LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test

Átírás

1 LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit EXTRN 50 Tests P/N: LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT 48 Tests P/N: LINEAR ARRAY Detection Kit LA DK 96 Tests P/N: Well Tray with Lid 1 Each P/N: FELHASZNÁLÁS MÓDJA Az LINEAR ARRAY HPV (humán papillomavírus) Genotyping Test egy kvalitatív in vitro vizsgálat a humán papillomavírus kimutatására klinikai mintákban. A harminchét anogenitalis HPV DNS genotípusainak [6, 11, 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 45, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73 (MM9), 81, 82 (MM4), 83 (MM7), 84 (MM8), IS39 és CP6108] cobas PCR sejtminta-tápközegbe vagy PreservCyt oldatba levett cervicalis sejtekből való kimutatására a vizsgálat a következő lépéseket valósítja meg: a target DNS amplifikálása polimeráz láncreakcióval (PCR), majd nukleinsav-hibridizáció. A vizsgálat összegzése és magyarázata A méhnyakrák, valamint annak megelőző állapota, a cervicalis intraepithelialis neoplasia (CIN) legfontosabb oka a humán papillomavírus (HPV) okozta perzisztáló fertőzés 1-3. Világszerte a méhnyakrák esetek több, mint 99%-ában kimutatták a HPV jelenlétét 3. A HPV egy kicsi, burokkal nem rendelkező, kettős szálú DNS-t tartalmazó vírus, amelynek genomja megközelítően 8000 nukleotidból áll. Több, mint 100 különböző HPV-genotípus ismeretes, és mintegy 40 különböző HPV-genotípus képes megfertőzni a humán genitális nyálkahártyát. Ugyanakkor ezeknek a szexuális úton átvihető vírus genotípusoknak csak egy kisebb csoportja társul magas fokozatú cervicalis displasiaval és méhnyakrákkal 3-5. Ezeket magas kockázatú HPV-genotípusoknak nevezik, míg az alacsony kockázatú HPV-genotípusok gyakran jóindulatú alacsony fokozatú intraepithelialis laesiókkal, illetve condylomákkal fordulnak elő együtt. A szexuális úton átvitt HPV-fertőzés rendkívül általános, becslések szerint a nők mintegy 75%-a kerül élete során kapcsolatba HPV-expozícióval 6. A HPV-fertőzések túlnyomó többsége spontán megszűnik, ugyanakkor a magas kockázatú HPV perzisztálása szignifikáns kockázati tényezőt jelent méhnyakrák kialakulására. A fejlett országokban a méhnyakrákszűrés során az 50-es évek közepétől a Pap-kenetet (Dr. George Papanicolaou után) használják, mint elsődleges eszközt a méhnyakrák korai megelőző állapotainak kimutatására. Bár ennek folytán a méhnyakrák halálozási mutatói drámaian csökkentek ezekben az országokban, a Pap-kenet egy relatíve pontatlan vizsgálat, az álnegatív eredmények nagy arányával, amelynek értékeléséhez magasan képzett citopatológus szükséges. A Pap-kenetben megfigyelt citológiai abnormalitások elsősorban a HPV-fertőzés következtében alakulnak ki; ugyanakkor a különböző gyulladásos, illetve a kenetkészítéssel kapcsolatba hozható eltérések álpozitív Pap-eredményeket okozhatnak. Az abnormális Pap-kenet triászba tartozik a vizsgálat megismétlése, a kolposzkópia és a biopszia. A szövettanilag alátámasztott magas fokozatú laesiókat az invazív méhnyakrák kialakulását megelőzendő sebészileg el kell távolítani. A papillomavírust rendkívül nehéz in vitro tenyészteni, továbbá nem minden HPV-fertőzött betegnek van kimutatható antitestes válasza. A PCR segítségével történő nukleinsav- (DNS) vizsgálat egy érzékeny és non-invazív módszer az aktív cervicalis HPV-fertőzés jelenlétének igazolására. HPVtipizálási teszt alkalmazásairól szóló beszámolók tartalmazzák specifikus HPV-típusok 7 megszerzésének és clearance-ének kiértékelését; genotípusok típusspecifikus jelenlétének megfigyelését magas kockázatú méhnyak-megbetegedés és méhnyakrák kialakulásával kapcsolatban 8 ; kimetszéses terápia 9, sugárterápia 10 vagy kemoterápia 11 hatékonyságát HPV-vel összefüggő laesiók esetén (gyógyulási teszt); genotípus meghatározását választott szűrőprogramok esetén, oltás előtti vagy utáni bemutatást 12 ; epidemiológiai vizsgálatok elősegítését tekintettel a HPVfertőzések természetes előfordulására. A Dokumentum verzióinformációi rész a dokumentum végén található HU 1 Doc Rev. 11.0

2 AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test négy fő lépésből épül fel: minta előkészítése; a target DNS amplifikálása HPV primerek felhasználásával PCR során 13 ; az amplifikált termékek hibridizációja oligonukleotid próbákhoz és a kötődött amplifikált termékek kolorimetriás kimutatása. A minta előkészítés során AmpliLute Liquid Media Extraction Kit segítségével állítja elő a PCRamplifikációhoz szükséges HPV target DNS-t és human genomikus DNS-t. A master mix reagens 37 HPVgenotípusból származó DNS-hez és a humán ß-globin génhez tartalmaz primereket az amplifikációhoz. A kimutatás és a genotípus meghatározása a denaturált amplifikált DNS és egy oligonukleotid próba array felhasználásával végzendő el, mely lehetővé teszi az egyedi HPV-genotípusok független azonosítását. A minta előkészítése A HPV DNS-t a cervicalis sejtminták roncsolásával teszik szabaddá magas hőmérsékleten denaturáló körülmények között. A roncsolást egy chaotrop ágens, a proteináz K, valamint detergens jelenlétében végzik, majd az oszlopon lévő DNS izolálása és tisztítása, és eluáló reagenssel való elúció következik. A ß-globin gén izolálása párhuzamosan történik, így az, mint extrahálási és amplifikálási, valamint sejtkontroll szerepel minden egyes feldolgozott minta esetén. PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test biotinilált primereket használ a HPV-genom polimorf L1 szakaszán lévő mintegy 450 bázispár hosszúságú nukleotidszekvencia meghatározásához. A master mixben lévő HPV-primereket 13 magas kockázatú genotípusból* (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 és 68) 3-5 származó 37 HPV DNS amplifikálására tervezték 14. A capture próbaszekvenciák az ezen primerek által kötött L1 polimorf szakaszokon helyezkednek el. Egy további primer pár a humán ß-globin génhez target, így az mint extrahálási és amplifikálási, valamint sejtkontroll szerepel. Targetamplifikáció AmpliTaq Gold DNS-polimeráz van alkalmazva a HPV target DNS és a ß-globin kontroll hot start amplifikációjához. Az AmpliTaq Gold DNS-polimeráz aktiválása, a vírus DNS és a humán genom DNS denaturálása valamint primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a PCR-reakcióelegyet először fel kell hevíteni. Az elegy kihűlésével a primerek (mind az upstream, mind a downstream) a target DNS-hez kapcsolódnak. Az AmpliTaq Gold DNS-polimeráz Mg 2+ és feleslegben lévő dntp-k jelenléte mellett meghosszabbítja a kapcsolódott primereket a target templát mentén egy körülbelül 450 bázispárból álló kétszálú HPV target DNS-molekulát, vagy egy amplikonnak nevezett 268 bázispárból álló ß-globin DNS molekulát-létrehozva. Ez a folyamat számos cikluson keresztül ismétlődik, az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódik. Az amplifikálás a HPV-genomnak, illetve a ß-globin génnek csak a megfelelő primer párok közötti régiójában zajlik. A teljes genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test a mintából származó target-nukleinsav szelektív amplifikálását az AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 15, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagensben lévő dezoxiuridin-trifoszfát mellett dezoxitimidin-trifoszfátot is használ; így tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben a master mix reagens bázikus ph-ján az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a target amplikont. Az amplifikálást követően a maradék enzim a denaturáló oldat hozzáadásakor denaturálódik, megelőzve ezáltal a targetamplikonok lebontását. * A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test a HPV 66-ot detektálja, melyre nézve a rizikócsoportba való sorolhatóság nem egyértelmű. A szakirodalomban nincs megegyezés arra vonatkozólag, hogyan lehetne ezt a típust klasszifikálni, mivel a közleménytől függően alacsony, mérsékelt vagy magas rizikójú csoportba sorolják. A HPV DNS-érzékelésén alapuló, méhnyakrák-szűréshez használatos vizsgálati módszerek esetén a tipizálás eredménye szintén eltérő, mivel bizonyos módszerek a HPV 66-ot magas rizikójú csoportba sorolják, mások ugyanakkor nem HU 2 Doc Rev. 11.0

3 Hibridizáció A PCR-amplifikálást követően a denaturáló oldat hozzáadásával a HPV és ß-globin amplikon kémiai denaturálást szenved, és egyszálú DNS lesz. A denaturált amplikonok kis részletei azután a tipizáló tálca megfelelő üregeibe kerülnek, amely üregek hibridizációs puffert és egyszálú LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkot tartalmaznak, amely különböző HPV és ß-globin próbák sorozatával van fedve. A biotinilált amplikon csak abban az esetben hibridizál az oligonukleotid próbákkal, ha az amplikon tartalmazza a komplementer próba megfelelő szekvenciáját. Továbbá, a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Strip egy keresztreaktív oligonukleotid próbával van fedve, mely hibridizál a HPV 33, 35, 52 és 58 genotípusaival. Az amplikon, mely a próbával komplementer, szorosan egyező szekvenciákat tartalmaz (csupán 1 3 mismatch), hibridizálni fog ezzel a próba vonallal. Kimutatási reakció A hibridizációs reakciót követően a LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csík erőteljesen lemosódik, eltávolítva bármely nem kötődött anyagot. Azután sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum adódik a csíkhoz. A sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum a csíkon lévő oligonukleotid próbákhoz hibridizált biotinilált amplikonhoz kötődik. A csík mosása során eltávozik a nem kötött sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum, és a csíkokhoz hidrogén-peroxidot és 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó szubsztrátoldat adódik. Hidrogén-peroxid jelenlétében a kötődött sztreptavidin-tormaperoxidáz katalizálja a TMB kék színű komplexszé történő oxidációját, amely a hibridizációkor kicsapódik a megfelelő próbák helyén. A LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkot azután szemmel lehet leolvasni a kék sávok mintázatának a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test referenciamutatóval való összehasonlítása révén. REAGENSEK AmpliLute Liquid Media Extraction Kit EXTRN 50 teszt AmpliLute folyékony táptalaj extraháló készlet P/N: CAR μg (Hordozó RNS) Szintetikus RNS, liofilizált (Adjon hozzá AVE-t.) PK 1 1,25 ml (Proteináz K) Proteináz K, szerinproteáz, tritirachium album Xn Proteinase K + Ártalmas R: 36/37/38-42/43 Szem- és bőrizgató hatású, izgatja a légutakat. Belélegezve és bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). S: /37 A keletkező permetet nem szabad belélegezni. A bőrrel való érintkezés kerülendő. Ha szembe jut, bő vízzel azonnal ki kell mosni és orvoshoz kell fordulni. Megfelelő védőruházatot és védőkesztyűt kell viselni. AVE (Eluáló puffer) RNáz-mentes víz < 0,09% nátrium-azid AW2 (Mosópuffer 2) Trisz-HCl puffer < 0,09% nátrium-azid (Adjon hozzá abszolút etanolt.) ATL (Szövetroncsoló puffer) EDTA 10% nátrium-dodecil-szulfát 4 2 ml 1 13 ml 1 10 ml HU 3 Doc Rev. 11.0

4 AL (Roncsoló puffer) 50% guanidin HCl Xn 25 50% guanidin HCl ml Ártalmas R: 22-36/38 Lenyelve ártalmas. Szem- és bőrizgató hatású. S: Élelmiszertől, italtól és állati takarmánytól távol tartandó. Ha szembe jut, bő vízzel azonnal ki kell mosni és orvoshoz kell fordulni. Megfelelő védőruházatot kell viselni. Lenyelése esetén azonnal orvoshoz kell fordulni, az edényt/csomagolóburkolatot és a címkét az orvosnak meg kell mutatni. EXT 50 db (Oszloptöltet, 3 ml) VC 50 db (Vákuumcsatlakozók) ELT 50 db (Elúciós csövek, 1,5 ml) CLM 50 db (QIAamp MinElute oszlopok) Kvarcmembrán LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT 48 teszt LINEAR ARRAY HPV genotipizáló teszt (P/N: ) HPV MMX 4 0,58 ml (LINEAR ARRAY HPV master mix) Trisz-puffer kálium-klorid < 0,02% AmpliTaq Gold DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) < 0,001% datp, dctp, dutp, dgtp, dttp < 0,001% upstream és downstream primerek (biotinilált) 0,06% nátrium-azid HPV Mg 2+ 4 x 0,125 ml (LINEAR ARRAY HPV magnéziumoldat) < 1% magnézium-klorid amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid HPV (+) C 4 0,5 ml (LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll) Trisz-HCl puffer EDTA < 0,002% poli ra RNS (szintetikus) < 0,001% nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális), amely HPV-szekvenciát tartalmaz < 0,001% nem fertőző plazmid DNS (mikrobiális), amely human ß-globin-szekvenciákat tartalmaz 0,05% nátrium-azid HPV ( ) C 4 0,5 ml (LINEAR ARRAY HPV negatív kontroll) Trisz-HCl puffer EDTA < 0,002% poli ra RNS (szintetikus) 0,05% nátrium-azid HU 4 Doc Rev. 11.0

5 HPV Strip (LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csík) HPV DNS próbákkal és 1 humán ß-globin DNS próbával fedett nylon csík (magas és alacsony próba koncentrációk) LINEAR ARRAY Detection Kit LA DK LINEAR ARRAY kimutatási készlet (P/N: ) DN (Denaturáló oldat) 1,6% nátrium-hidroxid EDTA Timolkék Xi 1,6% (w/w) nátrium-hidroxid teszt 96 teszt 2 12 ml Irritatív SDS (SDS-koncentrátum) 20% nátrium-lauril-szulfát (SDS) 1% ProClin 150 konzerváló SSPE (SSPE-koncentrátum) Nátrium-foszfát oldat Nátrium-klorid EDTA 1% ProClin 150 konzerváló SA-HRP (Sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum) Sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum ACES puffer Nátrium-klorid 1% ProClin 150 konzerváló CIT (Citrátkoncentrátum) citrátoldat SUB A (Szubsztrát A) citrátoldat 0,01% hidrogén-peroxid 0,1% ProClin 150 konzerváló SUB B (Szubsztrát B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin (TMB) 40% dimetil-formamid (DMF) T 40% (w/w) dimetil-formamid (DMF) 4 27 ml ml 2 2 ml 2 36 ml ml 3 40 ml Mérgező R: 61-20/21-36 A születendő gyermekre ártalmas lehet. Belélegezve és bőrrel érintkezve ártalmas. Szemizgató hatású. S: Kerülni kell az expozíciót használata előtt szerezze be a külön használati utasítást. Baleset vagy rosszullét esetén azonnal orvoshoz kell fordulni. Ha lehetséges, a címkét meg kell mutatni HU 5 Doc Rev. 11.0

6 FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. A vizsgálatot cobas PCR sejtminta-tápközeg vagy PreservCyt folyadék segítségével gyűjtött cervicalis mintákkal kell végezni. C. Ne pipettázzon szájjal. D. Ne egyen, igyon, vagy dohányozzon laboratóriumi munkaterületeken. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. Alaposan mosson kezet minták és tesztreagensek kezelése után. E. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és DNSszennyezését Steril eldobható pipetták, DNS-mentes és DNáz-mentes pipetta hegyek használata ajánlott. F. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. G. A fel nem használt reagensek és a hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. H. Ne használja a készletet a lejárati idő után. I. Biztonsági adatlapok (SDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Roche-irodában. J. A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveleteket a reagens-előkészítéssel kell kezdeni, és a minta-előkészítéssel folytatni. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munka területen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagens-előkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos használni mintaelőkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. K. A mintákat fertőzőnek kell tekinteni, tehát kezelésüket a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 16 című dokumentumban, illetve az M-29-A3 jelű CLSI-dokumentumban 17 ismertetett biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva kell végezni. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. MEGJEGYZÉS: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. L. AW2, AVE, HPV MMX, HPV Mg 2+, HPV ( ) C és HPV (+) C nátrium-azidot tartalmaz. A nátriumazid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. M. Viseljen szemvédőt, laboratóriumi védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt a következő anyagok kezelése során: AL, PK, HPV MMX, HPV Mg 2+, DN, SA-HRP, SUB A, SUB B és szubsztrát munkareagens (kevert SUB A és SUB B reagens). Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. N. A SUB B és a szubsztrát munkareagens dimetil-formamidot tartalmaz, amelyről ismert, hogy nagy orális adagban mérgező, továbbá a születendő gyermekre nézve ártalmas hatású lehet. A bőrrel való érintkezést, a gőzök belégzését és az anyag lenyelését el kell kerülni. Ha mégis előfordul a bőrrel érintkezés, gondosan mossa le szappanos vízzel, és azonnal forduljon orvoshoz. O. Az AL guanidin hidrokloridot tartalmaz, amelyből fehérítővel való vegyülés során erősen reaktív vegyületek képződhetnek. Ha ezt a puffert tartalmazó folyadék kiömlik, a takarításhoz megfelelő laboratóriumi tisztítószert és vizet használjon. Ha a kiömlött folyadék potenciálisan fertőző ágenst tartalmaz, az érintett területet először laboratóriumi tisztítószerrel és vízzel takarítsa le, azután használjon 0,5% nátrium-hipokloritot. AL tartalmú hulladékhoz ne adjon közvetlenül fehérítőt vagy savas oldatot. P. Negatív nyomás alatt lévő üveg vagy műanyag tartályok használat során berobbanhatnak, mely személyi sérüléshez vezethet. Szemvédelem erősen ajánlott, valahányszor részleges negatív nyomás alatt lévő üveg vagy műanyag tartályokat használunk, hogy védjen a sérülések ellen. Csak speciálisan erre az alkalmazásra tervezett tartályokat szabad használni. Ne használjunk azt HU 6 Doc Rev. 11.0

7 a tartályt vákuum alatt való alkalmazás során, amelyet nem arra terveztek, hogy bírják a vákuumot; ha a tartály karcos, csorbult vagy megrepedt; ha a tartály úgy van rögzítve, hogy ezáltal fokozza a nyomást; vagy ha a tartály kézben van tartva. Q. A LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test vizsgálathoz csak LINEAR ARRAY HPV master mix használható. Az AMPLICOR HPV master mix nem használható a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test vizsgálattal. TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK A. Ne fagyassza le a reagenseket, hacsak másképp nincs említve. B. Tárolja az Amplilute folyékony táptalaj extraháló készletből származó CLM-et és PK-t 2 8 C-on. A többi AmpliLute folyékony táptalaj extraháló készletből származó reagenst tárolja 2 25 C-on. Felbontás után a PK fel nem használt része legfeljebb 2 hónapig tárolható 2 8 C-on, az ATL és az AL legfeljebb 2 hónapig tárolható 2 25 C-on, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. A CAR az AVE-ban való oldást követoen 2 8 C-on legfeljebb 24 óra hosszat tárolható, vagy kis részletekben 20 C-ra fagyasztva tárolható legfeljebb 2 hónapig, vagy a lejárati dátumig, amelyik elobb következik. Az etanol hozzáadását követoen az AW2 fel nem használt részei tárolhatók 2 25 C-on legfeljebb 2 hónapig, vagy a lejárati dátumig, amelyik elobb következik. Ha az oldott CAR-t az AL-hez adjuk, az AL munkareagens 2 8 C-on legfeljebb 48 óráig tárolható. C. Tárolja a HPV MMX-t és a HPV Mg 2+ -t 2 8 C-on. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A master mix munkareagenst (HPV Mg 2+ -t HPV MMX-hez hozzáadva készül) 2 8 C-on kell tárolni, és az elkészítést követően 6 órán belül fel kell használni. D. Tárolja a HPV ( ) C-t és HPV (+) C-t 2 8 C-on. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontás után a fel nem használt részt ki kell dobni. E. Tárolja a HPV Strip 2 8 C-on. Felbontás nélkül ez a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a fel nem használt csíkokat ki kell dobni. F. Tárolja a DN-t 2 25 C-on. Felbontás nélkül, a DN a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a DN 2 25 C-on 3 hónapig stabil(vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik.) G. Tárolja a CIT, SA-HRP, SUB A és SUB B reagenseket 2 8 C-on. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően ezek a reagensek 2 8 C-on 1 hónapig stabilak (vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik). H. Tárolja az SDS és SSPE reagenseket 2 8 C-on. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően ezek a reagensek 2 8 C-on 1 hónapig stabilak (vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik). 2 8 C-on való tárolás során az SDS és SSPE reagensekben csapadék képződik. Felhasználást megelőzően melegítse 53 C ± 2 C-ra maximum 30 percig, és a csapadék feloldása céljából erőteljesen keverje az oldatot. Az SDS és SSPE desztillált vagy ioncserélt vízzel való hígítással készített hibridizációs és mosó munkapufferek tiszta, zárt műanyag tartályban tárolandók, és az elkészítéstől számított 30 napig stabilak. I. Konjugátum munkaoldat frissen kell elkészíteni minden nap SA-HRP és a szobahőmérsékletű mosó munkapuffer összekeverésével és 3 óráig stabil szobahőmérsékleten. J. Szubsztrát munkareagenst frissen kell elkészíteni minden nap SUB A és SUB B összekeverésével, és 3 óráig stabil szobahőmérsékleten, fénytől védve. A SUB A-t, SUB B-t vagy a szubsztrát munkareagenst ne tegye ki fémeknek, oxidáló anyagoknak vagy direkt fénynek. K. CIT desztillált vagy ioncserélt vízzel való hígításával készített citrát munkapuffer szobahőmérsékleten tiszta, zárt tartályban tárolandók, és az elkészítéstől számított 30 napig stabilak. A KÉSZLET TARTALMA A. AmpliLute Liquid Media Extraction Kit AmpliLute folyékony táptalaj extraháló készlet (P/N: ) CAR (Hordozó RNS) PK (Proteináz K) AVE (Eluáló puffer) AW2 (Mosópuffer 2) ATL (Szövetroncsoló puffer) EXTRN HU 7 Doc Rev. 11.0

8 AL (Roncsoló puffer) EXT (Oszloptöltet, 3 ml) VC (Vákuumcsatlakozók) ELT (Elúciós csövek, 1,5 ml) CLM (QIAamp MinElute oszlopok) B. LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test LA HPV GT LINEAR ARRAY HPV genotipizáló teszt (P/N: ) HPV MMX (LINEAR ARRAY HPV master mix) HPV Mg 2+ (LINEAR ARRAY HPV magnéziumoldat) HPV (+) C (LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll) HPV ( ) C (LINEAR ARRAY HPV negatív kontroll) HPV Strip (LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csík) Referenciamutató (LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test referenciamutató) C. LINEAR ARRAY Detection Kit LA DK LINEAR ARRAY kimutatási készlet (P/N: ) DN (Denaturáló oldat) SDS (SDS-koncentrátum) SSPE (SSPE-koncentrátum) SA-HRP (Sztreptavidin-tormaperoxidáz konjugátum) CIT (Citrátkoncentrátum) SUB A (Szubsztrát A) SUB B (Szubsztrát B) D. 24-Well Tray with Lid 24 üreges tálca fedéllel (P/N: ) SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Preamplifikálás Reagens-előkészítő terület Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700-hez használja a következőket: MicroAmp reakciócsövek (AB# N ), kupakok (AB# N vagy AB# N ), tartó/rögzítők (AB# ) vagy Ready-Pak MicroAmp szerelvény (AB# ) és aljzat (AB# N ) Műanyag újrazárható tasak Eppendorf Multipette pipetta* 1,0 ml vagy 1,25 ml Eppendorf Combitip plusz (steril, egyenként csomagolt)* HU 8 Doc Rev. 11.0

9 Pipettahegyek (50 μl-től 125 μl-ig)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos DNS és DNáz-mentes hegyek Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő terület Eppendorf Multipette pipetta* 1,0 ml és 5,0 ml Eppendorf Combitip plusz (steril, egyenként csomagolt)* Pipettahegyek (20 μl, 200 μl és 1000 μl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos DNS és DNáz-mentes hegyek Steril 2,0 ml-es csavaros tetejű csövek (Sarstedt vagy ennek megfelelő) Csőállvány (Sarstedt vagy ennek megfelelő) Abszolút ethanol ACS követelményeinek megfelelően Steril polipropilén kúpos csövek; 15 ml és 50 ml: (Corning és vagy ennek megfelelő) Steril, egyszer használatos, szerológiai pipetták (5 ml, 10 ml és 25 ml) Pipet-Aid (Drummond vagy ennek megfelelő) Mikrocentrifuga (max. RCF g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M vagy ennek megfelelő Vortex keverő 56 C ± 2 C és 70 C ± 2 C szárazfűtőblokkok Vákuumberendezés (pl. QIAvac 24, katalógusszám 19403; QIAvac 24 Plus, katalógusszám QIAvac csatlakozórendszerrel, katalógusszám 19419) Vákuumforrás [pl., mbar vákuum előállítására képes szivattyú, KNF Neuberger LABOPORT típusa: UN840.3FTP (115 V, 60 Hz) vagy típusa: N840.3FT.18 (230 V, 50 Hz) vagy QIAGEN vákuumpumpa P/N: (110 V, 60 Hz), (115 V, 60 Hz) vagy (230 V, 50 Hz)] a berendezéshez csatlakoztatva Vákuumszabályzó (QIAGEN katalógusszám 19530), opcionális Gyűjtőcsövek (2 ml, QIAGEN katalógusszám 19201), opcionális Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Posztamplifikálás Amplifikálási/Kimutatási terület Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, P/N: ) Steril, egyszer használatos, polisztirol szerológiai pipetták (5 ml, 10 ml és 25 ml) Többcsatornás pipetta (kapacitás 100 μl)* Pipettahegyek (20 μl, 200 μl és 1000 μl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos DNS és DNáz-mentes hegyek Vortex keverő Desztillált vagy ioncserélt víz 53 C ± 2 C 60 RPM fordulatszámra képes rázó vízfürdő (Bellco Hotshaker Plus, P/N: (115 V, 60 Hz) vagy P/N: (230 V, 50 Hz) vagy ennek megfelelő) 53 C ± 2 C vízfürdő Megközelítőleg 60 RPM fordulatszámra képes orbitális rázó Csipesz, rozsdamentes acél (VWR #: vagy ennek megfelelő) Víz-, vegyszer- és hőálló permanens tintájú toll (Sharpie Industrial Super Permanent Marker, P/N: vagy ennek megfelelő) Vákuumszívó készülék megfelelő folyadékgyűjtő tárolóval (PYREX márkájú nehéz falú szűrő palack, Corning P/N: L vagy ennek megfelelő) 12 csatornás tű áramláselosztó/szívó (Art Robbins Instruments, P/N: ) Ólomgyűrűsúly (~0,5 kg) (VWR #: vagy ennek megfelelő) 1 l, 2 l, 3 l tároló flakonok vagy palackok 100 ml, 250 ml, 500 ml főzőpoharak 100 ml, 250 ml, 500 ml, 1 l mérőhengerek Eppendorf Multipette pipetta* 50 ml Eppendorf Combitip plus (steril, egyenként csomagolt)* HU 9 Doc Rev. 11.0

10 50 ml adapter Eppendorf Biopur (P/N: ) RBS35 Tálcatisztító oldat (VWR #: PI27952 / Lyukasztás #: 27952) Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes * A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos DNS és DNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését. A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA MEGJEGYZÉS: Valamennyi mintát fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A. A minta levétele Csak a cobas PCR sejtminta-tápközegbe vagy PreservCyt folyadékba levett cervicalis mintákat validálták a LINEAR ARRAY HPV Genotyping Testtel való használatra. A cervicalis sejtmintáknak a cobas PCR sejtminta-tápközegbe vagy PreservCyt folyadékba való levételéhez kövesse a gyártó utasítását. B. A minta transzportja A cobas PCR sejtminta-tápközegbe vagy PreservCyt folyadékba levett cervicalis sejtminták 2 30 C-on transzportálhatók. A cervicalis sejtminták transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak 18. C. A minta tárolása A cobas PCR sejtminta-tápközegben vagy PreservCyt oldatban gyűjtött cervicalis sejtminták 2 30 C között, legfeljebb 6 hónapig tárolhatók. HASZNÁLATI UTASÍTÁS MEGJEGYZÉS: Hagyja a reagenseket, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet (15 30 C) használat előtt, hacsak másképp nem említik. A vizsgálati eljárás megkezdése előtt valamennyi reagenst vizsgáljon meg, hogy elégséges térfogat áll-e rendelkezésre. MEGJEGYZÉS: A cervicalis sejtmintáknak szobahőmérsékletűnek kell lenniük (15 30 C) használat előtt. MEGJEGYZÉS: Használjon aeroszolbarrieres pipettákat vagy pozitív kiszorításos hegyeket, ahol indokolt. A szelektív amplifikálás érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Minden egyes AmpliLute folyékony táptalaj extraháló készlet 50 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz. Minden egyes LINEAR ARRAY Detection Kit 96 vizsgálatra elegendő reagenst tartalmaz. Minden egyes LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi futtatásnak legalább egy LINEAR ARRAY HPV negatív kontrollt és egy LINEAR ARRAY HPV pozitív kontrollt kell tartalmaznia minden egyes teszt futtatáshoz 22 minta esetén (lásd Minőség-ellenőrzés ). Az amplifikálási reagensek 12 tesztre elegendő egyszer használatos üvegekben vannak. LINEAR ARRAY HPV negatív kontroll és a LINEAR ARRAY HPV pozitív kontroll egyszer használatos üvegekben vannak. A LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkok 12 tesztre elegendő egyszer használatos tasakokban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. Munkafolyamat: Az LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test egy vagy két nap alatt végezhető el. Ha a vizsgálatot egyetlen munkanap alatt kell elvégezni, kövesse sorban az utasításokat A-tól D-ig. Ha a vizsgálatot 2 nap alatt kell elvégezni, a műveletsor megszakítható a Minta és kontroll előkészítése (B pont) vagy az Amplifikálás (C pont) után. Ha a minta és kontroll előkészítését az 1. napon, az amplifikálást és kimutatást pedig a 2. napon kívánja elvégezni akkor kövesse a B pont lépéseit 1-től 29-ig, és tárolja a feldolgozott mintákat és kontrollokat a B.29. lépésben leírtaknak megfelelően. A 2. napon kezdje az A ponttal (Reagens előkészítése), azután olvassza fel a mintákat és kontrollokat szobahőmérsékleten, majd folytassa a B.30. lépéssel. MEGJEGYZÉS: Ne tegye ki a feldolgozott mintákat és kontrollokat több, mint 1 fagyasztás/olvasztás ciklusnak. Ha a minta- és kontroll-előkészítést és amplifikálást az 1. napon, a kimutatást pedig a 2. napon kívánja elvégezni, akkor kövesse az A pont (Reagens előkészítése), B pont (Minta és kontroll előkészítése) és C pont (Amplifikálás) lépéseit az 1. napon, és tárolja a denaturált amplikonokat 2 8 C-on a C.6. lépésben leírtaknak megfelelően. A 2. napon folytassa a D ponttal (Genotípus kimutatása LINEAR ARRAY HPV csíkkal) HU 10 Doc Rev. 11.0

11 A. Reagens előkészítéshez Munkaterület: Preamplifikálás Reagens-előkészítő terület 1. Határozza meg a minta- és a kontrollvizsgálatokhoz szükséges reakciócsövek számát. Helyezze a csöveket a MicroAmp tartóba és rögzítse őket. 2. Készítse el a master mix munkareagenst 125 μl HPV Mg 2+, egy ampulla HPV MMX reagenshez való hozzáadásával. A master mix térfogatát nem szükséges megmérnie. Mérjen 125 μl HPV Mg 2+ oldatot egy teljes üveg HPV MMX reagenshez. Csavarja rá a kupakot, majd a cső szöri fordítgatásával keverje jól össze az oldatokat. A master mix munkareagenst ne vortexelje. A HPV Mg 2+ rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön arról, hogy a HPV Mg 2+ oldatot a HPV MMX reagenshez ada. A maradék HPV Mg 2+ oldatot dobja ki. 3. Mérjen valamennyi reakciócsőbe 50 μl master mix munkareagenst Multipette pipettával, illetve aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával. Ezután ne tegye a csövekre a kupakokat. 4. Helyezze a master mix munkareagenst és a megfelelő számú reakciócső kupakot tartalmazó tartót egy újrazárható műanyag tasakba, és gondosan zárja le a műanyag tasakot. Menjen át a Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő területre. A minta és kontroll előkészítése befejezéséig tárolja a master mix munkareagenst tartalmazó tartó(ka)t 2 8 C-on a Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő területen. A master mix munkareagens a reakció csövekben lezárt műanyag tasakban 2 8 C-on 6 óra hosszat stabil. B. Minta és kontroll előkészítéshez Munkaterület: Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő terület 1. Állítsa be a hőmérsékletét egy szárazfűtőblokknak 56 C ± 2 C-ra. 2. Állítsa be a hőmérsékletét egy másik szárazfűtőblokknak 70 C ± 2 C-ra. 3. Hagyja, hogy a reagensek, minták és kontrollok felvegyék a szobahőmérsékletet (legalább 15 perc). Ha csapadék képződött az ATL-ben vagy AL-ben, oldja fel 70 C-ra melegítve és finoman kavargassa. MEGJEGYZÉS: A B.4. B.6. lépéseket a minták/kontrollok PK és ATL reagensekkel való inkubálása (B.10. lépés) alatt elvégezheti μl AVE hozzáadásával oldja fel a liofilizált CAR-t. Vortexelje 10 másodpercig. Feliratozza és dátumozza meg az ampullát. MEGJEGYZÉS: A feloldott CAR 2 8 C-on 24 óráig stabil, vagy kis részletekben 20 C-ra fagyasztva 2 hónapig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. Ne fagyassza-olvassza a feloldott CAR-t 3-nál többször. 5. Mérjen 30 ml abszolút etanolt az AW2-höz. Feliratozza és dátumozza meg a palackot. Keverje a feloldott AW2-t rázással. MEGJEGYZÉS: A feloldott AW2 szobahőmérsékleten 2 hónapig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. 6. Készítse elő az AL munkaoldat megfelelő térfogatú AL-ban oldott CAR-t ahogy az 1. táblázat mutatja. Óvatosan keverje, 10-szer felforgatva a csövet. Habzás elkerülése miatt ne vortexelje. 1. táblázat AL munkaoldat készítése Elvégzendő minta/kontroll vizsgálatok száma Reagensek CAR (ml) 0,04 0,07 0,10 0,13 0,16 0,20 0,25 AL (ml) 4,0 7,0 10,0 13,0 16,0 20,0 25,0 MEGJEGYZÉS: Az AL munkaoldat 2 8 C-on 48 óráig stabil. 7. Minden egyes feldolgozandó mintához és kontrollhoz címkézzen meg egy-egy 2 ml-es csavarókupakos csövet. MEGJEGYZÉS: NE használjon 1,5 ml-es csavarókupakos csövet vagy bármely kúpalakú csövet, mivel az zavarja az inkubálás alatti hőátadást, és inkomplett roncsolást eredményezhet. 8. Mérjen be 80 μl ATL-t mindegyik csőbe HU 11 Doc Rev. 11.0

12 9. Minden mintát és kontrollt 10 másodpercig vortexeljen. Adjon minden mintából és kontrollból 250 μl-t a megfelelően címkézett csőbe. 10. Mérjen be 20 μl PK-t mindegyik csőbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket 10 másodpercig. Inkubálja a csöveket 56 C ± 2 C-on 30 percig szárazfűtőblokkban. 11. A minták és kontrollok inkubálása alatt szerelje össze a QIAvac 24 (vagy QIAvac 24 Plus) vákuumberendezést a QIAGEN vákuumberendezés kézikönyve szerint. Vegyen ki egy-egy CLM-et minden egyes minta és kontroll számára a buborék csomagolásból, és címkézze fel őket. Őrizze meg a hulladékgyűjtő csöveket a B.23. lépésben való használathoz. Nyissa ki a CLM tetejét és tegye be a VC-be. Helyezze bele az EXT-et a CLM-be. 12. Az 56 C ± 2 C-on való inkubálást követően mérjen 250 μl AL munkaoldatot minden egyes csőbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket maximum sebességen 10 másodpercig. MEGJEGYZÉS: Az AL munkaoldat hozzáadásakor egy fehér csapadék képződhet. A csapadék nem zavarja a minta- és kontroll-előkészítő eljárást, és a következő inkubálás alatt fel fog oldódni. 13. Inkubálja a csöveket 70 C ± 2 C-on 15 percig szárazfűtőblokkban. Az inkubálás ideje alatt időnként vortexelje a mintákat és kontrollokat. 14. A minták és kontrollok 70 C ± 2 C-on való inkubálását követően mérjen 300 μl abszolút etanolt minden egyes csőbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket maximum sebességen 15 másodpercig. 15. Inkubálja a csöveket 5 percig szobahőmérsékleten. Impulzuscentrifugázza le a csöveket egy asztali centrifugán maximum RPM mellett. 16. Vigye át a lizátumot minden egyes csőből a megfelelő CLM-re. Hagyja inkubálódni legalább 1 percig. 17. Kapcsolja be a vákuumszivattyút. Az összes lizátum eltávolításához csatlakoztassa a vákuumot a berendezésre, és folytassa a szívást legalább még 1 percig. Engedje ki a vákuumot a berendezésből a QIAGEN vákuumberendezés kézikönyvében leírtak szerint. MEGJEGYZÉS: Ha egy minta vagy kontroll lizátuma nem ment át maradéktalanul a membránon, helyezze a CLM-et egy 2 ml-es gyűjtő csőbe, csavarja rá a kupakot, és centrifugálja teljes sebességen 1 percig, illetve amíg a lizátum maradéktalanul át nem megy. További 2 ml-es gyűjtőcsövek külön megvásárolhatóak (lásd SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK ). 18. Mérjen 750 μl AW2-t mindegyik CLM-re. Hagyja inkubálódni legalább 1 percig. 19. Kapcsolja be a vákuumszivattyút. Az összes folyadék eltávolításához csatlakoztassa a vákuumot a berendezésre, és folytassa a szívást legalább még 1 percig. Engedje ki a vákuumot a berendezésből a QIAGEN vákuumberendezés kézikönyvében leírtak szerint. 20. Mérjen 750 μl abszolút etanolt mindegyik CLM-re. Hagyja inkubálódni legalább 1 percig. 21. Kapcsolja be a vákuumszivattyút. Az összes folyadék eltávolításához csatlakoztassa a vákuumot a berendezésre, és folytassa a szívást legalább még 1 percig. Engedje ki a vákuumot a berendezésből a QIAGEN vákuumberendezés kézikönyvében leírtak szerint. 22. Óvatosan vegye ki az EXT-et a CLM-ből. Dobja ki az EXT-et. MEGJEGYZÉS: A keresztszennyeződés elkerülése végett gondosan ügyeljen az EXT eltávolításakor, hogy ne érjen a szomszédos CLM-hez. 23. Helyezzen minden egyes CLM-et a hulladék gyűjtő csőbe (a B.11. lépésből), és zárja le a fedőt. Centrifugálja őket maximum RPM mellett 3 percig. 24. Címkézzen fel egy ELT-et minden egyes mintához és kontrollhoz. 25. Dobja ki a hulladékgyűjtő csöveket, és helyezzen minden egyes CLM-et a megfelelően címkézett ELT-be. 26. Nyissa ki a fedőt minden egyes CLM-en, és inkubáljon szobahőmérsékleten 15 percig. 27. Mérjen 120 μl AVE-t mindegyik CLM-re. Zárjon le minden egyes fedelet. MEGJEGYZÉS: Minden egyes CLM-re való mérést megelőzően győződjön meg arról, hogy az AVE szobahőmérsékletű. 28. Inkubáljon szobahőmérsékleten 5 percig, majd centrifugálja őket maximum RPM mellett 1 percig. 29. Vegye ki a CLM-et a csövekből, dobja ki, a csövekre pedig csavarja rá a kupakokat. Amplifikálja a feldolgozott mintákat és kontrollokat azonnal, vagy tárolja 2 8 C-on, illetve -20 C-on lefagyasztva. A feldolgozott minták és kontrollok szobahőmérsékleten 6 óra hosszat, 2 8 C- on HU 12 Doc Rev. 11.0

13 7 napig, illetve -20 C-on vagy az alatt 8 hétig tárolhatók, legfeljebb egy fagyasztás/olvasztási ciklust végezve. Több, mint egy fagyasztás/olvasztás ciklus jelveszteséget eredményezhet. 30. Mérjen minden egyes feldolgozott mintából és kontrollból 50 μl-t a megfelelő master mix munkareagenst tartalmazó amplifikációs csövekbe. Használjon új aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Csavarja az amplifikációs csövekre a kupakokat. MEGJEGYZÉS: Fagyasztva tárolt feldolgozott minták és kontrollok használatakor hagyja a fagyasztott feldolgozott mintákat és kontrollokat szobahőmérsékletre felolvadni. Felolvadás után vortexeljen minden mintát és kontrollt erőteljesen 10 másodpercig. Ha a feldolgozott minták és kontrollok 2 8 C-on vannak tárolva, vortexeljen minden feldolgozott mintát és kontrollt erőteljesen 10 másodpercig, mielőtt a master mix munkaoldathoz adja. MEGJEGYZÉS: Az Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700-en az amplifikációt 45 percen belül meg kell kezdeni, miután a feldolgozott mintát és kontrollt a master mix munkaoldathoz adtuk. 31. Vigye át az amplifikációs tartóban lévő előkészített mintákat és kontrollokat az Amplifikálási/ Kimutatási területre. A feldolgozott minták és kontrollok maradéka a B.29. lépéseknek megfelelően kell tárolni. C. Amplifikáláshoz Munkaterület: Posztamplifikálás Amplifikálási/Kimutatási terület 1. Helyezze a tartó/rögzítő szerelvényt a PCR-készülékblokkba. 2. Az LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test kivitelezéséhez az Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 berendezést az alábbiak szerint programozza: HOLD program: 2 perc 50 C HOLD program: 9 perc 95 C CYCLE program (40 ciklus): 30 másodperc 95 C, 1 perc 55 C, 1 perc 72 C (Hőmérsékletváltás sebessége = 50%) HOLD program: 5 perc 72 C HOLD program: 72 C időkorlát nélkül A ciklus (CYCLE) programokban állítsa a hőmérséklet-váltási időtartamot 50%-ra. Kívánság szerint írja be a módszer (Method name) és a felhasználó nevét (User name). A PCRkészülék programozásával és működtetésével kapcsolatos további információkat illetően forduljon az Applied Biosystems Gold-plated 96-Well GeneAmp PCR System 9700 felhasználói kézikönyvéhez. 3. Indítsa a METHOD programot. A Method Option menüben állítsa a Ramp Speed -et Max -ra és a Reaction Volume -t 100 μl -re. Nyomja meg ismét a START-ot. A program mintegy 3 óra 15 percig fut. 4. Vegye ki a tartót a PCR-készülékből az utolsó HOLD program alatt 4 órán belül, helyezze a MicroAmp aljzatba, és folytassa azonnal az 5. lépéssel. Ne hagyja a reakciócsöveket a PCRkészülékben 4 óránál tovább. NE VIGYEN AMPLIFIKÁLT MINTÁKAT A PREAMPLIFIKÁLÁSI TERÜLETRE. AZ AMPLIFIKÁLT KONTROLLOK ÉS MINTÁK A POTENCIÁLIS SZENNYEZŐDÉS FŐ FORRÁSAINAK TEKINTENDŐK. 5. Az amplifikálási termékek aeroszolképződését elkerülendő, óvatosan vegye le a kupakokat a reakciócsövekről. Mérjen azonnal a reakciócsövek első oszlopába (vagy sorába) 100 μl DN-t aeroszolbarrierrel ellátott többcsatornás pipettával, és keverje össze ötszöri fel-le pipettázással. Ismételje meg az eljárást új hegysorral minden egyes oszlop (vagy sor) esetén. 6. A denaturált amplikonok szobahőmérsékleten legfeljebb 5 óra hosszat tarthatóak a kimutatást (D pont) megelőzően. Ha a kimutatásra 5 órán belül nem kerülhet sor, akkor csavarjon új kupakokat a csövekre, és tárolja a denaturált amplikonokat 2 8 C-on legfeljebb 7 napig. D. Genotípus kimutatása LINEAR ARRAY HPV csíkkal Munkaterület: Posztamplifikálás Amplifikálási/Kimutatási terület MEGJEGYZÉS: A kimutatás alatt ne hagyja a mintákat egyik tálcából a másikba fröccsenni. Ne engedje, hogy a vízfürdőből a víz a tálcákba fröccsenjen. Ne rakja egymásra a 24 üreges tálcákat. 1. Valamennyi kimutatási reagenst melegítsen szobahőmérsékletre. 2. Melegítse elő a vízfürdőt 53 C ± 2 C-ra HU 13 Doc Rev. 11.0

14 3. Melegítse elő a rázó vízfürdőt 53 C ± 2 C -ra megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. Győződjön meg róla, hogy a 24 üreges tálca hevítéséhez elegendő víz van a fürdőben, de nem annyira sok, hogy belefröccsenjen a 24 tálcába. A víznek a külső üregmélység 1/4-éig vagy a 24 üreges tálcán 0,5 cm-ig kell érnie. MEGJEGYZÉS: Álpozitív eredményeket adhat, ha a vízfürdő vize nem megfelelően érintkezik a 24 üreges tálcával. 4. Készítse el a hibridizációs munkapuffert a következők szerint: Az SSPE és SDS oldatokat vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására a vízfürdőben melegítse 53 C ± 2 C-ra. Adjon 100 ml SSPE oldatot 388 ml ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. Mérjen hozzá 12,5 ml SDS oldatot, és keverje jól össze. A hibridizációs munkapuffer elegendő 100 LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkhoz. A hibridizációs munkapuffer szobahőmérsékleten tiszta tartályban tárolandó, és 30 napig stabil. 5. Készítse el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert a következők szerint: Az SSPE és SDS oldatokat vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására a vízfürdőben melegítse 53 C ± 2 C-ra. Adjon 133 ml SSPE oldatot 2520 ml ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. Mérjen hozzá 13,3 ml SDS oldatot, és keverje jól össze. A szobahőmérsékletű mosó munkapuffer elegendő 100 LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkhoz. A szobahőmérsékletű mosó munkapuffer szobahőmérsékleten tiszta tartályban tárolandó, és 30 napig stabil. 6. Készítse el a magas hőmérsékletű mosó munkapuffert a következők szerint: Minden csík számára különítsen el 5 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert (az előző lépésben előkészítve) és öntse bele egy megfelelő méretű tiszta média üvegbe. (pl. 24 csík futtatásához különítsen el 120 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert és öntse bele a médiapalackba.) A magas hőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes futtatás előtt frissen kell készíteni. 7. Melegítse a hibridizációs munkapuffert és magas hőmérsékletű mosó munkapuffert 53 C ± 2 C-os vízfürdőben legalább 15 percig. Hagyja a hibridizációs munkapuffert és magas hőmérsékletű mosó munkapuffert a vízfürdőben használatig. 8. Készítse el a citrát munkapuffert a következők szerint: A CIT oldatot vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására vízfürdőben melegítse 53 C ± 2 C-ra. Adjon 25 ml CIT oldatot 475 ml ioncserélt vagy desztillált vízhez. Keverje jól össze. A citrát munkapuffer elegendő 100 LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkhoz. A citrát munkapuffer szobahőmérsékleten tiszta tartályban tárolandó, és 30 napig stabil. 9. Vegye ki a szükséges számú LINEAR ARRAY HPV genotipizáló csíkot a HPV Strip tasakból tiszta csipesz segítségével. 10. Víz-, vegyszer- és hőálló permanens tintájú toll segítségével jelöljön meg minden egyes HPV Strip-et a megfelelő minta-, illetve kontrollazonosítóval. 11. Helyezzen minden egyes csíkot próbasorozatokkal felfelé a 24 üreges tálca megfelelő üregébe. 12. Mérjen 4 ml előmelegített hibridizációs munkapuffert minden egyes jelölt csíkot tartalmazó üregbe. 13. Aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával gondosan mérjen be 75 μl denaturált amplikont a megfelelő jelölt csíkot tartalmazó üregbe. Hintáztassa a tálcát óvatosan minden egyes bemérés között. Használjon új hegyet minden egyes amplikon hozzáadásához. 14. Fedje le a 24 üreges tálcát a fedéllel, és helyezze az 53 C ± 2 C -os rázó vízfürdőbe. Helyezzen egy kb. 0,5 kg-os ólomgyűrűsúlyt a tálcafedélre, hogy a 24 üreges tálca a rázó vízfürdőben a helyén maradjon. Hibridizáljon 30 percig megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 15. Hibridizáció alatt (14. lépés) készítse el a konjugátum munkaoldatot a következők szerint: Mérjen 15 μl SA-HRP oldatot 5 ml szobahőmérsékletű mosó munkapufferhez csíkonként. Keverje jól össze. A konjugátum munkaoldat szobahőmérsékleten tiszta tartályban tárolandó, és 3 óráig stabil. 16. Vegye ki a 24 üreges tálcát a rázó vízfürdőből, és vákuumleszívással távolítsa el a hibridizációs munkapuffert az üregekből. 17. Mérjen 4 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Óvatosan hintáztassa a 24 üreges 3 4-szer, hogy leöblítse a csíkokat, majd vákuumleszívással azonnal távolítsa el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 18. Mérjen 4 ml előmelegített magas hőmérsékletű mosópuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Töröljön le bármilyen lecsapódott folyadékot a tálca fedeléről tiszta papírtörlővel, helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és tegye vissza a 24 üreges tálcát az 53 C ± 2 C -os rázó vízfürdőbe. Helyezzen egy kb. 0,5 kg-os ólomgyűrűsúlyt a tálcafedélre, hogy a 24 üreges HU 14 Doc Rev. 11.0

15 tálca a rázó vízfürdőben a helyén maradjon. Inkubáljon 15 percig megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 19. Vegye ki a 24 üreges tálcát a rázó vízfürdőből, és vákuumleszívással távolítsa el a magas hőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 20. Mérjen 4 ml konjugátum munkaoldatot minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Töröljön le bármilyen lecsapódott folyadékot a tálca fedeléről tiszta papírtörlővel, helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és tegye a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra. Inkubáljon 30 percig szobahőmérsékleten (15 30 C) megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 21. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a konjugátum munkaoldatot az üregekből. 22. Mérjen 4 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Óvatosan hintáztassa a 24 üreges 3 4-szer, hogy leöblítse a csíkokat, majd vákuumleszívással azonnal távolítsa el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 23. Mérjen 4 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Töröljön le bármilyen lecsapódott folyadékot a tálca fedeléről tiszta papírtörlővel, helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és tegye a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra 10 percre megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 24. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 25. Mérjen 4 ml szobahőmérsékletű mosó munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és helyezze a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra 10 percre megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 26. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a szobahőmérsékletű mosó munkapuffert az üregekből. 27. Mérjen 4 ml citrát munkapuffert minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és helyezze a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra 5 percre megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 28. Készítse el a szubsztrát munkareagenst a következők szerint: Mérjen 4 ml SUB A reagenst 1ml SUB B reagenshez csíkonként. Keverje jól össze. A szubsztrát munkareagens szobahőmérsékleten, közvetlen fénytől védve tiszta tartályban tárolandó, és 3 óráig stabil. 29. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a citrát munkapuffert az üregekből. 30. Mérjen 4 ml szubsztrát munkareagenst minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. Helyezze a fedelet a 24 üreges tálcára, és helyezze a 24 üreges tálcát a szobahőmérsékletű orbitális rázóra 5 percre megközelítőleg 60 RPM rázási sebesség mellett. 31. Vegye le a 24 üreges tálcát az orbitális rázóról, és vákuumleszívással távolítsa el a szubsztrát munkareagenst az üregekből. 32. Mérjen 4 ml desztillált vagy ioncserélt vízhez minden egyes üregbe, mely csíkot tartalmaz. 33. Távolítsa el a csíkokat a 24 üreges tálcáról egy tiszta csipesz segítségével, helyezze tiszta és száraz felületre, és az értékelés előtt hagyja, hogy a csíkok legalább egy óráig, legfeljebb 72 óráig száradjanak a levegőn, szobahőmérsékleten. 24 üreges tálca tisztítása Munkaterület: Posztamplifikálás Amplifikálási/Kimutatási terület MEGJEGYZÉS: A 24 üreges tálcák eldobhatók vagy újrahasznosíthatók. A tálcák újrahasznosításához a következõ tisztítási eljárást kell követni minden használat után. 1. Készítsen 10%-os RBS35 oldatot úgy, hogy adjon 1 térfogatrész RBS35 oldatot 9 térfogatrész ioncserélt vagy desztillált vízhez. 2. Töltsön meg minden egyes tálcát a 10%-os oldattal, és hagyja ázni egy éjszakán át szobahőmérsékleten. 3. Öblítse le a tálcát alaposan desztillált vagy ioncserélt vízzel. 4. Használat előtt teljesen szárítsa meg a tálcát HU 15 Doc Rev. 11.0