltem a mintákat. A felesleges BSA oldatot pipettával eltávolítottam, és a mintákra 50μl peroxidázzal jelölt kapcsoló antitestet (Converter-POD antibody, Roche) vittem fel. 37 C-os, sötétített nedveskamrában 60 percig tartó inkubálást, és alapos PBS-ben való mosást követően 50μl diamino-benzidin (DAB) eleggyel (5μl 10x DAB szubsztrát és 45μl peroxidpuffer, Roche), gyakori fénymikroszkópos ellenőrzés alatt hajtottam végre a jel-előhívást (ún. jelkonverziót). A reakció leállítása után hematoxylines magfestéssel tettem láthatóvá a TUNEL negatív sejtmagokat Proliferációs sejtmagantigén immunhisztokémia A 4μm vastagságú metszeteket a fent említett módszerrel deparaffináltam és rehidráltam. Az antigénfeltáráshoz ph 6.0-ás citrát pufferbe helyeztem a mintákat, majd 3 percig 750W, újabb 3 percig 370W teljesítménnyel forraltam őket mikrohullámú sütőben. Forralást követően a 34

35 mintákat szobahőmérsékleten hűtöttem le (kb. 30 perc), majd PBS-be helyeztem őket. Az endogén peroxidáz aktivitást 30 percig tartó, szobahőmérsékleten zajló 3%-os hidrogénperoxidos kezeléssel gátoltam. Háromszori alapos PBS öblítést követően a mintákat használatra kész, gyárilag optimálisan higított, aspecifikus blokkoló anyaggal ellátott anti- PCNA antitesttel (Klón: PC-10, DAKO) kezeltem, és szobahőmérsékletű nedves kamrában 15 percig inkubáltam. Alapos PBS mosást követően a jelkonverziót LSAB2 (DAKO) rendszerrel hajtottam végre, a használati utasításban leírtak szerint. Röviden: a mintákat 10 percig biotinilált kapcsoló antitesttel inkubáltam szobahőmérsékleten. PBS-ben való kétszeri öblítés után sztreptavidin-hrp oldatot vittem fel a mintákra, és 10 percig inkubáltam őket szobahőmérsékleten. Egy utolsó PBS-ben való mosás után aminoetil-karbazol kromogén szubsztráttal inkubáltam a mintákat 10 percig, szobahőmérsékletű sötétített nedves kamrában. A reakció leállítása után hematoxylines magfestéssel tettem láthatóvá a PCNA negatív sejtmagokat p53 onkoprotein immunhisztokémia A 4μm vastagságú metszeteket a fent említett módszerrel deparaffináltam és rehidráltam. Az antigénfeltárást mikrohullámú sütőben végeztem az alábbiak szerint: ph 6.0-ás citrát puffert tartalmazó zárható műanyag küvettákba helyeztem a mintákat, majd C-ra előmelegített vízfürdőbe helyeztem a küvettákat. 15 percig 500W teljesítménnyel melegítettem a rendszert. Ezzel a módszerrel elkerülhető, hogy a mintákról a hosszú melegítés során elpárologjon a feltáró puffer, és az is, hogy a feltárás hőmérséklete elérje, vagy meghaladja a 100 C-ot, ami a p53 immunhisztokémia esetében az onkoprotein ismételt és irreverzibilis maszkírozásához vezethet. A feltárást követően a mintákat szobahőmérsékleten hűtöttem le (kb. 30 perc), majd PBS-be helyeztem őket. Az endogén peroxidáz aktivitást szobahőmérsékleten 30 percig tartó, 3%-os hidrogén-peroxidos kezeléssel gátoltam. Háromszori alapos PBS öblítést követően a mintákat használatra kész, gyárilag optimálisan higított, aspecifikus blokkoló anyaggal ellátott anti-p53 antitesttel (Klón: DO-7, DAKO) kezeltem, és 37 C-os nedves kamrában 30 percig inkubáltam. Alapos PBS mosást követően a jelkonverziót LSAB2 (DAKO) rendszerrel hajtottam végre, a PCNA immunhisztokémia módszerében leírtak szerint. A jelkonvertáló reakció leállítása után hematoxylines magfestéssel tettem láthatóvá a p53 negatív sejtmagokat. 35

36 6.4. Epitheliáis növekedési faktor receptor immunhisztokémia A 4μm vastagságú metszeteket a fent eírtak alapján deparaffináltam és rehidráltam. Az antigénfeltárást nukleáz mentes proteináz K-val (Roche) történő emésztéssel végeztem, 20 percig, szobahőmérsékleten. Kétszeri alapos PBS-ben való mosást követően az endogén peroxidáz aktivitás gátlását a fentiekhez hasonló módon végeztem 3%-os hidrogén-peroxidos kezeléssel. Az aspecifikus kötődés megelőzéséhez szobahőmérsékleten, 10 percig 1%-os borjú szérum albumin (BSA) oldattal kezeltem a mintákat. Ezt követően hígítási sorozat alapján optimálisan higított anti-egfr kultúra szupernatáns antitesttel (1μl antitest és 40μl PBS, Klón: H-11, DAKO) 60 percig inkubáltam a mintákat 37 C-os nedves kamrában. Háromszori alapos PBS-ben való mosás után a jelkonverziót LSAB2 (DAKO) rendszerrel hajtottam végre, a PCNA immunhisztokémia módszerében leírtak szerint. A jelkonvertáló reakció leállítása után hematoxylines magfestéssel tettem láthatóvá a sejtmagokat Inzulin-szerű növekedési faktor receptor immunhisztokémia A 4μm vastagságú metszeteket az említett módszer szerint deparaffináltam és rehidráltam. Az antigénfeltáráshoz ph 8.0-as 1 mm-os EDTA oldatba helyeztem a mintákat, majd 3 percig 750W, 10 percig 370W teljesítménnyel forraltam őket mikrohullámú sütőben. Forralást követően a mintákat szobahőmérsékleten hűtöttem le (kb. 30 perc), majd PBS-be helyeztem őket. Az endogén peroxidáz aktivitást 30 percig tartó, szobahőmérsékleten zajló 3%-os hidrogén-peroxidos kezeléssel gátoltam. Az aspecifikus kötődés megelőzéséhez szobahőmérsékleten, 10 percig 3%-os borjú szérum albumin (BSA) oldattal kezeltem a mintákat. Ezt követően hígítási sorozat alapján optimálisan higított anti-igf1r monoklonális antitesttel (1μl antitest és 50μl PBS, Klón: 24-31, MAB1120, Chemicon International) 60 percig inkubáltam a mintákat 37 C-os nedves kamrában. Háromszori alapos PBS-ben való mosás után a jelkonverziót LSAB2 (DAKO) rendszerrel hajtottam végre, a PCNA immunhisztokémia módszerében leírtak szerint. A jelkonvertáló reakció leállítása után hematoxylines magfestéssel tettem láthatóvá a sejtmagokat Hepatocyta eredetű növekedési faktor receptor immunhisztokémia A 4μm vastagságú metszeteket az ismertett módszerrel deparaffináltam és rehidráltam. Az antigénfeltárást nukleáz mentes proteináz K-val (Roche) történő emésztéssel végeztem, 20 36

37 percig szobahőmérsékleten. Kétszeri alapos PBS-ben való mosást követően az endogén peroxidáz aktivitást 3%-os hidrogén-peroxidos kezeléssel gátoltam, a fentiek szerint. Az aspecifikus kötődés megelőzéséhez szobahőmérsékleten, 10 percig 3%-os borjú szérum albumin (BSA) oldattal kezeltem a mintákat. Ezt követően higítási sorozat alapján optimálisan higított anti-met kultúra szupernatáns antitesttel (1μl antitest és 100μl PBS, Klón: C-12; sc-10, Santa Cruz Biotechnology Inc.) 60 percig inkubáltam a mintákat 37 C-os nedves kamrában. Háromszori alapos PBS-ben való mosás után a jelkonverziót LSAB2 (DAKO) rendszerrel hajtottam végre, a PCNA immunhisztokémia módszerében leírtak szerint. A jelkonvertáló reakció leállítása után hematoxylines magfestéssel tettem láthatóvá a sejtmagokat TERT immunhisztokémia A 4μm vastagságú metszeteket deparaffináltam és rehidráltam az említett módszer szerint. Az antigénfeltárást nukleáz mentes proteináz K-val (Roche) történő emésztéssel végeztem, 15 percig, szobahőmérsékleten. Kétszeri alapos PBS-ben való mosást követően az endogén peroxidáz aktivitást szobahőmérsékleten, 20 percig tartó 3%-os hidrogén-peroxidos kezeléssel gátoltam. Az aspecifikus kötődés megelőzéséhez szobahőmérsékleten 10 percig 3%-os borjú szérum albumin (BSA) oldattal kezeltem a mintákat. Ezt követően higítási sorozat alapján optimálisan higított (1:80) anti-tert nyúl polyklonális antitesttel (Klón: H-231; sc-7212, Santa Cruz Biotechnology Inc.) 60 percig inkubáltam a mintákat 37 C-os nedves kamrában. Háromszori alapos PBS-ben való mosás után a jelkonverziót LSAB2 (DAKO) rendszerrel hajtottam végre, a PCNA immunhisztokémia módszerében leírtak szerint. A jelkonvertáló reakció leállítása után hematoxylines magfestéssel tettem láthatóvá a sejtmagokat TP-1 immunhisztokémia A 4μm vastagságú metszeteket deparaffináltam és rehidráltam az említett módszer szerint. Az antigénfeltárást nukleáz mentes proteináz K-val (Roche) történő emésztéssel végeztem, 20 percig, szobahőmérsékleten. Kétszeri alapos PBS-ben való mosást követően az endogén peroxidáz aktivitást szobahőmérsékleten 25 percig tartó 3%-os hidrogén-peroxidos kezeléssel gátoltam. Az aspecifikus kötődés megelőzéséhez szobahőmérsékleten, 10 percig 3%-os borjú szérum albumin (BSA) oldattal kezeltem a mintákat. Ezt követően higítási sorozat alapján optimálisan higított (1:100) anti-tp1 nyúl polyklonális antitesttel (Klón: H-300; sc-13052, 37

38 Santa Cruz Biotechnology Inc.) 60 percig inkubáltam a mintákat 37 C-os nedves kamrában. Háromszori alapos PBS-ben való mosás után a jelkonverziót LSAB2 (DAKO) rendszerrel hajtottam végre, a PCNA immunhisztokémia módszerében leírtak szerint. A jelkonvertáló reakció leállítása után hematoxylines magfestéssel tettem láthatóvá a sejtmagokat Többszörös immunfluoreszcens jelölés 16 friss fagyasztott szöveti mintából (8 súlyosan gyulladt colitis ulcerosa, 8 súlyosan gyulladt Crohn-colitis) 5μm vastag metszetet készítettem, és -20 C-on 10 percig 70%-os etanolban fixáltam őket. PBS-ben történő rehidrációt követően 1%-os BSA oldattal gátoltam az aspecifikus kötőhelyeket (10perc, szobahőmérséklet). Ezt követően a mintákat 1:40 arányban PBS-sel higított anti-egfr antitesttel (ld: EGFR IHC) inkubáltam 37 C-on 60 percig. Háromszori alapos PBS-ben való mosást követően 1:100 arányban PBS-ben higított, kecskéből származó, biotinilált anti-egér IgG-vel (Jackson Immuno Research Laboratories Inc.), majd ismételt mosást követően 1:100 arányban PBS-ben higított, Texas Red Streptavidin antitesttel (Jackson Immuno Research Laboratories Inc.) inkubáltam őket 37 Con percig. Ezt követően 1 colitis ulcerosás és 1 Crohn-colitises mintát 1:5 arányban higított anti-cd45 leukocyta közös antigén kultúra szupernatáns antitesttel (Klón: T 29/33, DAKO), 2-2 mintát használatra kész, gyárilag optimálisan hígított anti-cd68 (macrophag) antitesttel (Klón: PG- M1, DAKO), 5-5 mintát pedig 50x-es higítású anti-humán CD83 (dentritikus sejt) kultúra szupernatáns antitesttel (Klón: HB15A, Serotec) inkubáltam (37 C, 60 perc). Háromszori PBS-ben történő mosást követően minden mintára 100x-os higítású FITC-jelölt anti-egér IgG antitestet (Sigma-Aldrich) vittem fel (30 perc, 37 C). Két PBS-ben történő mosást követően a fluorescens jelek elhalványulását megakadályozó VectaShield (Vector Laboratories Inc.) fedőanyaggal fedtem le a mintákat. Minden inkubálást sötétített nedves kamrában végeztem Kiértékelés Kiértékelésre azok a biopsziás szövettani minták kerültek, ahol kellő számú nyálkahártya mirigyet találtam. A statisztikai elemezhetőség érdekében mintánként legalább 500, átlagosan 800 crypta hámsejtet vizsgáltam meg. A crypták luminális nyílásától a crypták bázisáig vizsgáltam a sejteket, mivel ezek mutatják a hámsejtek érésének fokozatait lépésről-lépésre. (9) Azokat a 38

39 mintákat, amelyeknél tangenciális síkban történt a szövettani metszés, vagy 500-nál kevesebb crypta hámsejtet tartalmaztak kizártam a vizsgálatból. Azokat a sejtmagokat vettem pozitívnak TUNEL reakció esetén, amelyek a sejtmag teljes átmérőjében (mikrométer csavar állítása) fekete színreakciót mutattak. PCNA, p53 immunhisztokémiák esetében a pozitív reakció a teljes sejtmagot érintő, legalább közepes vagy annál erősebb intenzitású barnás-vörös színreakciót jelentett. A p53 immunhisztokémiánál a magi pozitivitással együtt jelentkező perinukleáris reakciót szintén pozitívnak számítottam. EGFR, IGFR, C-met, TERT és TP1 immunhisztokémiák esetében a hámsejtek basalis diffúz, basolateralis, ill, diffúz citoplazmatikus reakcióit vettem pozitívnak Statisztikai elemzés A kapott számadatokból egy-utas variancia-analízist, LSD-tesztet és korreláció-elemzést végeztem Statistica for Windows 4.3 programcsomag segítségével. Statisztikai szignifikancia fennállását p<0.05 esetén mondtam ki. Statisztikailag szignifikáns korrelációt p<0.05 esetén állapítottam meg. 39

40 7.0. EREDMÉNYEK 7.1. TUNEL pozitivitás Egészséges vastagbélhámban a TUNEL-pozitivitás a crypták felső 1/3 részére lokalizálódott (7/A. ábra) Gyulladás esetén a crypták mélyebb részeiben, az alsó 2/3-ban is voltak TUNEL pozitív sejtmagok (7/B. és 7/C. ábra). Súlyos gyulladásban a crypták bázisánál is találtam TUNEL pozitív hámsejt magokat (7/D. és 7/E. ábra). Erősen szignifikáns különbségeket találtam enyhe, mérsékelt és súlyos gyulladások között (p<0.0001). Enyhe gyulladás és ép minták között nem volt szignifikáns különbség. A vizsgált gyulladásos csoportok mindegyikében hasonló TUNEL-pozitivitási karakterisztikát találtam (11. ábra és 3. táblázat). 7. ábra: Apoptosis vizsgálata egészséges és gyulladásos vastagbél nyálkahártyán A: TUNEL pozitív sejtmagok ép colon cryptákban (200x nagyítás); B: enyhe colitis ulcerosa (200x nagyítás); C: mérsékelten aktív Crohn-colitises crypták (400x nagyítás); D: súlyosan 40

41 aktív colitis ulcerosa (200x nagyítás); E: súlyosan aktív Crohn-colitis (200x nagyítás). A barnás-fekete sejtmagok (nyilak) TUNEL-pozitívak (TUNEL-diamino-benzidin, hematoxylin) PCNA expresszió Egészséges mintákban a PCNA pozitív hámsejtek a crypták alsó 1/3 részében helyezkedtek el (8/A. ábra). Ahogy a gyulladásos folyamat előre haladt, a PCNA pozitív hámsejtek száma úgy emelkedett a crypták középső és felső harmadában (8/B. és 8/C. ábra). Szignifikáns különbséget találtam azonos betegségcsoporton belül az enyhe, a mérsékelt és a súlyos gyulladási fokozatok között (p<0.05). Az egészséges mintákhoz képest minden gyulladásos csoport szignifikánsan nagyobb PCNA kötést mutatott (p<0.001). A vizsgált betegségcsoportok mindegyikében hasonló PCNA-kötési karakterisztikát találtam (11. ábra és 3. táblázat). 41

42 8. ábra: PCNA expresszió egészséges és gyulladásos vastagbélhámban A: Ép vastagbélhámban (200x nagyítás); B: Enyhe Crohn-colitis (200x nagyítás); C: Súlyos aktivitású Crohn-colitis (100x nagyítás). A barna sejtmagok (nyilak) PCNA pozitívak (PCNA-biotin-streptavidin-amino-etil-karbazol) p53 expresszió Egészséges mintákban nagy p53 hámsejt pozitivitást találtam (42.12±3.62%; 9/A. ábra). A p53-pozitív hámsejtek a crypták alsó 2/3-ában helyezkedtek el, és egyenletes, erős magi jelölést mutattak. Gyulladás esetén a p53-pozitív sejtek a crypták felső részeiben is előfordultak, és az egészséges mintákhoz hasonló jelölés mellett egyes sejtekben perinukleáris festődést is találtam. Néhány súlyosan gyulladt colitis ulcerosás minta subepithel rétegében p53 pozitív mononukleáris sejtet tartalmazó lymphoid aggregátumot találtam (9/B. és 9/C. ábrák). Crohn-colitises mintákban és egészséges mintákban nem találtam hasonlót. A p53 kötési index minden gyulladásos csoportban szignifikánsan magasabb volt az egészséges mintákhoz viszonyítva (p<0.05). Enyhe, mérsékelt és súlyos gyulladások között szignifikáns különbséget (p<0.05) csak colitis ulcerosás mintákban találtam (11. ábra és 3. táblázat). 42

43 9. ábra: p53 expresszió egészséges és gyulladásos vastagbélhámban A: Ép vastagbél crypta (200x nagyítás); B: Súlyos aktivitású colitises minta (100x nagyítás). A fehér nyíl egy p53 pozitív sejteket tartalmazó lymphoid folliculust jelöl; C: Súlyosan gyulladt colitis ulcerosában (200x nagyítás). A sötétbarna sejtmagok (nyilak) p53 pozitívak. A p53 pozitív sejtek száma a vastagbél cryptákban és a lamina propriában is megnövekedett (p53-biotin-streptavidin-amino-etil-karbazol, hematoxylin) EGFR expresszió Egészséges mintákban basolateralis ill. diffúz basalis EGFR pozitivitást mutató hámsejteket találtam a crypták felső 2/3 részében, és a hámréteg luminális felszínén. Gyulladásos mintákban az EGFR pozitív hámsejtek aránya a gyulladás súlyosságának növekedésével párhuzamosan csökkent. A hámsejtek diffúz EGFR pozitivitást mutattak. Súlyos gyulladásban a cryptákban nem találtam EGFR pozitív sejtet (10/B. és 10/C. ábra). Az EGFR kötési indexek minden gyulladásos csoportban erősen szignifikánsan alacsonyabbak voltak ép mintákhoz hasonlítva (p<0.005). Ahogy a gyulladás súlyossága 43

44 fokozódott, az EGFR expressziója szignifikánsan csökkent a gyulladásos csoportokban, kivéve a súlyos Crohn-colitis és aspecifikus colitis eseteket. Enyhe colitis ulcerosában az EGFR expresszió csökkenése szignifikánsan alacsonyabb volt az enyhe Crohn-colitisben ill. aspecifikus colitisben észleltnél (11. ábra és 3. táblázat). Mérsékelt és súlyos gyulladásos esetekben számos, diffúz citoplazmatikus EGFR pozitivitást mutató mononukleáris sejtet (plazmasejtek és leukocyták) találtam az epitheliumhoz közel eső lamina propriában (10/A. ábra). Multifluorescens immunhisztokémiai vizsgálattal ezek a sejtek EGFR/CD45 dupla pozitivitást mutattak, de sem CD68 makrofág, sem CD83 dendritikus sejt marker pozitivitást (antigén prezentáló sejt eredet) nem találtam rajtuk (10/C. ábra). 10. ábra: EGFR expresszió gyulladásos vastagbélhámban A: EGFR expresszió mérsékelt colitis ulcerosában. A vastagbél mirigyen belül bazális diffúz citoplazmatikus jelölés látható (fehér nyíl). Számos diffúz EGFR pozitivitást mutató sejt látható a lamina propriában (fekete nyíl; 400x nagyítás). B: EGFR expresszió súlyos aktivitású colitis ulcerosában. A mirigyeken belül nem látni pozitivitást, ellenben a lamina 44

45 propriában számos pozitív sejt látható (200x nagyítás; EGFR-biotin-sztreptavidin-amino-etilkarbazol, hematoxylin). C: EGFR (vörös) és CD45 (zöld) expresszió súlyos aktivitású colitisben. Számos EGFR-CD45 dupla pozitív mononuclearis sejt (fehér nyilak) látható a lamina propriában. A fehér csillag egy vastagbél mirigy bazális részét jelzi (200x nagyítás; EGFR-biotin-sztreptavidin-Texas Red, CD45-anti-egér FITC). 0.7 TUNEL-LI 0.75 PCNA-LI p53-li EGFR-LI CSOP ábra: Az egyes kötési index- (LI; labeling index-) karakterisztikák összehasonlítása a három betegségcsoportban (colitis ulcerosa-uc, Crohn-colitis-CD, aspecifikus colitis- AC) vizsgált paraméterek esetén (Box & Whisker plotok) Az x-tengelyen lévő számok az egyes betegségcsoportokat jelölik: 1.: ép vastagbélhám; 2.: enyhén aktív UC; 3.: mérsékelten aktív UC; 4.: súlyosan aktív UC; 5.: enyhén aktív CD; 6.: mérsékleten aktív CD; 7.: súlyosan aktív CD; 8.: enyhén aktív AC; 9.: mérsékelten aktív AC; 10.: súlyosan aktív AC. Az y-tengelyen lévő számok (x100) a pozitív sejtek százalékos arányát mutatják. A boxok az átlagot, a kapcsok ±1.96 x standard deviációkat jelzik. 45

46 APO-LI PCNA-LI P53-LI EGFR-LI Ép, egészséges ± 1.82% ± 3.63% ± 3.62% ± 8.78% Colitis Enyhe ± 1.02% ± 6.26% 1, ± 4.74% 1, ± 3.87% 1,4,5 ulcerosa Mérs ± 2.09% 1,2, ± 2.68% 1,2, ± 3.89% 1,2, ± 2.86% 1 Súlyos ± 3.02% 1,3, ± 3.93% 1,3, ± 7.82% 1,3, ± 068% 1,4 Crohn-colitis Enyhe ± 2.57% ± 3.02% 1, ± 3.23% ±5.76% 1,2,5 Mérs ± 3.18% 1,2, ± 3.1% 1,2, ± 4.17% ± 2.99% 1,2 Súlyos ± 1.44% 1,3, ± 4.34% 1,3, ± 3.92% ± 4.61% 1,4 Aspecifikus Enyhe 35.1 ± 1.51% ± 4.73% 1, ± 3.39% 1,2, ±5.59% 1,2,5 colitis Mérs ± 1.53% 1,2, ± 2.84% 1,2, ± 3.1% 1, ± 3.79% 1,2 Súlyos ± 1.95% 1,3, ± 4.7% 1,3, ± 4.43% 1,4 3.1 ± 2% 1,4 3. táblázat: Apoptotikus, proliferációs, p53, és EGFR kötési indexek (LI; labeling indices) számszerű eredményei a három betegségcsoportban vizsgált paraméterek esetén. 1: szignifikáns különbségek ép, egészséges mintákhoz hasonlítva (p<0.05) 2: szignifikáns különbségek egy betegségcsoporton belül, enyhe és mérsékelt súlyosságú gyulladásos csoportok között (p<0.05) 3: szignifikáns különbségek egy betegségcsoporton belül, mérsékelt és súlyos fokú gyulladásos csoportok között (p<0.05) 4: szignifikáns különbségek egy betegségcsoporton belül, enyhe és súlyos fokú gyulladásos minták között (p<0.05) 5: az EGFR immunreaktivitásban észlelt szignifikáns különbség enyhe colitis ulcerosa és enyhe Crohn-colitis/aspecifikus colitis között (p<0.05) 7.5. IGFR expresszió Ép, egészséges vastagbélhámban a crypták luminális felszín felé eső felső harmadában találtam mérsékelt intenzitású, basális, diffúz citoplazmatikus epitheliális immunreakciót. A gyulladásos folyamat előrehaladtával az immunreaktív hámsejtek száma, és a hámsejteken belüli jelintenzitás fokozódott: mérsékelt gyulladásban a crypták nagy részére kiteredő, diffúz intracitoplazmatikus jelölést találtam. Súlyos fokú gyulladásban azonban csak a luminális hám néhány sejtje mutatott bazális IGFR pozitivitást, a cryptákban gyakorlatilag elenyésző számú pozitív hámsejtet találtam (12/A., 12/B. és 12/C. ábra). A subepitheliális rétegben csak elvétve jelentek meg immunreaktív sejtek. 46

47 Az IGFR-I expresszió szignifikánsan emelkedett volt enyhe (22.3±9.46%) és mérsékelt (50.2±8.6%) gyulladásban súlyos (6.4±3.66%) gyulladáshoz ill. ép vastagbél nyálkahártyához (7.2±3.15%) (p<0.005) hasonlítva (15. ábra és 4. táblázat). 12. ábra: IGF1R expresszió colitis ulcerosában A: enyhe (fekete nyíl); B: mérsékelt (halványzöld nyilak); C: súlyos gyulladás. (IGF1Rbiotin-streptavidin-amino-etil-karbazol; hematoxylin, 200x nagyítás) 7.6. C-met expresszió Ép, egészséges vastagbélhámban nem találtam lokalizáció specifikus C-met immunreaktivitást. Kevés számú, a crypta teljes egészében, elszórtan elhelyezkedő C-met pozitív hámsejteket találtam. A sejtek intracitoplazmatikus festődése bazalis diffúz és perinukleáris jellegű volt. Hasonló képet találtam mérsékelt és súlyos fokú gyulladásban is. Enyhe gyulladásban azonban nagyobb számban találtam, a cryptákban szintén elszórtan elhelyezkedő, és hasonló intracitoplazmatikus jelölést mutató hámsejteket (13/A. ábra). A subepitheliális rétegben elszórtan, diffúz intracitoplazmatikus reakciót mutató, leukocytoid ill. plazamsejt morfológiájú sejteket, valamint minden esetben C-met pozitív leukocytoid/lymphoid morfológiájú sejteket magas számban tartalmazó folliculusokat találtam, a gyulladás súlyossági fokával párhuzamosan emelkedő számban (13/B. ábra). A C-met expresszió szignifikánsan emelkedett volt enyhe (35.3±22.8%) gyulladásban, mérsékelt (5.8±3.67%), súlyos (5.9±2.33%) gyulladáshoz ill. ép vastagbél nyálkahártyához (0.7±0.9%) (p<0.005) viszonyítva (15. ábra és 4. táblázat). 47

48 13. ábra: C-met/HGFR expresszió colitis ulcerosában A: enyhe gyulladás (fekete nyilak); B: HGFR pozitív sejteket tartalmazó lymphoid aggregátum (fekete nyíl). (HGFR-biotin-streptavidin-amino-etil-karbazol; hematoxylin, A: 200x nagyítás, B: 100x nagyítás) 7.7. TERT és TP1 expresszió A TERT és a TP-1 immunreaktivitás mind számban, mind a cryptán belüli, mind intracelluláris lokalizációban hasonló eloszlást mutatott. Ép vastagbél nyálkahártyában a crypták bázisán találtam egy-egy hámsejtet, melyekben perinukleáris jelölés mutatkozott. Enyhe gyulladásban a crypták alsó felének magasságáig jelentek meg hasonló, perinukleáris és diffúz intracitoplazmatikus jelölést mutató hámsejtek (14/A., 14/B. és 14/C. ábra). Mérséket és súlyos fokú gyulladásban elvétve találtam pozitív immunreakciót mutató hámsejteket, azokat is főként a crypták bazális részein. A TERT és TP1 expresszió szignifikánsan emelkedett volt enyhe gyulladásban (2.1±1.87%/2 ±1.32%), mérsékelt (0.06±0.1%/0.1±0.2%), súlyos (0/0%) gyulladáshoz ill. ép vastagbél nyálkahártyához (1.1±1.4%/0.5±0.9%) (p<0.005) hasonlítva (15. ábra és 4. táblázat). 48

49 14. ábra: TERT és TP 1 expresszió enyhe colitis ulcerosában A: TERT (fekete nyíl, 200x nagyítás); B: TP-1 (fekete nyíl, 200x nagyítás); C: TERT (fekete nyíl, 400x nagyítás). TERT/TP-1-biotin-streptavidin-amino-etil-karbazol-hematoxylin. 15. ábra: IGF1R, C-met, TERT és TP-1 kötési index-karakterisztikák összehasonlítása eltérő súlyosságú colitis ulcerosás és egészséges vastagbélhám mintákban az adott vizsgált paraméterek esetén (Box & Whisker plotok) 49

50 Az x-tengelyen lévő számok az egyes betegségcsoportokat jelölik: 1.: ép vastagbélhám; 2.: enyhén aktív UC; 3.: mérsékelten aktív UC; 4.: súlyosan aktív UC. Az y-tengelyen lévő számok (x100) a pozitív sejtek százalékos arányát mutatják. A kis boxok az átlagot, TERT és TP-1 esetében a nagyobb boxok a medián szórását (± 25%), a kapcsok ±1.96 x standard deviációkat jelzik. Colitis ulcerosa IGF1R C-met TERT TP-1 Ép, egészséges 7.2±3.15% 0.7±0.9% 1.1±1.4% 0.5±0.9% Enyhe 22.3±9.46% 1,2 35.3±22.8% 1 2.1±1.87% 1 2 ±1.32% 1 Mérs. 50.2±8.6% 1,2 5.8±3.67% 0.06±0.1% 0.1±0.2% Súlyos 6.4±3.66% 5.9±2.33% táblázat: IGF1R, C-met, TERT és TP-1 kötési indexek (LI; labeling indices) számszerű eredményei az adott betegségcsoportban vizsgált paraméterek esetén 1: szignifikáns különbségek ép mintákhoz hasonlítva (p<0.05) 2: szignifikáns különbségek egy betegségcsoporton belül, enyhe és mérsékelt súlyosságú gyulladásos csoportok között (p<0.05) 7.8. Korreláció analízis Az epitheliális apoptosisban és proliferációban tapasztalt szoros pozitív korreláció mellett a p53 expresszió erős pozitív, az EGFR expresszió pedig erős negatív korrelációt mutatott a hámsejtproliferációval, és a gyulladás súlyossági fokával (5. táblázat). Egyik vizsgált paraméter esetében sem találtunk szignifikáns eltérést, sem tendenciát a gyógyszeres kezelés és a betegség vastagbélben való lokalizációja között. 50

51 Colitis ulcerosa Crohn-colitis Aspecifikus colitis APO PCNA P53 EGFR APO 0.85* 0.69* -0.65* PCNA 0.76* -0.75* P * APO 0.88* 0.58* -0.61* PCNA 0.72* -.065* P * APO 0.85* 0.66* -0.76* PCNA 0.78* -0.71* P * 5. táblázat: Korrelációs koefficiensek értéke a mindhárom betegségcsoportban vizsgált paraméterek esetén. A *-gal jelölt értékek p<0.05 esetén szignifikánsak. 51

52 8.0. MEGBESZÉLÉS Apoptosis Az apoptosis egyik sajátossága az endonukleolízis során a genomiális DNS feldarabolása, ami alacsony molekulasúlyú dupla szálú, és nagy molekulasúlyú egyszálú DNS-töredékek kialakulásához vezet. Ezek a DNS-töredékek a terminális dezoxinukleotidil transzferáz (Tdt) által történő dezoxi-uridin-trifoszfáttal (dutp) jelölhetők, és ezáltal azonosíthatók (ragadós vég jelölés; nick end labeling; mozaikszóként: TUNEL). Ennek a metodikának az alkalmazásával a sejthalál igen korai fázisában jelölhetővé válnak a pusztuló - főleg az apoptotikus, és kevésbé a nekrotikus - sejtek. Vizsgálataim megerősítették azokat a korábbi megfigyeléseket, miszerint súlyos aktivitású IBD-ben a TUNEL-pozitív crypta epitheliális sejtek száma megnő. (7,9,17,22,24,25,102,103, 104,105,106,107) Iwamoto és mtsai. súlyosan aktív colitis ulcerosában a TUNEL jelölési indexet 9 ± 0.9%-nak, míg a betegség által nem érintett, normális vastagbélnyálkahártyában 6.2 ± 0.7%-nak találták. Vizsgálataimban ennél magasabb TUNEL pozitivitási értékeket találtam. Ez annak köszönhető, hogy formalinban fixált vastagbél biopsziás mintákat használtam. A formalin fixálás aspecifikus DNS töredezést okozhat, és ezáltal növelheti a jelölt sejtek számát. A módszer kétségtelen előnye azonban az, hogy a formalinban történő fixálás pontos és részletgazdag szövettani kiérétkelést tesz lehetővé. Mivel a fixálás okozta háttér mindegyik mintacsoportban egyaránt jelentkezik, az ún. relatív apoptotikus hányadost a háttér standard mintaelőkészítés esetén - nem befolyásolja. Az eddig megjelent tudományos irodalomban ép, egészséges, ép, de beteg, valamint beteg, súlyos gyulladásos aktivitású humán vastagbélhámban vizsgálták csak a sejtpusztulás mértékét, az akut gyulladásos folyamatra, és esetenként a fekélyképződésre koncentrálván. D Argentino és mtsai. patkánykisérletekben 2,4,6-trinitrobenzén szulfonsav (TNBS)- indukálta colitisben vizsgálták a hámsejtek, valamint a lamina propriában lévő T-sejtek a gyulladás aktivitásával párhuzamosan jelentkező apoptózisát. (108) Eredményeik szerint, a gyulladás súlyosbodásával párhuzamosan növekedik az apoptosissal kapcsolatos markerek (FasL, FasR, p53) expressziója a bélhámban. Vizsgálataimban új, eddig a tudományos irodalomban nem közölt megfigyelés, hogy IBD-ben az apoptosis mértéke szorosan összefügg a gyulladás szövettani aktivitásának mértékével, és az egyes betegségekben az apoptosis jelátviteli útjainak zavaraitól függetlenül (értsd: colitis 52

53 ulcerosában dominál a Fas/FasL-, míg Crohn-betegségben a Bcl-2-rendszer zavara), az apoptosis tényét tekintve nem betegségspecifikus tényező. Az apoptosis gyulladással párhuzamosan jelentkező növekedése a gyulladt nyálkahártya sérülékenységét, a fekélyképződésre való hajlamot jelzi. Új megfigyelés az is, hogy a normális vastagbélhámban és enyhe gyulladásban nincs különbség az apoptosis mértékében. Ennek két oka lehet. Az egyik az, hogy nincs igazából ép vastagbélnyálkahártya, mivel a folyamatos extrinszik antigén terhelés a lamina propria folyamatos és enyhe mononuclearis sejtes infiltrációját okozza. A másik ok pedig az lehet, hogy bár az apoptosis zavara az IBD pathogenezisében egy korai eseménynek látszik (22) enyhén gyulladt vastagbélhámban a submucosalis infiltráció apoptosist indukáló eseményeknek kedvez (pl: fokozódó FasL expresszió). Proliferáció A proliferációs sejtmag antigén legnagyobb mennyiségben a sejtciklus S-fázisában szintetizálódik. A fehérje féléletideje óra körül mozog, és ezért néha a posztmitotikus fázisban lévő sejtekben is megtalálható. Ebből a szempontból a Ki-67 antigén ellenes antitest használata proliferációs vizsgálatokra kedvezőbb féléletideje 3 óra körül mozog. Azonban a PCNA expresszióra hatással van a gyulladás (30), továbbá kimutatták, hogy független prognosztikai faktorként alkalmazható colorectalis tumorokban. (109) Ez utóbbi két megfigyelés alapján, valamint figyelembe véve azt a tényt, miszerint a hosszan fennálló gyulladásos bélbetegségekben fokozott a colorectalis carcinoma kialakulásának kockázata (110,37), a PCNA alkalmazása mellett döntöttem. Aktív gyulladásos bélbetegségekben az epitheliális proliferáció megnövekedett. (30,43,111,112,113) Kullmann és mtsai. aktív colitis ulcerosában a felszíni és a bazális hámsejtproliferációs indexet 58.5 ± 14.2% / 73.7 ± 7.1%-nak találták. Noffsinger és mtsai. Crohn-colitis regeneratív fázisában átlagosan 95.1 Ki-67 pozitív crypta epitheliális sejtet találtak mirigyenként. Ez az érték majdnem háromszorosa volt az ép, egészséges nyálkahártyában találtnak (34.1 pozitív sejt cryptánként). Saját vizsgálataimban megnövekedett, a gyulladással szignifikánsan korreláló proliferációs aktivitást találtam enyhén, mérsékelten és súlyosan aktív gyulladásban. Mivel a PCNA-kötési index karakterisztika minden betegség csoportban azonos volt, megállapítható, hogy a hámsejt proliferációban jelentkező eltérések végső soron nem betegség-specifikusak, egyedül a gyulladásos folyamat kiterjedése határozza meg ezen eltérések mértékét. 53

54 Az enyhe gyulladásos állapotok és az egészséges vastagbél nyálkahártya proliferációs hányadosai között szignifikáns eltérést találtam nem így az apoptosis mértékében. Ebből a megfigyelésből arra lehet következtetni, hogy a hámsejt proliferáció zavara előbb alakul ki IBD-ben, mint a hámsejtek apoptosisának zavara. Ha figyelembe vesszük azt a gyakorlati megfigyelést, miszerint a malignus elváltozások megjelenése IBD-s betegekben főként a hosszan fennálló krónikus ill. szövettanilag szintén enyhe gyulladással kisért kiégett fázisban jelentkezik, arra a következtetésre juthatunk, hogy az állandó, enyhén fokozott hámsejt proliferációs aktivitás kedvez a malignusan transzformálódott hámsejt klónok osztódásának. Az aktív fázisban tapasztalható proliferáció fokozódás a vastagbélhám önvédő mechanizmusa lehet, amellyel igyekszik a gyulladás során fokozott apoptosisnak kitett hámsejteket pótolni, és ezzel regeneratív faktorként hat. p53 expresszió Néhány tanulmányban, gyulladásos bélbetegeségekben és colitis-asszociált colorectalis rákban a mutáns p53 fokozott expresszióját találták. (37,38,43,44) A tudományos irodalomban ellentmondásos adatok láttak napvilágot a p53 expresszió vastagbélhámban megfigyelt mértékéről. Egyes nézetek szerint aktív colitis ulcerosában azért nem mutatható ki p53 expresszió, mert a vad típusú fehérje féléletideje rövid, így az hamar lebomlik. (114,115) Más szerzők megnövekedett p53 kötési indexet találtak gyulladt mintákban. Ha ez igaz, akkor a mutáns típusú fehérje fokozott expressziójáról lehet szó, hiszen ennek féléletideje hosszabb, mint a funkcióképes típusé. (37,43,44,116) Sato és Machinami ép, egészséges mintákban 0.4 ± 0.7%-ban, aktív colitis ulcerosában pedig 16.8 ± 9%-ban találtak p53 immunreaktív cryptákat. Crohn-colitisben colitis ulcerosánál alacsonyabb szintű, de a normális vastagbél nyálkahártyánál szignifikánsan magasabb p53 fehérje (DO-7-es klón) expressziót találtak. (37) Saját vizsgálataimban viszonylag magas p53 immunreaktivitást találtan ép vastagbélhámban. Ennek oka az lehet, hogy az alkalmazott DO-7-es klón, bár nagyobb specificitással kötődik a mutáns p53 fehérjéhez, de keresztköt a vad típussal is. Az egyik ok, amiért ezt a klónt alkalmaztam, az a jobb jel/zaj arány volt formalinban fixált, paraffinba ágyazott pozitív és negatív kontroll mintákon. A specifikusabb, mutáns p53 fehérjét felismerő antitestet (PaB240- es klón, DAKO) kipróbálva hasonló mintákon, a jel/zaj arány kedvezőtlenebbnek bizonyult, 54

55 továbbá ez utóbbi mutáns-specifikus antitest specificitása sem 100% denaturált mintákon, ugyanis egyenlő mértékben köt a vad- és a mutáns fehérjéhez. (117,118) Mindezek ismeretében úgy gondolom, hogy ép, egészséges colonban a vad típusú fehérje expresszálódik nagyobb arányban. Eddig sehol nem publikált megfigyelés, hogy colitis ulcerosában szignifikáns pozitív korrelációt mutatott a p53 fehérje expressziója a gyulladás szövettani aktivitásával. Hasonló pozitív korrelációt sem Crohn-colitisben, sem aspecifikus colitisben nem találtam. Ez utóbbi két betegségcsoportban a normálishoz képest magasabb volt a p53 fehérje elleni immunreaktivitás. Figyelembe véve az alkalmazott antitest mutáns típusú fehérjéhez való szelektívebb kötődését, úgy gondolom, hogy gyulladásban ezek a megfigyelések alátámasztják az ismert tényt, miszerint hosszan tartó gyulladásos bélbetegségekben fokozott a colorectalis rák kialakulásának esélye. Yoshida és mtsai. colitis-asszociált colorectalis rákokban a vad- és a mutáns típusú p53 fehérje eloszlásában nem találtak szignifikáns különbséget, sőt annak lehetőségét is felvetették, hogy a colitis-asszociált colorectalis rákok kialakulásában egy p53-tól független útvonal is szerepet játszhat. (119) A p53 fokozott expressziója aktív gyulladásban a vad típusú fehérje expressziójának fokozódását is magába foglalhatja. Ez magyarázatot adhat arra, hogy a gyulladás során kialakuló DNS károsodásra a hámréteg fokozott apoptosissal válaszol. (120) A vad és a mutáns típusú fehérje együttes expressziójának meghatározására természetesen további vizsgálatokra van szükség. Erre alkalmas lehet például lézer-mikrodisszektált vastagbél hámsejtekben elvégzett cdns array vizsgálat, vagy p53 szekvenáló array-k alkalmazása. EGFR expresszió Az epithelialis növekedési faktor és az α-típusú transzformáló növekedési faktor az epithelialis növekedési faktor receptor ligandjai. Az EGFR expresszióban bekövetkező változások a vastagbélhám proliferációs aktivitását tükrözik. (7,55,121) A fokozott receptorligand keresztkötés daganatos elváltozások kialakulásának kedvez. Vastagbél adenocarcinomákban az EGFR expresszió fokozott. (23,56) Az EGFR expresszió mértéke és a vastagbél krónikus gyulladásos folyamatai közti kapcsolat nem teljesen ismert. Hormi és mtsai. aktív Crohn-colitisben mrns szintű TGF-α expressziót találtak, és kimutatták az EGFR jelenlétét is, azonban ez utóbbinál hibás receptoriális funkciót figyeltek meg. (122) 55

56 A gyulladás előrehaladtával fokozatosan növekedő proliferációs aktivitás ellenére a gyulladásos folyamattal negatívan korreláló EGFR immunreaktivitást találtam a vastagbél hámban. Colitis ulcerosában találtam a legszorosabb összefüggést az EGFR pozitivitás csökkenése és a gyulladás súlyossági foka között. A hámregeneráció szempontjából fontos jelátviteli út receptorának expresszió csökkenése elősegíti aktív gyulladásban a vastagbélhám barrier funkciójának felbomlását, és a fekélyképződést. Mivel a hagyományos immunhisztokémiai vizsgálatoknál feltünően sok, a gyulladás aktivitásának növekedésével párhuzamosan növekvő számban, a hámfelszín közelében lokalizálódva megjelenő EGFR pozitív sejtet találtam (plazmasejteket és leukocytákat egyaránt) a lamina propriában, ezért multifluorescens jelölési technikák segítségével megpróbáltam fenotipizálni ezeket a sejteket. A kapott eredmények szerint EGFR/CD45 leukocyta marker dupla pozitív sejtekről van szó, de egyik sem mutatott CD68 makrofág-, ill. CD 83 dendritikus sejt marker pozitivitást. Ez azért meglepő, mert ezek azok a sejttípusok, amelyeknek antigén-prezentáló funkciója van, és így, hogy a plazmasejt morfológiájú sejtekben is megjelent az EGFR, felvetődik annak a lehetősége, hogy a subepitheliális rétegben anti-egfr jellegű autoimmun folymatok zajlanak az aktív gyulladás folyamán. A sejtek további fenotipizálásának szükségét látom (γδ-típusú T-sejtek?), elsősorban annak kiderítésére, hogy mi készteti az immunrendszert az EGFR epitópok megőrzésére, és esetleges immunológiai válasz kialakítására. Az előző négy paraméter vizsgálatából kitűnik, hogy colitis ulcerosa, Crohn-colitis ill. aspecifikus vastagbélgyulladás között a hámsejt apoptosisban és proliferációban végeredményben nincs betegség-specifikus eltérés. Az általam vizsgált, apoptosist és a proliferációt befolyásoló paraméterek colitis ulcerosában mutattak szignifikáns korrelációt a gyulladás szöveti aktivitásával. Ezért az IGFR, C-met, TERT, TP1 expressziót csak colitis ulcerosában vizsgáltam, mivel a három betegségcsoport közül ebben a legmagasabb a malignizálódás kockázata. IGF1R expresszió Az IGF1R gyulladásos bélbetegségekben betöltött szerepét elsősorban Crohnbetegségben jelentkező fibrostenosisban vizsgálták. (123,124) Ezen vizsgálatok szerint aktív Crohn-betegségben a submucosában fokozott számban megjelenő IGF1R pozitív immunsejtek, fibroblaszt-szerű sejtek, és a subserosában talált adipocyták mind hozzájárulnak 56

57 a krónikus gyulladás okozta szűkületek kialakulásához. Az IGFR vastagbél epithelsejtekben betöltött szerepét gyulladásban még nem vizsgálták. Saját vizsgálataimban a gyulladásos folyamattal kezdetben párhuzamosan fokozódó, majd súlyos fokú gyulladásban hirtelen csökkenő IGFR immunreaktivitást találtam. Ennek a regenerációs szignálnak a csökkenése, akárcsak az EGFR esetében, aktív gyulladásban hozzájárulhat a hámréteg barrier funkciójának csökkenéséhez és a fekélyképződéshez. Chakravati és mtsai. eredményei szerint -elsősorban hámeredetű tumorokban- az IGFR az EGFR-t helyettesíteni képes, és azt kikerülő túlélési szignálút első eleme, az IGFR hiányának az ulcerogenesisben betöltött szerepe még erősebbnek bizonyul. (52) C-met expresszió A C-met fehérje (HGFR) gyulladásos bélbetegségekben betöltött kevesen vizsgálták. (125,126,127) Kitamura és mtsai. ép, egészséges vastagbél nyálkahártyából, inaktív és aktív colitis ulcerosából, valamint colitis-asszociált colorectalis rákból (UCACC-ulcerative colitis associated colorectal cancer) származó biopsziás mintákban mrns szinten vizsgálták a HGF és HGFR expressziót. Génexpressziós szinten azt találták, hogy a HGF expresszió aktív colitis ulcerosában, valamint UCACC környezetéből származó mintákban szignifikánsan magasabb volt inaktív colitishez, normális vastagbélnyálkahártyához, ill. magából a tumorból származó mintákhoz képest. A HGFR expressziója fokozott volt a tumoros mintákban, ill. egyes aktív gyulladásból származó mintában is. Saját megfigyeléseim szerint a C-met fehérje expressziója enyhe gyulladásban szignifikánsabban nagyobb mértékű, mint ép, egészséges vastagbél nyálkahártyában, valamint mérsékelt és súlyos fokú gyulladásban. Ez utóbbi két esetben a fehérje hámbeli expresszióját tekintve nem szignifikáns, növekedő tendenciát találtam normális nyálkahártyához hasonlítva. Saját megfigyelésem és Kitamura eredményei közötti különbségre az alábbi magyarázatot látom. A Kitamura által alkalmazott génexpressziós technika nem lokalizáció-specifikus. Kapott eredményeiben nem csak a vastgabélhám, de a lamina propriában található sejtek által expresszált mrns szintek is szerepelnek, összesített módon. Saját vizsgálataimban nem csak a vastagbélhámban, de akárcsak Kitamura- a lamina propriában is találtam C-met fehérje expressziót. Azt is megfigyeltem, hogy a submucosában elhelyezkedő lymphoid aggregátumok, ill. folliculusok igen nagy számban adnak C-met immunreaktivitást. Kitamura eredményeiben ez magyarázat lehet arra, hogy egyes aktív gyulladásos mintákban miért talált fokozott c-met génexpressziót. Ugyanakkor az inaktív gyulladásban tapasztalt csökkent c-met 57

58 expresszióra (ami a hám és a subepithelium c-met expressziójának összege) az lehet a magyarázat, hogy enyhe gyulladásban a lymphoid aggregátumok és a folliculusok száma csökken, és kevesebb számban található C-met pozitív immunsejt is. Így, mégha a hámban fokozott c-met expresszió is van jelen, a subepitheliumban tapasztalt csökkenéssel összesítve a végeredmény nem mutat szignifikáns fokozódást. A Kitamura és mtsai. által a tumoros környezetben tapasztalt HGF-HGFR expresszió fokozódás, valamint Tahara és mtsai. eredménye, miszerint a HGF elősegíti a vastagbél nyálkahártya repairt gyulladást követő regeneratív fázisban, alátámasztják azt a tényt, hogy a HGF-HGFR-rendszer a vastagbélhámban is jelentős mitogén, proliferációs aktivitást növelő hatású. Más irányú vizsgálataimban aktív colitis ulcerosás betegek perifériás vérmintáiból készült mononukleáris sejteket tartalmazó keneteken nagy számban találtam C-met immunreaktív sejteket (16. ábra). A lamina propriában megfigyelt C-met pozitív lymphoid aggregátumok, folliculusok felvetik annak a lehetőségét, hogy ezek a sejtek a keringésből jutnak a subepitheliális rétegbe, ahol regeneratív poolt képeznek a sérült epithelium számára. 16. ábra: C-met pozitív leukocyták súlyos colitis ulcerosás beteg perifériás vérkenetében A: 200x nagyítás, B: 400x nagyítás. (HGFR-biotin-strepatavidin-amino-etil-karbazol, hematoxylin). A fekete nyilak C-met pozitív sejteket jeleznek. Telomeráz expresszió A telomeráz funkciójának változását gyulladásos bélbetegségekben elsősorban a colorectalis rák kialakulásának prognózisában vizsgálták. (88,128,129,130,131,132) Kleideiter és 58