cobas EGFR Mutation Test

Átírás

1 cobas EGFR Mutation Test IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 Tests P/N: cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 Tests P/N: MEGJEGYZÉS: A termék megvásárlása a vevő számára nukleinsav-szekvenciák amplifikálását és kimutatását teszi lehetővé polimeráz láncreakció (PCR) és rokon eljárások révén humán in vitro diagnosztikai célból. A termék megvásárlásával a vevő a konkrét használati jogon túl semmilyen általános szabadalmi jogot vagy egyéb engedélyt nem kap. FELHASZNÁLÁS MÓDJA A cobas EGFR mutáció teszt egy valós idejű PCR-vizsgálat az epidermális növekedési faktor receptor [epidermal growth factor receptor (EGFR)] gén 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exonjában előforduló mutációk kvalitatív kimutatására és azonosítására formalin-fixált, paraffinba ágyazott [formalin-fixed paraffin-embedded (FFPET)] humán nem-kissejtes tüdőrák [non-small cell lung cancer (NSCLC)] tumorszövetből származó DNS-ben. A vizsgálat célja az olyan előrehaladott NSCLCben szenvedő betegek azonosítása, akikben a daganat mutációt hordoz az EGFR gén 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exonjában, és így a betegek kiválasztása az EGFR-t célzó kismolekulájú tirozin-kináz inhibitor (TKI) terápiára. A minta manuális előkészítése a cobas DNS minta-előkészítő készlet segítségével, az automatikus amplifikálás és kimutatás pedig a cobas z 480 analizátor segítségével történik. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA Az EGFR-t kódoló gén aktiváló mutációi elsősorban NSCLC-ben fordulnak elő, és az EGFR fehérje kináz-aktivitásának konstitutív aktiválódását okozzák, és így szerepük van a tumorképződés folyamatában. 1 Ilyen mutációk az NSCLC esetek mintegy 10%-ában fordulnak elő. Ugyanakkor ezek a mutációk leggyakrabban, de nem kizárólagosan ázsiai származású nemdohányzó, illetve könnyű dohányos adenokarcinómát mutató szövettanú nőbetegekben fordulnak elő. 2 Klinikai adatok azt mutatják, hogy az olyan előrehaladott NSCLC tumorban szenvedő betegek, akik aktiváló EGFR mutációt hordoznak (amely leggyakrabban 19-es exon deléció vagy 21-es exon L858R pontmutáció), magas válaszarányt és hosszú progressziómentes túlélést (PFS, progression-free survival) mutatnak mind első, mind másodvonalbeli terápiaként alkalmazott anti-egfr TKI kezelést követően. 3-5 Más, kevésbé gyakori EGFR mutációk, mint pl. a 18-as exon G719X szubsztitúció és a 21-es exon L861Q pontmutáció ugyancsak javítják az anti-egfr kezelésre adott válaszarányt. 6-8 Az anti-egfr TKI kezelésben részesülő EGFR-mutáns NSCLC tumoros betegek átlagos túlélése jelenleg mintegy 2 év. 9 Az aktuális klinikai irányelvek ajánlása szerint előrehaladott EGFR-mutáns NSCLC esetén mérlegelni kell az anti-egfr TKI kezelés, mint első vonalbeli terápia alkalmazását. 10,11 Az EGFR-mutáns NSCLC betegek többségénél az anti-egfr TKI kezelés után előbb-utóbb progresszív betegség alakul ki. Ezeknek a progresszív eseteknek mintegy felében azonosítható az EGFR génben másodlagos rezisztenciamutáció, leggyakrabban a 20-as exon T790M mutáció kialakulása. 12 Néhány betegben ilyen másodlagos rezisztenciamutáció már az anti-egfr TKI kezelés előtt kimutatható a tumorban. Bár ezek a TKI-naív esetek is magas válaszarányt mutatnak a kezelés során, úgy tűnik, hogy az ilyen betegeknek szignifikánsan rövidebb a progressziómentes túlélésük azoknál, akikben a tumor nem tartalmaz ilyen másodlagos mutációt. 6,13 AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A cobas EGFR mutáció teszt két fő lépésből épül fel: (1) manuális minta-előkészítés genom DNS izolálására FFPET-ből; és (2) target DNS PCR-amplifikálása és kimutatása komplementer primerpárok és fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próbák segítségével. A tesztet a következő mutációk kimutatására tervezték: 18-as exon G719X (G719A, G719C és G719S), 19-es exon deléciók és komplex mutációk, 20-as exon S768I, T790M és inzerciók, valamint 21-es exon L858R. A mutációk kimutatása PCR analízissel történik a cobas z 480 analizátor segítségével. A futtatás érvényességét az biztosítja, hogy minden futtatás tartalmaz egy mutáns kontrollt és egy negatív kontrollt. A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található HU 1 Doc Rev. 1.0

2 Minta előkészítése Az FFPE-szövetminták feldolgozása és a genomi DNS izolálása a cobas DNS minta-előkészítő készlet segítségével történik egy üvegszálakhoz való nukleinsav kötődésen alapuló generikus manuális minta-előkészítés révén. Az FFPE-szövetminta egy deparaffinált 5 µm-es metszetét magas hőmérsékleten való inkubálás során lizálják egy proteáz és egy olyan chaotrop lízis/kötő puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett genomi DNS-t a DNázoktól. Ezt követően izopropanol lesz a líziskeverékhez adva, majd egy üvegszálas szűrőbetétes oszlopon az egész lecentrifugálásra kerül. A centrifugálás során a genomi DNS az üvegszálas szűrő felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejt eredetű szennyezések a centrifugálás révén eltávolításra kerülnek. Az adszorbeált nukleinsavak mosása, majd eluálása egy vizes oldattal történik. A genomi DNS mennyiségét spektrofotometriásan határozzák meg, és egy fix koncentrációra állítják be, amelyet aztán az amplifikációs/kimutatási keverékhez kell adni. A target DNS amplifikálását és kimutatását azután a cobas z 480 analizátor végzi el a cobas EGFR mutáció teszt készletben biztosított amplifikálási és kimutatási reagensek segítségével. PCR-amplifikálás A targetszekvencia kiválasztása A cobas EGFR mutáció teszt készlet olyan primereket alkalmaz, amelyek specifikus szekvenciákat határoznak meg az egyes targetmutációkra. A 18-as exon G719X mutációk esetén 104 és 106 bázispár hosszúságú, a 19-es exon deléció mutációk esetén 125 és 141 bázipár hosszúságú, a 20-as exon S768I mutáció esetén 133, a T790M mutáció esetén 118 és a inzerciók esetén 125 és 143 bázispár hosszúságú, a 21-es exon L858R mutáció esetén 138 bázispár hosszúságú a target szekvencia. Az amplifikálás az EGFR génnek csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes EGFR gén nem amplifikálódik. Targetamplifikálás A Thermus species Z05-AS1 DNS polimeráz egy származékát alkalmazza a rendszer a targetamplifikáláshoz. Először a genomi DNS denaturálása és a primer targetszekvenciák felszabadítása végett a PCR reakcióelegyet fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével az upstream és downstream primerek a target DNS-szekvenciákhoz kapcsolódnak. A Z05 DNS-polimeráz kétértékű fémion és feleslegben levő dntp-k jelenlétében a kapcsolódott primer folytatásaként egy második DNS-szálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, létrehozva az EGFR gén target bázispár régióit tartalmazó kettős szálú DNSmásolatot. Ez a folyamat számos cikluson keresztül ismétlődik, és az amplikon DNS mennyisége minden ciklus során megduplázódik. Automatizált valós idejű mutáció kimutatás A cobas EGFR mutáció teszt valós idejű PCR-technológiát alkalmaz. Minden egyes target-specifikus oligonukleotid próba a reakcióban egy jelzőként szolgáló fluoreszcens festékkel van jelölve, valamint egy blokkoló molekulával, amely az érintetlen próbában elnyeli (blokkolja) a jelölő festék fluoreszcens emisszióját. Az amplifikálás minden egyes ciklusa során a komplementer próba az amplikon egyszálú DNS-szekvenciájához kötődik, majd az 5', 3'-nukleáz aktivitású Z05-AS1 DNSpolimeráz hasítja. Amikor a jelzőfestéktől a blokkolót a nukleáz-aktivitás elválasztja, akkor a jelzőfesték a megfelelő spektrumú fénnyel gerjesztve jellemző hullámhosszú fluoreszcens sugárzást bocsát ki, amely mérhető. A targetmutációk jelöléséhez a teszt négy különböző jelzőfestéket alkalmaz. A hat EGFR szekvencia amplifikálásának kimutatása három egymástól független reakcióban történik a négy jellemző hullámhosszon, adott optikai csatornákban való fluoreszcencia mérés révén. Szelektív amplifikálás A mintában található targetnukleinsav szelektív amplifikálását a cobas EGFR mutáció teszt az AmpErase (uracil-nglikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával hajtja végre 15. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja a dezoxiuridin tartalmú DNS-szálak megsemmisítését, a timidint tartalmazó DNS-ét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonokban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a nukleotid-trifoszfátok egyikeként dezoxitimidin-trifoszfát helyett dutp-t használ; tehát csak az amplikonok tartalmaznak dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribózlánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben lúgos ph-n az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a targetamplikont. A cobas EGFR mutáció teszt legalább 10 3 kópia dezoxiuridint tartalmazó EGFR mutáns amplikont inaktivál PCR ciklusonként HU 2 Doc Rev. 1.0

3 REAGENSEK cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 teszt cobas DNS minta-előkészítő készlet (P/N: ) DNA TLB 1 x 10 ml (DNS szövet lízispuffer) trisz-hcl puffer kálium-klorid 0,04% EDTA 0,1% Triton X-100 0,09% nátrium-azid PK 1 x 100 mg (proteináz K) proteináz K (liofilizált) Xn proteináz K Ártalmas DNA PBB (DNS paraffin kötő puffer) trisz-hcl puffer 49,6% guanidin-hidroklorid 0,05% karbamid 17,3% Triton X-100 Xn 49,6% (w/w) guanidin HCl 1 x 10 ml Ártalmas WB I (DNS mosópuffer I) trisz-hcl puffer 64% guanidin-hidroklorid Xn 64% (w/w) guanidin HCl 1 x 25 ml Ártalmas WB II (DNS mosópuffer II) trisz-hcl puffer nátrium-klorid DNA EB (DNS eluáló puffer) trisz-hcl puffer 0,09% nátrium-azid FT (szűrőcsövek kupakkal) CT (gyűjtőcsövek) 1 x 12,5 ml 1 x 6 ml 1 x 25 db 3 x 25 db HU 3 Doc Rev. 1.0

4 cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 teszt (P/N: ) EGFR 2 x 0,4 ml (EGFR master mix 1) trisz puffer kálium-klorid glicerin EDTA Tween 20 3,13% dimetil-szulfoxid 0,09% nátrium-azid < 0,10% dntp-k < 0,01% Z05-AS1 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,01% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) < 0,01% aptamer < 0,01% upstream és downstream EGFR primerek < 0,01% fluoreszcensen jelölt EGFR próbák EGFR 2 x 0,4 ml (EGFR master mix 2) trisz puffer kálium-klorid glicerin EDTA Tween 20 3,13% dimetil-szulfoxid 0,09% nátrium-azid < 0,10% dntp-k < 0,01% Z05-AS1 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,01% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) < 0,01% aptamer < 0,01% upstream és downstream EGFR primerek < 0,01% fluoreszcensen jelölt EGFR próbák EGFR 2 x 0,4 ml (EGFR master mix 3) trisz puffer kálium-klorid glicerin EDTA Tween 20 3,13% dimetil-szulfoxid 0,09% nátrium-azid < 0,10% dntp-k < 0,01% Z05-AS1 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,01% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) < 0,01% aptamer < 0,01% upstream és downstream EGFR primerek < 0,01% fluoreszcensen jelölt EGFR próbák MGAC 6 x 0,2 ml (magnézium-acetát) magnézium-acetát 0,09% nátrium-azid EGFR MC 6 x 0,1 ml (EGFR mutáns kontroll) trisz puffer EDTA poli-ra RNS (szintetikus) 0,05% nátrium-azid < 0,1% plazmid DNS, amely EGFR 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exon szekvenciákat tartalmaz (mikrobiális) < 0,1% EGFR vad típus DNS (sejtkultúra) DNA SD 2 x 3,5 ml (DNS mintaoldószer) trisz-hcl puffer 0,09% nátrium-azid HU 4 Doc Rev. 1.0

5 FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. Ez a teszt kizárólag FFPET NSCLC minták vizsgálatára alkalmas. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. E. Kerülje a reagensek mikrobiális és DNS-kontaminációját. F. A fel nem használt reagensek és hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. G. Lejárati idő után ne használjon fel készletet. H. Ne öntsön össze különböző készletekből vagy gyártási tételekből származó reagenseket. I. Viseljen kesztyűt, és a minták és reagensek kezelése között váltson kesztyűt, hogy megakadályozza a kontaminációt. J. Hogy a master mix (MMX) munkareagens DNS mintával való kontaminálását elkerülje, az amplifikálást és kimutatást elkülönítve kell végezni a DNS-izolálástól. Az amplifikálási és kimutatási munkaterületet alaposan meg kell tisztítani az MMX munkareagens elkészítése előtt. A megfelelő tisztításhoz valamennyi felületet, az állványokat és pipettorokat is beleértve, gondosan le kell törölni 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal, majd 70%-os etanol oldattal. K. A DNA PBB és WB I pufferek guanidin-hidrokloridot tartalmaznak. Ha ilyen puffert tartalmazó folyadék ömlik ki, megfelelő laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel tisztítsa fel. Ha potenciálisan fertőző ágenst tartalmazó folyadék ömlik ki, először laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel, majd 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal tisztítsa meg az érintett területet*. Ha a kiömlés a cobas z 480 analizátorra történik, kövesse a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvének utasításait. *Megjegyzés: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldatnak. L. A mintákat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 és az CLSI Document M29-A3 17 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. M. A DNA TLB és DNA PBB pufferek Triton X-100-at tartalmaznak, amely nyálkahártya-irritáló hatású. Kerülje a szemmel, bőrrel és nyálkahártyával való érintkezést. N. A DNA TLB, DNA EB, MGAC, EGFR, EGFR, EGFR, EGFR MC és DNA SD reagensek nátriumazidot tartalmaznak. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatot önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű hideg vízzel öblítse ki a lefolyót. O. A xilol veszélyes vegyszer, és csak vegyifülke alatt szabad használni. Kiöntése vegyszergyűjtőbe történjen a megfelelő helyi, állami és szövetségi szabályozás szerint. P. Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt minden reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal öblítse le bő vízzel. Ellenkező esetben égető érzés jelentkezhet. A reagenseket kiömlés esetén szárazra törlés előtt hígítsa vízzel. Q. Az egyszer használatos anyagokat csak egyszer szabad felhasználni. Ne használja újra azokat. R. A lejárati idő után ne használjon fel egyszer használatos anyagokat. S. Ne használjon nátrium-hipoklorit oldatot (fehérítőszer) a cobas z 480 analizátor tisztításához. A cobas z 480 analizátort a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvében leírt eljárásoknak megfelelően kell tisztítani. T. A cobas z 480 analizátor fertőzési kockázatának csökkentésére vonatkozó további figyelmeztetések, óvintézkedések és eljárások tekintetében tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét. U. Steril, egyszer használatos pipetták és DNáz mentes pipettorhegyek használata javasolt. TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. A PK reagens kivételével a reagenseket lefagyasztani tilos. B. A DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB, PK, FT és CT reagenseket 15 C és 30 C között tárolja. Felbontást követően a DNA TLB, DNA PBB, WB I, WB II, DNA EB és PK reagensek 8 felhasználásig 90 napon át, illetve a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik. C. Miután a PK enzimet steril, nukleázmentes vízben feloldotta, a fel nem használt PK oldatot tárolja 450 µl-es részletekben -20 C-on. Feloldás után a PK enzimet fel kell használni 90 napon belül, illetve a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. D. Abszolút etanol hozzáadását követően a WB I és WB II puffereket tárolja 15 C és 30 C között. Ezek a munkaoldatok 90 napig vagy a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik HU 5 Doc Rev. 1.0

6 E. Az MGAC, EGFR, EGFR, EGFR, EGFR MC és DNA SD reagenseket tárolja 2 C és 8 C között. Felbontást követően ezek a reagensek 4 felhasználásig 90 napon át, illetve a lejárati dátumig stabilak, amelyik előbb következik. F. Az EGFR, EGFR, EGFR és (az MGAC oldat EGFR vagy EGFR vagy EGFR reagensekhez való hozzáadásával készült) MMX munkareagens fénytől védve tartandó. G. Az MMX munkareagenst tárolja sötétben 2 C és 8 C között. Az előkészített mintákat és kontrollokat az MMX munkareagenshez annak elkészítésétől számított 1 órán belül hozzá kell adni. H. A feldolgozott minták (extrahált DNS) 15 C és 30 C között 7 napig, 2 C és 8 C között 60 napig, -15 C és -20 C között 60 napig stabilak. A feldolgozott minták 3 fagyasztás/olvasztás után is 60 napig stabilak -15 C és -25 C között. I. Az amplifikálást a feldolgozott mintáknak és kontrolloknak az (MGAC oldat EGFR vagy EGFR vagy EGFR reagensekhez való hozzáadásával készült) MMX munkareagenshez való hozzáadását követően 1 órán belül meg kell kezdeni. A KÉSZLET TARTALMA A. cobas DNA Sample Preparation Kit DNA SP 24 teszt cobas DNS minta-előkészítő készlet (P/N: ) DNA TLB (DNS szövet lízispuffer) PK (proteináz K) DNA PBB (DNS paraffin kötő puffer) WB I (DNS mosópuffer I) WB II (DNS mosópuffer II) DNA EB (DNS eluáló puffer) FT (szűrőcsövek kupakkal) CT (gyűjtőcsövek) B. cobas EGFR Mutation Test EGFR 24 teszt (P/N: ) MGAC (magnézium-acetát) (sárga gombos kupak) EGFR (EGFR master mix 1) (fehér gombos kupak) EGFR (EGFR master mix 2) (arany gombos kupak) EGFR (EGFR master mix 3) (kék gombos kupak) EGFR MC (EGFR mutáns kontroll) (piros gombos kupak) DNA SD (DNS mintaoldószer) HU 6 Doc Rev. 1.0

7 SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK xilol (Sigma, kat.# vagy Fisher Scientific, kat.# X5-4 vagy ennek megfelelő) abszolút etanol (Sigma, kat.# E7023 vagy Fisher Scientific, kat.# BP vagy ennek megfelelő) izopropanol (Sigma, kat.# vagy Fisher Scientific, kat.# A451-1 vagy ennek megfelelő) steril víz, nukleázmentes (Applied Biosystems PCR Grade Water, kat.# AM9937 vagy Thermo Scientific Molecular Biology Grade Water, kat.# SH vagy ennek megfelelő) steril, egyszer használatos szerológiai pipetták: 5 és 25 ml cobas 4800 rendszer mikrolemez (AD-lemez) és zárófólia (Roche P/N ) cobas 4800 zárófólia felhelyező (Roche P/N ) állítható pipetták*: (10 µl, 20 µl, 200 µl és 1000 µl kapacitású), aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz mentes hegyekkel pipetta segédeszköz (Drummond P/N: vagy ekvivalens) asztali mikrocentrifuga, x g és x g kapacitású (Eppendorf 5417C vagy ekvivalens)** két (2) száraz fűtőblokk, amely képes a mikrocentrifuga csöveket 56 C és 90 C hőmérsékletre fűteni** 1,5 ml pattintókupakos mikrocentrifuga csövek, steril, RNáz/DNáz-mentes, PCR minőségű (Eppendorf, kat# ) nanodrop UV-Vis spektrofotométer (Thermo Scientific ND-1000 vagy ND-2000)** vortex keverő** mikrocentrifuga csőállványok egyszer használatos kesztyűk, púdermentes kalibrált hőmérők a száraz fűtőblokkokhoz** vízfürdő**, 37 C fenntartására képes egyélű penge vagy hasonló * A pipettákat a gyártó utasításai szerint kell karbantartani, és pontosságuk a megadott térfogathoz képest 3%-on belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta degradálódását és a keresztkontaminációt. ** Valamennyi felszerelést megfelelően karban kell tartani a gyártó utasításai szerint. Műszerezettség és szoftver cobas z 480 analizátor cobas 4800 SR2 rendszervezérlő-egység OSXP képpel cobas 4800 SR2 rendszerszoftver 2.0-s verzió EGFR analízis csomag szoftver 1.0-s verzió vonalkódolvasó ext USB nyomtató HP P2055d A MINTA LEVÉTELE, SZÁLLÍTÁSA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát fertőző ágensek átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. Mintavétel Az NSCLC FFPE-szövetmintákat validálták a cobas EGFR mutáció teszttel való használathoz. B. Mintaszállítás Az NSCLC FFPE-szövetminták 15 C és 30 C között szállíthatóak. Az FFPE-szövetminták szállításának meg kell felelnie a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásnak. 14 C. Mintatárolás Az NSCLC FFPE-szövetminták 15 C és 30 C között 12 hónapig tárolhatóak a szövettani mintavétel időpontja után. Tárgylemezre ragasztott 5 µm-es metszetek 15 C és 30 C között 30 napig tárolhatóak HU 7 Doc Rev. 1.0

8 HASZNÁLATI UTASÍTÁS MEGJEGYZÉS: Csak területenként legalább 10% tumorsejtet tartalmazó 5 µm vastagságú NSCLC FFPEszövetmetszetek használhatóak a cobas EGFR mutáció teszttel. Területenként 10%-nál kevesebb tumort tartalmazó bármely mintából deparaffinálás után makrometszetet kell készíteni. MEGJEGYZÉS: A cobas z 480 analizátorra vonatkozó részletes használati útmutatásért tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét. MEGJEGYZÉS: A mikrocentrifuga csövek melegítésére képes száraz fűtőblokkokat be kell kapcsolni, és 56 C-ra, illetve 90 C-ra állítani. Futtatási mennyiség Egyetlen futtatás 1-30 mintát (plusz kontrollok) tartalmazhat 96 lyukú mikrolemezenként. Ha 24 mintánál többet futtat, akkor több cobas EGFR mutáció teszt készletre lesz szüksége. A cobas EGFR mutáció teszt elegendő reagenst tartalmaz 3 minta (plusz kontrollok) 8 futtatásához, készletenként maximum 24 mintához. Munkafolyamat A cobas EGFR mutáció teszt folyamata két lépésből áll: manuális mintaelőkészítés a cobas DNS minta-előkészítő készlet segítségével, amelyet a cobas z 480 analizátorral végzett amplifikálás/kimutatás követ a cobas EGFR mutáció teszt készlet segítségével. Reagens-előkészítés A. Oldja fel a proteináz K-t (PK) úgy, hogy 4,5 ml steril, nukleázmentes (PCR minőségű) vizet mér a csőbe egy steril, egyszer használatos 5 ml-es szerológiai pipettával. A cső 5 10-szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Mérjen ki 450 µl-es részleteket a PK oldatból 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csövekbe, és tárolja a csöveket -20 C-on. Ha a proteináz K-t már korábban feloldotta és lefagyasztotta, akkor olvasszon fel elegendő mennyiségű csövet a futtatni kívánt minták feldolgozásához még a deparaffinálás előtt (70 µl PK oldat szükséges minden egyes mintához). B. Valamennyi tárolt oldatnak C-on tisztának kell lennie. Ha bármely reagensben csapadék van jelen, melegítse az oldatot 37 C-os vízfürdőben, amíg a csapadék feloldódik. Ne használja, amíg minden csapadék fel nem oldódott. C. Készítsen DNS mosópuffer I (WB I) munkaoldatot úgy, hogy 15 ml abszolút etanolt mér a WB I flakonba. A flakon szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Jegyezze fel a flakon oldalára, hogy etanolt tartalmaz és a dátumot. Tárolja a WB I munkaoldatot 15 C és 30 C között. D. Készítsen DNS mosópuffer II (WB II) munkaoldatot úgy, hogy 50 ml abszolút etanolt mér a WB II flakonba. A flakon szeri döntögetésével keverje össze az oldatot. Jegyezze fel a flakon oldalára, hogy etanolt tartalmaz és a dátumot. Tárolja a WB II munkaoldatot 15 C és 30 C között. Tárgylemezre ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása MEGJEGYZÉS: A xilol veszélyes vegyszer. A deparaffinálás valamennyi lépését vegyszerfülke alatt kell végezni. Lásd: Figyelmeztetések és óvintézkedések. A. Helyezze a tárgylemezt 5 µm-es FFPE-szövetmetszettel egy edénybe, amelyben elegendő mennyiségű xilol van, hogy a szövetet ellepje; áztassa 5 percig. B. Tegye át a tárgylemezt egy edénybe, amelyben elegendő mennyiségű abszolút etanol van, hogy a szövetet ellepje; áztassa 5 percig. C. Vegye ki a tárgylemezt az etanolból, és hagyja levegőn, hogy a metszet teljesen megszáradjon (5-10 perc). D. Készítsen makrometszetet, ha a minta területenkén 10%-nál kevesebb tumort tartalmaz. E. Minden mintához címkézzen meg egy-egy 1,5 ml-es pattintókupakos csövet a minta azonosításához szükséges információval. F. Mérjen 180 µl DNA TLB puffert a 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csőbe. G. Mérjen 70 µl PK oldatot a DNA TLB puffert tartalmazó pattintókupakos csőbe. H. Kaparja le a szövetet a tárgylemezről, és tegye a pattintókupakos csőbe. Merítse a szövetet a DNA TLB/PK elegybe. I. Folytassa a DNS-izolálás műveletének A lépésével HU 8 Doc Rev. 1.0

9 Tárgylemezre nem ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása MEGJEGYZÉS: A xilol veszélyes vegyszer. A deparaffinálás valamennyi lépését vegyszerfülke alatt kell végezni. Lásd: Figyelmeztetések és óvintézkedések. MEGJEGYZÉS: Ha a minta területenként 10%-nál kevesebb tumort tartalmaz, a metszetet fel kell ragasztani tárgylemezre makrometszet készítéshez, és a Tárgylemezre ragasztott FFPE-szövetmetszetek deparaffinálása szakaszban részletezett eljárást kell követni. A. Helyezzen egy 5 mikronos FFPE-szövetmetszetet egy 1,5 ml-es pattintókupakos csőbe, amely el van látva a minta azonosításához szükséges információval. B. Mérjen 500 µl xilolt az FFPE-szövetmetszetet tartalmazó pattintókupakos csőbe. C. Vortexelje jól össze 10 másodpercig. D. Hagyja a csövet állni 5 percig 15 C és 30 C között. E. Adjon hozzá 500 µl abszolút etanolt, és vortexelje jól össze 10 másodpercig. F. Hagyja a csövet állni 5 percig 15 C és 30 C között. G. Centrifugázza a csövet x g-n 2 percig. Távolítsa el a felülúszót anélkül, hogy az üledéket felzavarná. Dobja ki a felülúszót vegyszergyűjtőbe. H. Adjon hozzá 1 ml abszolút etanolt, és vortexelje 10 másodpercig. I. Centrifugázza a csövet x g-n 2 percig. Távolítsa el a felülúszót anélkül, hogy az üledéket felzavarná. Dobja ki a felülúszót vegyszergyűjtőbe. MEGJEGYZÉS: Ha az üledék lebeg a maradék felülúszóban, akkor ismét centrifugázza 1 percig x g-n. Távolítsa el a maradék felülúszót. J. Szárítsa a szövetüledéket 10 percig 56 C-os fűtőblokkban úgy, hogy a cső nyitva van. MEGJEGYZÉS: Ellenőrizze, hogy az etanol teljesen elpárolgott és az üledék száraz, mielőtt folytatná a következő lépéssel. MEGJEGYZÉS: Szükség esetén a száraz üledék 2 C és 8 C között 24 óráig tárolható. K. Oldja fel újra a szövetüledéket 180 µl DNS szövet lízispufferben (DNA TLB). L. Adjon hozzá 70 µl PK oldatot. M. Folytassa a DNS-izolálás műveletének A lépésével. MINTA-ELŐKÉSZÍTÉS DNS-izolálás művelete MEGJEGYZÉS: A mintá(ka)t negatív kontrollal együtt dolgozza fel. A negatív kontrollt úgy készítse el, hogy 180 µl DNS szövet lízispuffert (DNA TLB) és 70 µl PK oldatot összekever egy 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csőbe, és ráírja, hogy NEG CT. A negatív kontrollt ugyanazt az eljárást követve kell feldolgozni, mint a mintákat. A. Vortexelje a minta/dna TLB/PK keveréket és a negatív kontroll keveréket (NEG CT) tartalmazó csöveket 30 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A szövetet a DNA TLB/PK elegy teljesen el kell, hogy lepje. B. Helyezze a csöveket 56 C-os száraz fűtőblokkba, és inkubálja 60 percig. C. Vortexelje a csöveket 10 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A szövetet a DNA TLB/PK elegy teljesen el kell, hogy lepje. D. Helyezze a csöveket 90 C-os száraz fűtőblokkba, és inkubálja 60 percig. MEGJEGYZÉS: Az inkubálás ideje alatt készítse elő a kívánt számú pattintókupakos szűrőcsövet (FT) úgy, hogy az FT csövet egy gyűjtőcsőre (CT) helyezi, és mindegyik FT kupakját ellátja a megfelelő minta- vagy kontrollazonosítóval. MEGJEGYZÉS: Minden egyes mintához 1 FT, 3 CT és 1 eluáló cső (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső) szükséges. MEGJEGYZÉS: Az inkubálás ideje alatt lássa el a kívánt számú eluáló csövet (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső) a megfelelő minta- vagy kontrollazonosító információval. E. Hagyja a csöveket lehűlni 15 C és 30 C közé. Lehűlés után pulzuscentrifugával centrifugálja a csöveket, hogy a kupakokról a folyadék lejöjjön. F. Mérjen 200 µl DNA PBB puffert mindegyik csőbe; 3-szori fel-le pipettázással keverje össze. G. Inkubálja a csöveket 15 C és 30 C között 10 percig HU 9 Doc Rev. 1.0

10 H. Mérjen 100 µl izopropanolt mindegyik csőbe; 3-szori fel-le pipettázással keverje össze a lizátumot. I. Vigyen át minden egyes lizátumot a megfelelően jelölt FT/CT egységbe. J. Centrifugázza az FT/CT egységeket x g-n 1 percig. K. Tegyen minden FT csövet egy új CT csőre. Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. L. Mérjen µl WB I munkaoldatot mindegyik FT csőbe. MEGJEGYZÉS: A WB I munkaoldat készítése a Reagens-előkészítés szakaszban van ismertetve. M. Centrifugázza az FT/CT egységeket x g-n 1 percig. N. Öntse ki a szűrletet minden CT csőből vegyszergyűjtőbe. Tegye az FT csövet vissza ugyanarra a CT csőre. O. Mérjen µl WB II munkaoldatot mindegyik FT csőbe. MEGJEGYZÉS: A WB II munkaoldat készítése a Reagens-előkészítés szakaszban van ismertetve. P. Centrifugázza az FT/CT egységeket x g-n 1 percig. Q. Tegyen minden FT csövet egy új CT csőre. Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. R. Centrifugázza az FT/CT egységeket x g-n 1 percig, hogy a szűrőmembránok megszáradjanak. S. Helyezzen minden FT csövet egy-egy minta- vagy kontrollazonosítóval ellátott eluáló csőbe (1,5 ml-es mikrocentrifuga cső). Öntse ki a szűrletet a használt CT csőből vegyszergyűjtőbe, és megfelelően eljárva dobja ki a használt CT csövet. T. Mérjen 100 µl DNA EB puffert minden egyes FT közepére anélkül, hogy hozzáérne az FT membránhoz. U. Inkubálja az FT csövet az eluáló csővel 15 C és 30 C között 5 percig. V. Centrifugázza az FT csövet az eluáló csővel x g-n 1 percig, hogy az eluátum összegyűljön az eluáló csőben. Megfelelően eljárva dobja ki a használt FT csövet. W. Zárja le az eluáló cső kupakját. Az eluáló csőben van a DNS törzs. Folytassa a DNS mennyiségi meghatározása szakaszban az A lépéssel. MEGJEGYZÉS: A DNS-koncentráció mérését azonnal el kell végezni a DNS-izolálás művelete után még tárolás előtt. DNS mennyiségi meghatározása: A. Vortexelje mindegyik DNS törzset 5 másodpercig. B. Határozza meg a DNS mennyiségét Nanodrop UV-Vis Spektrofotométer (ND-1000 or ND-2000) segítségével a gyártó utasításai szerint. Referencia mintaként a készülékhez használjon DNA EB puffert. Két konzisztens leolvasás átlaga szükséges. A két mérésnek ±10% eltérésen belül kell lennie egymáshoz képest, ha a DNS-koncentráció leolvasás 20,0 ng/µl. Ha a DNS-koncentráció leolvasás < 20,0 ng/µl, akkor a két mérésnek ± 2 ng/µl eltérésen belül kell lennie. Ha a két mérés nincs ± 10% eltérésen belül egymáshoz képest, ha a DNS-koncentráció leolvasás 20,0 ng/µl, vagy ± 2 ng/µl eltérésen belül, ha a DNS-koncentráció leolvasás < 20,0 ng/µl, akkor 2 további leolvasást kell végezni, amíg a feltételek nem teljesülnek. Ezután a két új mérés átlagát kell kiszámolni. MEGJEGYZÉS: A feldolgozott negatív kontrollból (NEG CT) származó DNS törzset nem szükséges mérni. C. A mintákból származó DNS törzs koncentrációjának 2 ng/µl-nek kell lennie ahhoz, hogy a cobas EGFR mutáció teszt elvégezhető legyen. Mintánként három amplifikálás/kimutatás történik, minden amplifikálás/kimutatás esetén 25 µl-rel a DNS törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 50 ng DNS). MEGJEGYZÉS: A DNS törzs koncentrációjának legalább 2 ng/µl-nek kell lennie ahhoz, hogy a cobas EGFR mutáció teszt elvégezhető legyen. Ha a DNS törzs koncentrációja < 2 ng/µl, ismételje meg a deparaffinálás, DNS-izolálás és DNS mennyiségi meghatározás lépéseket az adott mintára úgy, hogy két 5 µm FFPE-szövetmetszetet használ. Tárgylemezre ragasztott metszetek esetén a deparaffinálást követően tegye egyetlen csőbe a két metszetből származó szövetet, merítse a szövetet a DNA TLB + PK elegybe, és végezze el a DNS-izolálást és mennyiségi meghatározást a fentiek szerint. Tárgylemezre nem ragasztott metszetek esetén tegye egyetlen csőbe a két metszetet, merítse a szövetet a DNA TLB + PK elegybe, és végezze el a DNS-izolálást és mennyiségi meghatározást a fentiek szerint. Ha a DNS törzs még mindig < 2 ng/µl, kérjen egy másik FFPE-szövetmetszetmintát a megfelelő klinikai helyszíntől. MEGJEGYZÉS: Tárolja a DNS törzset (feldolgozott minta és negatív kontroll) 2 C és 8 C között 2 hétig vagy -20 C-on 60 napig HU 10 Doc Rev. 1.0

11 AMPLIFIKÁLÁS ÉS KIMUTATÁS MEGJEGYZÉS: Hogy az MMX munkareagens DNS mintával való kontaminálását elkerülje, az amplifikálást és kimutatást elkülönítve kell végezni a DNS-izolálástól. Az amplifikálási és kimutatási munkaterületet alaposan meg kell tisztítani az MMX munkareagens elkészítése előtt. A megfelelő tisztításhoz valamennyi felületet, az állványokat és pipettorokat is beleértve, gondosan le kell törölni 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldattal, majd 70%-os etanol oldattal. A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. Az 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5%-os nátrium-hipoklorit oldatnak. Készülék összeállítása: A cobas z 480 összeállítására vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza a cobas z 480 analizátor felhasználói kézikönyvét. Teszt sorrend összeállítása: Az EGFR munkafolyamat lépéseire vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza az alábbi dokumentumot: cobas 4800 rendszer felhasználói készikönyv szoftver 2.0-s verzió a cobas EGFR mutáció teszthez (cobas EGFR felhasználói kézikönyv). Minta DNS törzs hígítás kiszámítása: Hígítás kiszámítása 2 ng/µl - 36 ng/µl DNS törzs koncentrációk esetén MEGJEGYZÉS: Mintákból származó DNS törzseket amplifikálás és kimutatás előtt azonnal fel kell hígítani. MEGJEGYZÉS: Mintánként három (3) amplifikálás/kimutatás történik, ehhez összesen 75 µl (a három reakció mindegyikéhez µl) szükséges a DNS törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 150 ng DNS). A. Minden mintához számolja ki a DNS törzs szükséges térfogatát (µl): DNS törzs µl = (90 µl x 2 ng/µl) DNS törzs koncentráció [ng/µl] B. Minden mintához számolja ki a DNS mintaoldószer (DNA SD) szükséges térfogatát (µl): DNA SD µl = 90 µl DNS törzs µl Példa: DNS törzs koncentráció = 6,5 ng/µl A. DNS törzs µl = (90 µl x 2 ng/µl) 6,5 ng/µl = 27,7 µl B. DNA SD µl = (90 µl 27,7 µl) = 62,3 µl Hígítás kiszámítása >36 ng/µl DNS törzs koncentrációk esetén MEGJEGYZÉS: Mintákból származó DNS törzseket amplifikálás és kimutatás előtt azonnal fel kell hígítani. MEGJEGYZÉS: Mintánként három (3) amplifikálás/kimutatás történik, ehhez összesen 75 µl (a három reakció mindegyikéhez µl) szükséges a DNS törzs 2 ng/µl-es hígításából (összesen 150 ng DNS). A. Ha a DNS törzs koncentráció > 36 ng/µl, használja az alábbi képletet a DNS mintaoldószer (DNA SD) mennyiségének kiszámításához, amely legalább 90 µl hígított DNS törzs készítéséhez szükséges. Ennek lényege, hogy minden mintába legalább 5 µl DNS törzs kerüljön. B. Minden minta esetén számítsa ki a DNA SD térfogatát (µl), amely 5 µl DNS törzs 2 ng/µl koncentrációra való hígításához szükséges: Szükséges DNA SD térfogat (µl) = ((5 µl DNS törzs x DNS törzs koncentráció (ng/µl) / 2 ng/µl) 5 µl Példa: DNS törzs koncentráció = 100 ng/µl A. Szükséges DNA SD térfogat (µl) = ((5 µl x 100 ng/µl) / 2 ng/µl) 5 µl = 245 µl B. 5 µl DNS törzs hígításához használja a kiszámított DNA SD térfogatot. Minta hígítás A. Készítse elő a kívánt számú 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csövet a DNS hígításhoz, és lássa el őket a megfelelő mintaazonosítóval. B. Aeroszol-rezisztens heggyel ellátott pipetta segítségével pipettáza a DNA SD oldószer kiszámított térfogatait a megfelelően jelölt csövekbe. Pipettázzon 45 µl DNA SD oldószert a NEG CT jelölésű pattintókupakos csőbe. C. Vortexeljen minden egyes DNS törzset és a negatív kontrollt 5-10 másodpercig HU 11 Doc Rev. 1.0

12 D. Aeroszol-rezisztens pipettaheggyel ellátott pipetta segítségével (minden pipettázáshoz új hegy) óvatosan pipettázza minden egyes DNS törzs esetén a kiszámított térfogatot a DNA SD oldószert tartalmazó megfelelő csőbe. Pipettázzon 45 µl negatív kontrollt (extrahált eluátum) a NEG CT csőbe. E. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje mindegyiket 5-10 másodpercig. F. Cseréljen kesztyűt. Master mix (, a ) munkareagensek elkészítése MEGJEGYZÉS: Az EGFR, EGFR, EGFR és az MMX munkareagens fényérzékenyek, és fénytől védve tartandóak. MEGJEGYZÉS: Mivel az EGFR MIXEK és az MMX munkareagens viszkózus folyadékok, lassan pipettázzon, hogy biztosan a teljes mennyiség kijöjjön a hegyből. MEGJEGYZÉS: Az EGFR, EGFR és EGFR reagensek színe világoskék/lilás lehet. Ez nem befolyásolja a reagens minőségét. Készítsen három külön MMX munkareagenst: egyet EGFR -ből, egyet EGFR -ből és egy harmadikat EGFR -ból külön 1,5 ml-es pattintókupakos mikrocentrifuga csövekbe. A. Számítsa ki az egyes MMX munkareagensekhez szükséges EGFR vagy EGFR vagy EGFR térfogatot az alábbi képlet segítségével: Szükséges EGFR vagy EGFR vagy EGFR térfogat = (minták száma + 2 kontroll + 1) x 20 µl B. Számítsa ki az egyes MMX munkareagensekhez szükséges MGAC térfogatot az alábbi képlet segítségével: Szükséges MGAC térfogat = (minták száma + 2 kontroll + 1) x 5 µl Az 1. táblázat segítségével határozza meg az egyes reagenseknek az MMX munkareagens készítéséhez szükséges térfogatát a futtatásban részt vevő minták száma alapján. 1. táblázat munkareagens, munkareagens és munkareagens készítéséhez szükséges reagens térfogatok Minták száma* MMX 20 µl MGAC 5 µl Össztérfogat az egyes MMX munkareagensekhez (µl) * A minták számához tartozó térfogatok a (minták száma + 2 kontroll +1) összeg alapján vannak kiszámítva C. Vegye ki a hűtőből 2 C és 8 C között tárolt megfelelő számú EGFR, EGFR, EGFR és MGAC csövet. Használat előtt vortexelje mindegyik reagenst 5 másodpercig és gyűjtse a cső aljára a folyadékot. Lásson el jelöléssel steril mikrocentrifuga csöveket az munkareagens, munkareagens és munkareagens számára. D. Mérje az EGFR vagy EGFR vagy EGFR kiszámított térfogatát a megfelelő MMX munkareagens csőbe. E. Mérje az MGAC kiszámított térfogatát az MMX munkareagens csövekbe. F. A megfelelő keveredés érdekében vortexelje a csövet 3-5 másodpercig. MEGJEGYZÉS: A mintákat és kontrollokat az MMX munkareagensekhez, azok elkészítésétől számított 1 órán belül hozzá kell adni a mikrolemezen (AD-lemez). MEGJEGYZÉS: Csak cobas 4800 rendszer mikrolemezt (AD-lemez) és zárófóliát (Roche P/N ) használjon HU 12 Doc Rev. 1.0

13 Lemez elkészítése 1. ábra Lemez elrendezés minta 1. ábra. Lemez elrendezés a cobas EGFR mutáció teszthez Sor / Oszlop A B C D E F G H MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 MUT NEG S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S15 S16 S17 S18 S19 S20 S21 S22 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 S23 S24 S25 S26 S27 S28 S29 S30 Ahol: NEG = negatív kontroll, MUT = mutáns kontroll, S# = mintaazonosító és MMX-# = master mix reagens 1, 2 vagy 3. MEGJEGYZÉS: Hogy eredményt kapjon, bármely mintát három egymás melletti oszlop azonos sorába kell elosztani. A. Pipettázzon 25 µl MMX munkareagenst a futtatáshoz szükséges minden reakciólyukba a mikrolemezen (AD-lemez). Ügyeljen, hogy a pipetta hegye ne érjen a lemezhez a lyukon kívül. Mérjen szükség szerint (EGFR tartalmú) munkareagenst a mikrolemez (AD-lemez) lyukakba az 1., 4., 7. és 10. oszlopba. Mérjen szükség szerint (EGFR tartalmú) munkareagenst a mikrolemez (AD-lemez) lyukakba a 2., 5., 8. és 11. oszlopba. Mérjen szükség szerint (EGFR tartalmú) munkareagenst a mikrolemez (AD-lemez) lyukakba a 3., 6., 9. és 12. oszlopba. B. Pipettázzon 25 µl EGFR MC kontrollt a mikrolemez (AD-lemez) A1, A2 és A3 lyukaiba; keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. C. Új pipettaheggyel pipettázzon 25 µl NEG CT kontrollt a mikrolemez (AD-lemez) B1, B2 és B3 lyukaiba; keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. MEGJEGYZÉS: Minden futtatásnak tartalmaznia kell pozitív kontrollt (EGFR MC) az A1, A2 és A3 lyukakban, és negatív kontrollt (NEG CT) a B1, B2 és B3 lyukakban, különben a futtatást a cobas z 480 analizátor érvényteleníti. MEGJEGYZÉS: Szükség szerint cseréljen kesztyűt, hogy megelőzze a minta-minta kontaminációt, illetve a PCR reakciócső külső eredetű kontaminálását. D. Minden egyes minta DNS hígításhoz új pipettahegyet használva mérjen 25 µl-t az első minta DNS-ből a mikrolemez (AD-lemez) C1, C2 és C3 lyukaiba (minden lyuk esetén a minta DNS hozzáadásához új hegyet használjon); keverje jól össze a pipettát a lyukon belül legalább kétszer felszívva és kiürítve. Ismételje meg az eljárást a második mintából származó DNS hígítás esetén (D1, D2 és D3 lyukak). Kövesse az 1. ábrán látható elrendezést, amíg valamennyi minta DNS hígítást be nem töltötte a mikrolemez (AD-lemez) lyukaiba. Ellenőrizze, hogy az összes folyadék a lyukak aljára gyűlt. E. Fedje le a mikrolemezt (AD-lemezt) zárófóliával (a lemezek mellé jár). A zárófólia felhelyező segítségével rögzítse a fóliát légmentesen a mikrolemezre (AD-lemezre). F. A PCR indítása előtt ellenőrizze, hogy az összes folyadék az egyes lyukak aljára gyűlt. MEGJEGYZÉS: Az amplifikálást és kimutatást az első minta DNS hígításnak az MMX munkaoldathoz való hozzáadását követő 1 órán belül meg kell kezdeni HU 13 Doc Rev. 1.0

14 PCR indítása Az EGFR munkafolyamat lépéseire vonatkozó részletes útmutatásért tanulmányozza a cobas kézikönyvet. EGFR felhasználói EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE MEGJEGYZÉS: Minden futtatási és minta validálást a cobas 4800 szoftver hajt végre. MEGJEGYZÉS: Egy érvényes futtatás tartalmazhat érvényes és érvénytelen mintaeredményeket is. Egy érvényes futtatás mintaeredményeit a 2. táblázat szemlélteti. 2. táblázat cobas EGFR mutáció teszt eredmények értelmezése Teszteredmény Mutáció eredmény Magyarázat Mutation Detected 19-es exon deléció S768I L858R T790M G719X (G719A, G719C, G719S) 20-as exon inzerció (egynél több mutáció is jelen lehet) Kimutatott mutáció egy meghatározott target EGFR régióban. Mutation Not N/A Nincs kimutatható mutáció a target EGFR régiókban Detected* Invalid N/A A minta eredménye érvénytelen. Az érvénytelen eredményű minták vizsgálatát ismételje meg az alábbi Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata szakaszban leírtak szerint. Failed N/A Hibás futtatás hardver- vagy szoftverhiba miatt. Vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével műszaki segítségért * A Mutation Not Detected eredmény nem zárja ki mutáció jelenlétét a target EGFR régiókban, mivel az eredmény a mutáns szekvenciák százalékos arányától, a minta megfelelő integritásától, a gátlóanyagok hiányától és az elegendő mennyiségű kimutatható DNS jelenlététől is függ. Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata A. Ismételje meg az érvénytelen minta DNS törzs hígítását az AMPLIFIKÁLÁS ÉS KIMUTATÁS szakaszban leírt Minta DNS törzs hígítás kiszámítása és Minta hígítás műveletektől kezdve. B. Miután elvégezte a DNS törzs 2 ng/µl-re való hígítását a Minta hígítás szakasz szerint, folytassa a Master mix (, a ) munkareagensek elkészítése művelettel, illetve az amplifikálás és kimutatás folyamatának többi lépésével. MEGJEGYZÉS: Ha a minta az ismételt vizsgálat után is érvénytelen marad, vagy nem volt elegendő DNS törzs új hígítás készítéséhez az Érvénytelen eredményű minták ismételt vizsgálata szakasz A lépésében, akkor ismételje meg az adott minta teljes vizsgálati folyamatát egy új 5 mikronos FFPEszövetmetszettel a Deparaffinálás és DNS izolálás lépésekkel kezdődően. MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Egy-egy cobas EGFR teszt mutáns kontroll (EGFR MC) és egy-egy negatív kontroll (NEG CT) az munkareagens, munkareagens és munkareagens mindegyikéhez tartozóan minden, legfeljebb 30 mintát tartalmazó futtatásban szerepel. Egy futtatás akkor érvényes, ha az EGFR mutáns kontroll (EGFR MC) lyukak (A1, A2 és A3), valamint a negatív kontroll (NEG CT) lyukak (B1, B2 és B3) eredménye érvényes. Ha az EGFR mutáns kontroll (EGFR MC) vagy a negatív kontroll (NEG CT) eredménye az, vagy munkareagensek bármelyike esetén érvénytelen, akkor a teljes futtatás érvénytelen, és meg kell ismételni. Készítsen egy friss hígítást a korábban izolált minta DNS törzsből, és állítson össze egy új mikrolemezt (AD-lemezt) kontrollokkal az amplifikáláshoz és kimutatáshoz. Pozitív kontroll Az EGFR mutáns kontroll (EGFR MC) eredménye Valid kell legyen az, és munkareagensek mindegyike esetén. Ha az EGFR MC eredménye következetesen érvénytelen lesz, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával. Negatív kontroll A negatív kontroll (NEG CT) eredménye Valid kell legyen az, és munkareagensek mindegyike esetén. Ha a NEG CT eredménye következetesen érvénytelen lesz, technikai segítségért vegye fel a kapcsolatot a helyi Roche irodával HU 14 Doc Rev. 1.0

15 AZ ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat nagy analitikai érzékenysége miatt ügyeljen arra, hogy a reagensek és amplifikálási keverékek szennyeződéstől mentesek maradjanak. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1. Csak a jelzett mintatípusokat vizsgálja. A cobas EGFR mutáció tesztet csak NSCLC FFPE-szövetmintákkal való használathoz validálták. 2. A cobas EGFR mutáció tesztet csak a cobas DNS minta-előkészítő készlettel (Roche P/N: ) való használathoz validálták. 3. Egy mutáció kimutatása a mintában levő kópiák számától függ, ezért befolyásolhatja a minta integritása, az izolált DNS mennyisége és zavaró anyagok jelenléte is. 4. A megbízható eredmény a megfelelő minta fixáláson, -szállításon, -tároláson és -feldolgozáson múlik. Kövesse az ebben a használati utasításban és a cobas EGFR felhasználói kézikönyvben leírt műveleteket. 5. Egyéb potenciális változók, mint például különböző minta-fixálási lehetőségek hatását nem vizsgálták. 6 Az AmpErase enzim hozzáadása a cobas EGFR mutáció teszt master mixhez lehetővé teszi a target DNS szelektív amplifikálását, ugyanakkor a reagensek szennyeződésének elkerüléséhez a helyes laboratóriumi gyakorlat és ezen használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartása szükséges. 7. A terméket csak a PCR technikák terén jártas személyzet által és a cobas 4800 rendszeren szabad használni. 8. Csak a cobas z 480 analizátort validálták a termékkel való használatra. A temékkel más, valós idejű optikai detektálással működő PCR-készüléket nem lehet használni. 9. A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség minősíthető legyen. 10. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a cobas EGFR mutáció teszt primerei és/vagy próbái által lefedett EGFR gén genomi DNS régióiban levő mutációk következtében egy mutáció jelenlétének kimutatása sikertelen lesz. 11. PCR-inhibitorok jelenléte álnegatív vagy érvénytelen eredményeket okozhat. 12. Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a cobas EGFR mutáció teszt Mutation Not Detected eredményt ad egyes mutációkra, ugyanakkor korlátozott keresztreaktivitást ( Mutation Detected eredményt) mutat a 18-as, 19-es, 20-as és 21-es exonban a targetmutációkkal szomszédos mutációk esetén. 13. A cobas EGFR mutáció tesztet reakciólyukanként 50 ng DNS-sel való használathoz validálták. Reakciólyukanként 50 ng-nál kisebb DNS-mennyiség használata nem javasolt. NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS Analitikai érzékenység A cobas EGFR mutáció teszt analitikai érzékenysége plazmidkeverék segítségével Hat, a teszttel kimutatható mutációosztályoknál leggyakrabban észlelt mutációkat tartalmazó DNS plazmid konstrukciót kevertek össze vad típusú sejtvonal DNS-sel úgy, hogy a megcélzott végső összetétel genomi DNS ekvivalensek alapján 5% mutáns szekvencia legyen. Az 5%-os mutáns szekvencia törzsekből sorozathígítást készítettek, és minden egyes paneltag 24 ismétlését vizsgálták a cobas EGFR mutáció teszt készlet 3 gyártási tételének mindegyikével. Az analitikai érzékenységet úgy határozták meg, mint a legkisebb DNS mennyiség, amely legalább 95% arányban adott EGFR Mutation Detected eredményt a target mutációk esetén (3. táblázat). 3. táblázat A cobas EGFR mutáció teszt érzékenysége plazmid- vagy sejtvonalkeverékből származó DNS segítségével EGFR exon EGFR mutáció Target nukleinsav-szekvencia 18 G719A 2156 G>C 3, es exon deléció del15 0,78 20 S768I 2303 G>T 0,78 20 T790M 2369 C>T 3, as exon inzerció 2307_2308ins9 (GCCAGCGTG) 3,13 21 L858R 2573 T>G 0,78 Legkisebb DNS (ng) mennyiség abban az 5% mutáns paneltagban reakciólyukanként, amely 95% arányban Mutation Detected eredményt adott (N=72 ismétlés) HU 15 Doc Rev. 1.0

16 Analitikai érzékenység FFPET mintakeverék segítségével 19-es exon deléció és L858R mutációk esetén három FFPET minta DNS extraktumot kevertek össze EGFR vad típus FFPET minta extraktumokkal úgy, hogy a mintakeverékek target mutáció szintje 10, 5,0, 2,5 és 1,25% legyen egy validált, masszívan párhuzamos piroszekvenálási módszerrel, a 454 szekvenálással (454 Life Sciences, Branford, CT, USA). A mintakeverékekből sorozathígítást készítettek, és minden egyes paneltag nyolc (8) ismétlését futtatták a cobas EGFR mutáció teszt készlet 3 gyártási tételének mindegyikével (n=24/paneltag). Az egyes minták érzékenységét úgy határozták meg, mint a legkisebb DNS mennyiség, amely legalább 95% arányban adott EGFR Mutation Detected eredményt a target mutációk esetén (4. táblázat). 4. táblázat A cobas EGFR mutáció teszt érzékenysége FFPET mintakeverékek segítségével EGFR mutáció 19-es exon deléció L858R Mutáció-százalék abban a paneltagban, amely 95% arányban Mutation Detected eredményt adott Minta EGFR nukleinsavszekvencia reakciólyukanként 50 ng DNSmennyiség mellett (N=24 ismétlés) Minta #1 2235_2249del15 1,4 Minta #2 2236_2250del15 2,5 Minta #3 2238_2252del15 2,4 Minta # T>G 4,0 Minta # T>G 4,2 Minta # T>G 4,3 Ez a vizsgálat demonstrálja, hogy a cobas EGFR mutáció teszt képes az EGFR 19-es és 21-es exonok legalább 5%-os mutációszintű mutációinak kimutatására a standard, reakciólyukanként 50 ng mennyiség mellett. Referencia módszerrel való korreláció 201 NSCLC FFPET minta összehasonlító vizsgálatát végezték el a cobas EGFR mutáció teszt 2 különböző tételével és 2X bidirekcionális Sanger-féle szekvenálással, hogy meghatározzák a módszerek közti pozitív, negatív és teljes megfelelési arányt. A cobas EGFR mutáció teszttel és a Sanger-féle szekvenálással kapott eltérő eredmények feloldását 454 szekvenálással végezték. A cobas EGFR mutáció teszttel és/vagy Sanger-féle szekvenálással érvénytelen eredményt adó mintákat kizárták a vizsgálatból. A cobas EGFR mutáció teszt eredményeit akkor tekintették érvénytelennek, ha a vizsgált mutációk bármelyike invalid eredményt adott (2. táblázat). A Sanger eredményeket akkor tekintették érvénytelennek, ha egy minta esetén a négy exon közül bármelyik érvénytelen eredményt adott. cobas EGFR mutáció teszt és Sanger eredmények Az összehasonlításban szereplő 201 mintából 49 mintát nem tudtak értékelni konkordancia szempontjából, mert egyik vagy mindkét módszer érvénytelen eredményt adott. 48 minta volt érvénytelen Sanger-módszerrel (23,8%), 6 minta volt érvénytelen cobas EGFR mutáció teszt 1. tétellel (3,0%) és 5 minta volt érvénytelen cobas EGFR mutáció teszt 2. tétellel (2,5%). Az érvénytelen eredmények megoszlását az egyes módszerek között az 5. táblázat mutatja. 5. táblázat Érvénytelen eredmények megoszlása a módszerek között cobas EGFR mutáció teszt Érvénytelen minták módszer szerint 1. tétel 2. tétel csak Sanger érvénytelen csak cobas érvénytelen 1 1 Sanger és cobas érvénytelen 5 4 Összes HU 16 Doc Rev. 1.0