Rendelési információ COBAS AMPLICOR HIM 48 Tests P/N: HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: US: 83369

Átírás

1 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 HIM IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. Rendelési információ COBAS AMPLICOR HIM 48 Tests P/N: HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 ART: US: Felhasználás célja COBAS AMPLICOR WB 500 Tests P/N: Wash Buffer ART: US: A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 (v1.5) egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a humán immundeficiencia vírus 1 (HIV-1) RNS mennyiségi meghatározására humán plazmában COBAS AMPLICOR Analizátor segítségével. A vizsgálat két minta-előkészítési eljárás, a standard és az ultraszenzitív eljárás segítségével képes a HIV-1 RNS mennyiségi meghatározására az kópia/ml tartományon. A vizsgálat a klinikai megjelenéssel és a betegség progressziójának egyéb laboratóriumi markereivel együtt a HIV-1-fertőzött betegek klinikai gondozásában nyújthat segítséget. A vizsgálat a kiindulási HIV-1 RNS-szint mérése révén használható a beteg prognózisának megállapítására, illetve az antiretrovirális kezelés során a plazma HIV-1 RNS-szint változásainak mérése révén az antiretrovirális kezelés hatásának monitorozására. A polimeráz-láncreakcióval (PCR) megmért HIV-1 RNS-szinteket használták egyebek között helyettes markerként az INVIRASE (saquinavirmezilát), CRIXIVAN (indinavir-szulfát), NORVIR (ritonavir) és FORTOVASE (saquinavir) proteáz inhibitor gyógyszerek, a VIRAMUNE (nevirapine), SUSTIVA (efavirenz), és ZIAGEN (abacavir) non-nukleozid reverz transzkriptáz inhibitor gyógyszerek, valamint az EPIVIR (lamivudin) reverz transzkriptáz inhibitor gyógyszer gyorsított FDA engedélyezési eljárásában. A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 nem való vér vagy vérkészítmények HIV-1-fertőzöttségének szűrésére, vagy diagnosztikus vizsgálatként HIV-1-fertőzés jelenlétének megerősítésére. P/N: /2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 1/52

2 A vizsgálat összegzése és magyarázata A humán immundeficiencia vírus (HIV) a szerzett immunhiányos szindróma [Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS)] kóroki ágense 1-3. A HIVfertőzés átvihető szexuális kontaktussal, fertőzött vérrel vagy vérkészítményekkel, illetve fertőzött anyáról a magzatra 4. A HIV átvitelétől számított 3 6 héten belül a fertőzött egyénekben rendszerint egy rövid, náthaszerű tünetekkel jellemezhető akut tünetegyüttes alakul ki, amely a perifériás vérben levő nagyfokú viraemiával kapcsolatos 5-8. A legtöbb fertőzött egyénben ezt egy HIV-specifikus immunválasz és a plazma viraemia csökkenése követi, rendszerint a tünetek felléptétől számított 4 6 héten belül 9,10. A szerokonverziót követően a fertőzött egyének típusosan egy klinikailag stabil, tünetmentes fázisba kerülnek, amely évekig tarthat A tünetmentes periódust állandó, alacsony szintű viraemia 14 és egy fokozatosan kialakuló CD4 + T limfocita hiány jellemzi, amely súlyos immunhiányhoz, halmozott opportunista fertőzések, malignomák kialakulásához, végül halálhoz vezet 15. Bár a fertőzés tünetmentes fázisában a vírusszintek a perifériás vérben viszonylag alacsonyak, úgy tűnik, hogy a vírus szaporodása és kiürülése egy dinamikus folyamat, amelynek során a nagyfokú vírustermelés és CD4 + sejtfertőzés egyensúlyban van a nagyfokú víruskiürüléssel, a fertőzött sejtek pusztulásával és a CD4 + sejtek utánképződésével, ezáltal mind a plazma viraemia, mind a CD4 + sejtek viszonylag stabil szintjeit eredményezve A perifériás vérben lévő HIV viraemia mennyiségi mérései megmutatták, hogy a magasabb vírusszintek a HIV-betegség klinikai progressziójának emelkedett kockázatával korrelálhatnak, és hogy a plazma vírusszintek csökkenése a klinikai progresszió csökkent kockázatával járhat együtt A vírusszintek mennyiségi meghatározása perifériás vérben történhet a HIV p24 antigén mérésével szérumban, a HIV kvantitatív tenyésztésével plazmából, vagy a vírus RNS direkt mérésével nukleinsav-amplifikációs vagy szignálamplifikációs technológiákat alkalmazva A p24 antigén a HIV elsőrendű magfehérjéje, és vagy szabadon vagy antip24 antitesthez kapcsolódva található a szérumban. A szabad p24 antigén kereskedelemben kapható enzim immunoassay-vel (EIA) mérhető, bár a p24 antigén haszna, mint vírusmennyiség marker, korlátozott, miután az antigén a tünetmentes betegek csupán 20%-ában, a tünetes betegek 40 50%-ában mutatható ki. Az antigén-antitest komplexeket disszociáló eljárások ugyan javítják a p24 vizsgálatok érzékenységét, mégis a vírusfehérje a legtöbb tünetmentes betegben kimutathatatlan marad 22. A plazmában lévő fertőző HIV normál donorokból származó aktivált perifériás vér mononukleáris sejtekbe (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) történő inokulációval tenyészthető. A plazmaminták hígítási sorával történő perifériás vér mononukleáris sejtinokuláció révén mennyiségi meghatározás végezhető. A vírusszintek monitorozásában a kvantitatív tenyésztés korlátozott haszonnal bír, miután a víruspartikulumoknak csak kis hányada fertőző in vitro. Tünetmentes egyénekben fertőző vírus gyakran nem mutatható ki 22. A HIV RNS mennyiségi meghatározása a plazmában olyan nukleinsavamplifikációs technológiákkal történhet, mint a polimeráz-láncreakció (PCR) A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 PCRtechnológiát alkalmaz, ezáltal maximális érzékenységet és dinamikus tartományt valósít meg a HIV-1 RNS EDTA-s vagy ACD-s antikoagulált plazmában való mennyiségi meghatározásához 24. 2/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

3 HIV-1 MONITOR Az eljárás alapelvei A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 öt fő lépésből épül fel: minta előkészítése; a target RNS reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cdns) szintézise 30 ; a cdns amplifikálása HIV-1 specifikus komplementer primerek felhasználásával PCR során 30 ; az amplifikált termékek hibridizációja a targetszekvenciára specifikus oligonukleotid próbákhoz; a kötődött amplifikált termékek kolorimetriás kimutatása. A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 lehetővé teszi a HIV-1 és a HIV-1 mennyiségi standard RNS szimultán reverz transzkripcióját és PCR-amplifikációját. A master mix reagens egy, a HIV- 1 RNS-re és a HIV-1 mennyiségi standard RNS-re egyaránt specifikus primer párt tartalmaz, és a HIV-1 M csoportú szubtípusainak ekvivalens mennyiségi meghatározására fejlesztették ki. A vizsgálat teljesítményjellemzőit O csoportú mintákon nem határozták meg. A HIV-1 vírus RNS mennyiségi meghatározása során HIV-1 mennyiségi standard használatos. A HIV-1 mennyiségi standard egy nem fertőző RNS transzkriptum, amely a HIV-1 RNS targethez és egy, a mennyiségi standard amplikon és a HIV-1 amplikon megkülönböztetését lehetővé tevő egyedi próbához kötődő régióval identikus primer kötő helyeket tartalmaz. A HIV-1 mennyiségi standard minden egyes mintához ismert kópiaszámban hozzáadásra kerül, majd a HIV-1 targettel együtt a mintaelőkészítési, reverz transzkripciós, PCR-amplifikációs, hibridizációs és kimutatási lépéseken keresztül megy, és a HIV-1 targettel együtt amplifikálódik. A COBAS AMPLICOR Analizátor a vizsgálati mintákban levő HIV-1 RNS-szintet a HIV-1-szignálnak a mennyiségi standardszignállal való összehasonlításával számolja ki minden egyes minta esetén. A mennyiségi standard kompenzálja a gátló hatásokat, és az amplifikációs folyamat szabályozásával lehetővé teszi a HIV-1 RNS pontos mennyiségi meghatározását valamennyi mintában. Minta előkészítése A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 két minta-előkészítési eljárás, a standard eljárás vagy az ultraszenzitív eljárás valamelyikével alkalmazható. A standard minta-előkészítési eljárásban a HIV-1 RNS közvetlenül a plazmából való izolálása során a víruspartikulumokat először egy chaotróp ágenssel roncsolják, amit azután az RNS alkoholos kicsapása követ. Az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárásban a HIV-1 víruspartikulumokat a plazmában először nagysebességű centrifugálással először koncentrálják, ezt követi a chaotróp ágenssel történő roncsolás és a HIV-1 RNS alkoholos kicsapása. A mennyiségi standard RNS molekula ismert száma kerül a roncsolóreagenssel együtt hozzáadásra valamennyi mintához. A HIV-1 mennyiségi standard a minta-előkészítési, reverz transzkripciós, amplifikációs, hibridizációs és kimutatási lépéseken keresztül megy, és a HIV-1 RNS mennyiségi meghatározására szolgál a mintában. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 3/52

4 Reverz transzkripció és PCR-amplifikáció A targetszekvencia kiválasztása A HIV-1-hez tartozó target RNS-szekvencia kiválasztása a HIV-1- genomban maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik. Következésképpen a primerek és a próba megfelelő kiválasztása kritikus a vizsgálat HIV-1-genotípust kimutató képessége szempontjából. A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a HIV-1 gag gén nagyfokban konzervált szakaszán lévő 155 nukleotidszekvenciának megfelelő SK145 és SKCC1B primereket használja 31. A gag régió kódolja a virion csoportspecifikus antigénjeit, illetve mag szerkezeti fehérjéit. A HIV-1 gag gének általában mintegy 1500 nukleotid hosszúak, és a HIV genomban megközelítőleg a pozícióban helyezkednek el. A primerek nukleotidszekvenciája az M csoportú HIV-1 altípusok ekvivalens amplifikálását biztosítandó lett optimalizálva. Reverz transzkripció A reverz transzkripciót és a PCR-amplifikálási reakciókat hőstabil rekombináns enzim, a Thermus thermophilus DNS-polimeráz (rtth pol) segítségével végzik. Mangán jelenlétében, valamint megfelelő pufferviszonyok között az rtth pol mind reverz transzkriptáz-, mind DNSpolimerázaktivitást mutat 30. Ez lehetővé teszi a reverz transzkripció és a PCR-amplifikálás megtörténését ugyanazon reakcióelegyben. A feldolgozott mintákat amplifikációs csövekben (A-csövek) lévő amplifikáló keverékhez adják, ahol tehát mind a reverz transzkripció, mind a PCRamplifikálás megtörténik. A downstream vagy antisense primer (SKCC1B) és az upstream vagy sense primer (SK145) az 5' végükön biotiniláltak. A reakcióelegyet fel kell hevíteni, hogy lehetővé váljon a downstream primernek a HIV-1 target RNS-hez és a HIV-1 mennyiségi standard RNS-hez való specifikus kapcsolódása. Mn 2+ és dezoxinukleozid-trifoszfátok (dntps), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin-, dezoxiuridin- és dezoxitimidin-trifoszfátok feleslegének jelenlétében az rtth pol a kapcsolódott primerhez a target RNS komplementer DNS-szálát (cdns) szintetizálja. Targetamplifikáció A HIV-1 target RNS és a HIV-1 mennyiségi standard RNS reverz transzkripcióját követően a reakcióelegyet az RNS:cDNS hibrid denaturálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett fel kell hevíteni. Ahogy az elegy kihűl, az upstream primer (SK145) specifikusan kötődik a cdns-szálhoz, az rtth pol pedig a primerre egy második DNSszálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, a HIV-1 RNS és a HIV-1 mennyiségi standard RNS targetrégiójának egy kettős szálú DNSmásolatát létrehozva. A kettős szálú DNS szeparálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a reakcióelegyet újra fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével az SK145 és SKCC1B primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. Az rtth pol enzim Mn 2+ és feleslegben lévő dntps jelenlétében a primerekre a targettemplátoknak megfelelően 155 bázispár hosszúságú kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak hívnak. A COBAS AMPLICOR Analizátor a folyamatot adott számú cikluson keresztül automatikusan ismétli, az amplikon DNSmennyisége ciklusonként megduplázódik. Az amplifikálás a HIV-1- genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes HIV-1-genom nem amplifikálódik. 4/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

5 HIV-1 MONITOR Szelektív amplifikálás A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a klinikai mintából az AmpErase (uracil-nglikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dutp) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak 32, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dntp-ok egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target DNS amplifikálását megelőzően lebontja. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben a master mix reagens bázikus ph-ján az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le a targetamplikont. Az amplifikálást követően a maradék enzim a denaturáló oldat hozzáadásakor denaturálódik, megelőzve ezáltal a targetamplikonok lebontását. A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 alkalmazásakor az AmpErase enzim mérések szerint legalább 10 3 darab dezoxiuridint tartalmazó HIV-1-amplikont inaktivál egy PCR során. Hibridizációs reakció A PCR-amplifikálást követően a COBAS AMPLICOR Analizátor automatikusan denaturáló oldatot adagol az A-csövekhez, ezáltal a HIV-1 és a HIV-1 mennyiségi standard amplikon kémiai denaturálást szenved, és egyszálú DNS lesz. Nagy dinamikus tartományt átfogó mennyiségi eredmények eléréséhez a COBAS AMPLICOR Analizátor hígítási sort készít a denaturált amplikonból a kimutatási csövekbe (D-csövek). A HIV-1 amplikon (SK102), illetve HIV-1 mennyiségi standard amplikon (CP35) specifikus oligonukleotid próbával fedett mágneses részecskék szuszpenziója a négy HIV-1 amplikon hígítás, illetve a két HIV-1 mennyiségi standard amplikon hígítás mindegyikéhez rendre hozzáadásra kerül. A biotinilált amplikon a mágneses részecskékhez kötött targetspecifikus oligonukleotid próbákhoz hibridizál. Minden egyes mennyiségi meghatározáshoz a HIV-1 próba szuszpenziót használva négy független reagens abszorbanciamérésre, valamint a HIV-1 mennyiségi standard próba szuszpenziót használva két abszorbanciamérésre van szükség. Kimutatási reakció A hibridizációt követően a COBAS AMPLICOR Analizátor mossa a mágneses részecskéket a D-csövekben, melynek során a nem kötődött anyag eltávozik, ezután avidin-tormaperoxidáz konjugátumot adagol a csövekbe. Az avidin-tormaperoxidáz konjugátum a mágneses részecskékhez kötött targetspecifikus oligonukleotid próbákhoz hibridizált biotinilált amplikonokhoz kötődik. A COBAS AMPLICOR Analizátor a mágneses részecskék mosása révén eltávolítja a nem kötődött konjugátumot, majd minden egyes D-csőhöz hidrogén-peroxidot és 3,3',5,5'-tetrametil-benzidint (TMB) tartalmazó szubsztrátoldatot ad. Hidrogén-peroxid jelenlétében a kötődött tormaperoxidáz katalizálja a TMB színes komplexszé történő oxidációját, amelynek abszorbanciáját a COBAS AMPLICOR Analizátor 660 nm-es hullámhosszon méri. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 5/52

6 A HIV-1 RNS mennyiségi meghatározása Teljes HIV-1 A KF Teljes QS A A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 a HIV-1 vírus RNS-t mennyiségileg meghatározza egy második targetszekvencia (HIV-1 mennyiségi standard) felhasználásával, amely a vizsgálandó mintához ismert koncentrációban hozzá van adva. A HIV-1 mennyiségi standard egy nem fertőző, 233 nukleotidból álló in vitro átírt RNS molekula, amely a HIV-1 targetszekvencia kötő régióival identikus primer kötő régiókat tartalmaz. A HIV-1 mennyiségi standard SK145 és SKCC1B primer kötő helyeket tartalmaz, és egy ugyanolyan hosszúságú (155 bázis) és bázisösszetételű amplifikációs terméket szintetizál, mint a HIV-1 target RNS. A HIV-1 mennyiségi standard amplikon próbakötő régióját úgy módosították, hogy a HIV-1 mennyiségi standard amplikon különbözzön a HIV-1 targetamplikontól. A vizsgálat lineáris tartományán belül az abszorbancia 660 nm-en (A 660 ) minden egyes D-csőben arányos a csőben lévő HIV-1 amplikon vagy HIV-1 mennyiségi standard amplikon mennyiségével. A COBAS AMPLICOR Analizátor kiszámítja a teljes HIV-1 és HIV-1 mennyiségi standard abszorbanciát úgy, hogy a D-cső abszorbanciáját megszorozza az adott D-csőben lévő amplikon hígítási faktorával, majd kiválasztja a maximális abszorbanciájú D-csövet. A számított teljes abszorbancia arányos minden reverz transzkripció/pcr-amplifikáció reakcióban jelen lévő HIV-1 RNS, illetve HIV-1 mennyiségi standard RNS mennyiségével. Valamennyi mintában a HIV-1 RNS mennyisége a teljes HIV-1 abszorbancia és teljes HIV-1 mennyiségi standard abszorbancia aránya, valamint a HIV-1 mennyiségi standard molekulák bevitt száma alapján számítható ki a következő egyenlet felhasználásával: [ ] x bevitt HIV-1 QS kópia/pcr x mintatérfogat-faktor = HIV-1 RNS kópia/ml Ahol: Teljes HIV-1 A = számított teljes abszorbancia a HIV-1 amplikonra Teljes QS A = számított teljes abszorbancia a mennyiségi standard amplikonra Bevitt HIV-1 QS kópia/pcr = a mennyiségi standard kópiák száma minden egyes reakcióban; ez az információ tételspecifikus Mintatérfogat faktor = a kópia/pcr-t kópia/ml-re átváltó faktor KF = Korrekciós faktor a COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5 test eredményeknek az AMPLICOR HIV-1 MONITOR v1.5 test eredményekhez való illesztéséhez (Korrekciós faktor = 1,11). Mintatérfogat faktor = 40 (a standard minta-előkészítési eljárás esetén) Mintatérfogat faktor = 4 (az ultraszenzitív minta-előkészítési eljárás esetén) 6/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

7 HIV-1 MONITOR Reagensek COBAS AMPLICOR HIM 48 teszt P/N: HIV-1 MONITOR Test, ART: version 1.5 US: Minta-előkészítő reagensek HIM PREP HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR roncsoló reagens) trisz-hcl puffer 68% guanidin-tiocianát 3% ditiotreitol < 1% glikogén + Xn 68% (w/w) guanidin-tiocianát 4 9,0 ml Ártalmas HIV-1 QS, v ,1 ml (HIV-1 MONITOR mennyiségi standard, 1.5-ös verzió) < 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HIV-1 primer kötő szekvenciákat és egy egyedi próbához kötődő régiót tartalmaz < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR mintaoldószer) trisz-hcl puffer < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid 4 4,8 ml Kontrollreagensek HIM CTL NHP 4 1,6 ml [Negatív plazma (humán)] Humán plazma, US FDA engedélyezett tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS a gyűjtött donoregységekben PCR-technikával nem kimutatható; HBV core antitest FDA engedélyezett vizsgálattal a gyűjtött donoregységekben nem kimutatható. 0,1% ProClin 300 konzerváló HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( ) kontroll] < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid 4 0,05 ml 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 7/52

8 HIV-1 L(+)C 4 0,05 ml [HIV-1 MONITOR alacsony (+) kontroll] < 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HIV-1-szekvenciákat tartalmaz < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid HIV-1 H(+)C 4 0,05 ml [HIV-1 MONITOR magas (+) kontroll] < 0,001% nem fertőző in vitro átírt (mikrobiális) RNS, amely HIV-1-szekvenciákat tartalmaz < 0,005% poli ra RNS (szintetikus) EDTA 0,05% nátrium-azid Amplifikálási reagensek HIM AMP HIV-1 MMX, v ,7 ml (HIV-1 MONITOR master mix, 1.5-ös verzió) bicin puffer glicerol < 0,01% rtth DNS polimeráz (rtth pol, mikrobiális) kálium-acetát < 0,07% datp, dctp, dgtp, dutp, dttp < 0,001% SKCC1B és SK145 primerek, biotinilált < 0,01% AmpErase ( uracil-n-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,05% nátrium-azid HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR mangánoldat, 1.5-ös verzió) < 2% mangán ecetsav amarántvörös festék 0,05% nátrium-azid 4 0,1 ml Specifikus kimutatási reagensek HIM DK AD3 (Amplikon hígítási reagens) EDTA 0,8% nátrium-hidroxid + Xi 0,8% (w/w) nátrium-hidroxid 2 75 teszt Irritatív IM PS1, v teszt (HIV-1 MONITOR próba szuszpenzió 1, 1.5-ös verzió) MES puffer < 0,01% Dynabeads szuszpenzió (paramágneses részecskék) HIV-1-specifikus oligonukleotid capture próbával (SK102) fedve 0,09% nátrium-azid 8/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

9 HIV-1 MONITOR IM4, v teszt (HIV-1 MONITOR próba szuszpenzió 2, 1.5-ös verzió) nátrium-foszfát puffer < 0,2% detergens 24,9% nátrium-tiocianát IQ PS1, v teszt (HIV-1 MONITOR mennyiségi standard próba szuszpenzió 1, 1.5-ös verzió) MES puffer < 0,01% Dynabeads szuszpenzió (paramágneses részecskék) HIV-1 mennyiségi standard-specifikus oligonukleotid capture próbával (CP35) fedve 0,09% nátrium-azid IQ4, v1.5 (HIV-1 MONITOR mennyiségi standard próba szuszpenzió 2, 1.5-ös verzió) nátrium-foszfát puffer < 0,2% detergens 24,9% nátrium-tiocianát teszt Általános kimutatási reagensek DK DN4 (denaturáló oldat) 1,6% nátrium-hidroxid EDTA timolkék + Xi 1,6% (w/w) nátrium-hidroxid teszt Irritatív CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) trisz-hcl puffer < 0,001% avidin-tormaperoxidáz konjugátum marha-szérumalbumin (emlős) Emulsit 25 (Dai-ichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd.) 0,1% fenol 1% ProClin 150 konzerváló SB3 (szubsztrát A) citrátoldat 0,01% hidrogén-peroxid 0,1% ProClin 150 konzerváló teszt 5 75 teszt 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 9/52

10 SB (szubsztrát B) 0,1% 3,3',5,5'-tetrametil-benzidin (TMB) 40% dimetil-formamid (DMF) T 40% (w/w) dimetil-formamid (DMF) 5 5 ml Mérgező R: 61-20/21-36 A születendő gyermekre ártalmas lehet. Belélegezve és bőrrel érintkezve ártalmas. Szemizgató hatású. S: Kerülni kell az expozíciót használata előtt szerezze be a külön használati utasítást. Baleset vagy rosszullét esetén azonnal orvoshoz kell fordulni. Ha lehetséges, a címkét meg kell mutatni. COBAS AMPLICOR WB 500 teszt P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR mosópuffer US: WB (10X-mosókoncentrátum) < 2% foszfátpuffer < 9% nátrium-klorid EDTA < 2% detergens 0,5% ProClin 300 konzerváló Figyelmeztetések és óvintézkedések teszt In vitro diagnosztikai célra. Csak EDTA vagy ACD véralvadásgátlókkal gyűjtött plazmamintákhoz. A heparinról kimutatták, hogy gátolja a PCR-t, ezért tilos a használata. Ne pipettázzon szájjal. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. Steril, egyszer használatos pipetták és RNáz-mentes pipettahegyek használata javasolt. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. A fel nem használt reagensek és a hulladék kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. Ne használja a készletet a lejárati idő után. 10/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

11 HIV-1 MONITOR Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Roche-irodában. A laboratóriumi munkafolyamatnak egyirányú módon kell zajlania, kezdve a preamplifikálási területtől a posztamplifikálási (amplifikálási/kimutatási) területig haladva. A preamplifikálási műveleteket a reagens-előkészítéssel kell kezdeni, és a minta előkészítésével folytatni. Valamennyi preamplifikálási művelethez tartozó felszerelést és eszközt jelölni kell, és tilos használni más művelethez vagy más munkaterületre átvinni. Valamennyi munkaterületen kesztyűt kell viselni, és a terület elhagyása előtt le kell venni. A reagenselőkészítéshez használt felszerelést és eszközöket tilos használni mintaelőkészítési műveletekhez, amplifikált DNS vagy más target DNS-forrás pipettázásához vagy feldolgozásához. A posztamplifikálási műveletekhez tartozó felszerelést és eszközöket mindenkor a posztamplifikálási munkaterületen kell tartani. A mintákat fertőzőnek kell tekinteni, tehát kezelésüket a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 című dokumentumban, illetve az M29-A3 34 jelű CLSI-dokumentumban ismertetett biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva kell végezni. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. Megjegyzés A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. FIGYELMEZTETÉS: A készlet tartalmaz olyan összetevőt (NHP), amely humán vérből származik. A forrásanyag US FDA engedélyezett tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és Hepatitis B surface antigénre (HBsAg). Továbbá a gyűjtött donoregységeket is vizsgálták; PCR-vizsgálattal HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS nem volt kimutatható, valamint FDA engedélyezett vizsgálattal HBV core antitest nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. Az NHP fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 33 című dokumentum és az M29-A3 34 jelű CLSI-dokumentum előírásainak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. A HIV-1 QS, v1.5; HIV-1 DIL; HIV-1 MMX, v1.5; HIV-1 Mn 2+, v1.5; HIV-1 ( ) C; HIV-1 L(+)C; HIV-1 H(+)C; IM PS1, v1.5 és IQ PS1, v1.5 nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fémazidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. Viseljen szemvédőt, laboratóriumi védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt a következő anyagok kezelése során: HIV-1 LYS; HIV-1 MMX, v1.5; DN4; AD3; IM4, v1.5; IQ4, v1.5; CN4; SB3; SB és szubsztrát munkareagens (kevert SB3 és SB reagens). Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version /52

12 Az SB vagy a szubsztrát munkareagens bőrrel vagy nyálkahártyával való érintkezése kerülendő. Ha előfordul bőrrel való érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Az SB és a szubsztrát munkareagens dimetil-formamidot tartalmaz, amelyről ismert, hogy nagy orális adagban mérgező, továbbá a születendő gyermekre nézve ártalmas hatású lehet. A bőrrel való érintkezést, a gőzök belégzését és az anyag lenyelését el kell kerülni. Ha mégis előfordul a bőrrel érintkezés, gondosan mossa le szappanos vízzel, és azonnal forduljon orvoshoz. Ügyeljen rá, hogy a HIV-1 LYS, amely guanidin-tiocianátot tartalmaz, vagy az IM4, v1.5 és IQ4, v1.5, amelyek nátrium-tiocianátot tartalmaznak, ne kerüljenek kapcsolatba nátrium-hipoklorit (fehérítő) oldattal. Az ilyen keverékekből erősen mérgező gáz fejlődhet. A minták kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő, a minta- és a kontroll-előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. Tárolási és kezelési követelmények A reagenseket tilos lefagyasztani. A HIV-1 LYS, HIV-1 QS, v1.5 és HIV-1 DIL 2 8 C-on tárolandók. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. 2 8 C-on való tárolás során a HIV-1 LYS reagensben csapadék képződik. Használat előtt a HIV-1 LYS reagens C-ra melegítésével oldja fel a csapadékot. Maximum 30 percig melegítse a HIV-1 LYS reagenst, azután keverje erőteljesen, amíg a kristályok feloldódnak. Használatot megelőzően fehér háttér előtt vizsgáljon meg minden egyes HIV-1 LYS üveget, hogy nem ereszt-e, vagy nincs-e sárgásan elszíneződve. Sárgás elszíneződés vagy szivárgás esetén az üveget ne használja fel. Csere céljából lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. A roncsoló munkareagenst (HIV-1 QS, v1.5 reagenst adva a HIV-1 LYS reagenshez) szobahőmérsékleten kell tárolni, és az elkészítést követően 4 órán belül fel kell használni. A HIV-1 MMX, v1.5 és HIV-1 Mn 2+, v C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontás után a fel nem használt részt ki kell dobni. A master mix munkareagenst (HIV-1 Mn 2+, v1.5-öt HIV-1 MMX, v1.5-höz hozzáadva készül) 2 8 C-on kell tárolni, és 2 8 C-on 4 óra hosszat stabil. Az NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C és HIV-1 H(+)C 2 8 C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Felbontást követően a fel nem használt részt ki kell dobni. Az AD C-on tárolandó. A COBAS AMPLICOR Analizátorba töltést követően az AD3 2 8 C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. Az AD3-at legfeljebb 4 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2 8 C-on kell tárolni. 12/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

13 HIV-1 MONITOR A készlet tartalma Az IM PS1, v1.5 és IM4, v C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Az IM PS1, v1.5 és IM4, v1.5 összekeverése után a munkareagens 14 napig stabil 2 8 C-on. A munkareagenst legfeljebb 2 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2 8 C-on kell tárolni. Az IQ PS1, v1.5 és IQ4, v C-on tárolandók. Ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Az IQ PS1, v1.5 és IQ4, v1.5 összekeverése után a munkareagens 30 napig stabil 2 8 C-on. A munkareagenst legfeljebb 4 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2 8 C-on kell tárolni. A DN C-on tárolandó. A DN4 a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a DN4 2 8 C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. A DN4-et legfeljebb 4 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2 8 C-on kell tárolni. A CN4 2 8 C-on tárolandó. A CN4 a jelölt lejárati dátumig stabil. Felbontást követően a CN4 reagens 2 8 C-on 30 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. A CN4-et legfeljebb 4 gépi cikluson keresztül lehet használni (24 óra ciklusonként), és a gépi ciklusok között 2 8 C-on kell tárolni. Az SB3 és SB 2 8 C-on tárolandók. Felbontatlanul ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. A szubsztrát munkareagenst minden nap el kell készíteni az SB3 és az SB összekeverésével. A szubsztrát munkareagens a COBAS AMPLICOR készülékben 16 óráig stabil. Az SB3-at, SB-t vagy a szubsztrát munkareagenst ne tegye ki fémeknek, oxidáló anyagoknak vagy direkt fénynek. A WB 2 30 C-on tárolandó. A WB a jelölt lejárati dátumig stabil. A WB oldatot hígítás előtt vizsgálja meg, és szükség esetén a csapadék visszaoldására melegítse C-ra. A WB desztillált vagy ioncserélt vízzel való 1:10 hígításával készített mosó munkapuffert (1X) 2 25 C-on, a COBAS AMPLICOR mosópuffertartályában kell tárolni, és az elkészítéstől számított 2 hétig stabil. A részben felhasznált kimutatási reagensek 2 8 C-on tárolandók két gépi ciklus között. Ellenőrizze a felbontott reagensek, illetve a munkareagens lejárati idejét a COBAS AMPLICOR készülékbe betöltés előtt. COBAS AMPLICOR HIM P/N: HIV-1 MONITOR Test, ART: version 1.5 US: Minta-előkészítő reagensek HIM PREP HIV-1 LYS (HIV-1 MONITOR roncsoló reagens) HIV-1 QS, v1.5 (HIV-1 MONITOR mennyiségi standard, 1.5-ös verzió) HIV-1 DIL (HIV-1 MONITOR mintaoldószer) 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version /52

14 Kontrollreagensek NHP [Negatív plazma (humán)] HIV-1 ( ) C [HIV-1 ( ) kontroll] HIV-1 L(+)C [HIV-1 MONITOR alacsony (+) kontroll] HIV-1 H(+)C [HIV-1 MONITOR magas (+) kontroll] HIM CTL Amplifikálási reagensek HIM AMP HIV-1 MMX, v1.5 (HIV-1 MONITOR master mix, 1.5-ös verzió) HIV-1 Mn 2+, v1.5 (HIV-1 MONITOR mangánoldat, 1.5-ös verzió) Specifikus kimutatási reagensek HIM DK AD3 (Amplikon hígítási reagens) IM PS1, v1.5 (HIV-1 próba szuszpenzió 1, 1.5-ös verzió) IM4, v1.5 (HIV-1 próba szuszpenzió 2, 1.5-ös verzió) IQ PS1, v1.5 (HIV-1 mennyiségi standard próba szuszpenzió 1, 1.5-ös verzió) IQ4, v1.5 (HIV-1 mennyiségi standard próba szuszpenzió 2, 1.5-ös verzió) Általános kimutatási reagensek DK DN4 (denaturáló oldat) CN4 (avidin-tormaperoxidáz konjugátum) SB3 (szubsztrát A) SB (szubsztrát B) COBAS AMPLICOR WB P/N: Wash Buffer ART: COBAS AMPLICOR mosópuffer US: WB (10X-mosókoncentrátum) 14/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

15 HIV-1 MONITOR Szükséges, de nem biztosított anyagok Preamplifikálás Reagens-előkészítő terület COBAS AMPLICOR A-gyűrű 12 A-csövekkel ellátva COBAS AMPLICOR A-gyűrűtartó Eppendorf Multipette pipetta 1,25 ml Eppendorf Combitip tartóval (steril, egyenként csomagolt) Pipettahegyek (kapacitás 50 µl és 100 µl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes hegyek Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Preamplifikálás Minta- és kontroll-előkészítő terület 2,0 ml csavarókupakos csövek, steril (Sarstedt , vagy ekvivalens)** 1,5 ml csavarókupakos csövek, steril (Sarstedt , vagy ekvivalens)** Csőállvány (Sarstedt vagy ekvivalens) 95% etanol, molekuláris biológiai vagy szövettani használatra (desztillált vagy ioncserélt vízzel frissen hígítva 70%-ra) Izopropil-alkohol, reagens minőség Steril, finomhegyű átvivőpipetták, RNáz-mentes Steril, egyszer használatos, polisztirol szerológiai pipetták (5 ml, 10 ml és 25 ml) Pipettahegyek (kapacitás 12,5 µl, 25 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 400 µl, 500 µl, 600 µl, 800 µl és 1000 µl)* aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes hegyek Mikrocentrifuga (max. RCF g, min. RCF g); Eppendorf 5415C, HERMLE Z230M, vagy ekvivalens Hűtött ultracentrifuga és rögzített szögű rotor (45 fok, legalább huszonnégy db 1,5 ml cső kapacitás) RCF g (Heraeus 17RS HFA 22,1 rotorral, Biofuge 28RS vagy ekvivalens) Vortex keverő Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes Posztamplifikálás Amplifikálási/Kimutatási terület COBAS AMPLICOR készülék és nyomtató Felhasználói kézikönyv a COBAS AMPLICOR Analizátorhoz Opcionális: AMPLILINK szoftver, beleértve: AMPLILINK szoftver adatállomás, nyomtatóval AMPLILINK szoftver 2.4-es verziójú sorozat Felhasználói kézikönyve COBAS AMPLICOR készülék használatához (az AMPLILINK szoftver v2.41-es verziójához) vagy AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozat Alkalmazási kézikönyve COBAS AmpliPrep készülék, COBAS TaqMan készülék, COBAS TaqMan 48 készülék és COBAS AMPLICOR készülék használatához (az AMPLILINK szoftver v3.2-es sorozatához) D-cső állványok Desztillált vagy ioncserélt víz 5 ml szerológiai pipetták Vortex keverő Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version /52

16 * A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését. ** A minták és kontrollok kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő, a minta és a kontroll előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. A minta levétele, transzportja és tárolása Megjegyzés Valamennyi mintát fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A minta levétele A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 kizárólag plazmamintákhoz való használatra alkalmas. A vért EDTA (levendulakék kupak) vagy ACD (sárga kupak) alvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni. A heparinnal alvadásgátolt minták nem megfelelőek erre a vizsgálatra. A vért ne hagyja 2 25 C-on 6 óránál tovább. A vérvételi csőben lévő 1,5 ml ACD alvadásgátló hígító hatása következtében az ACD alvadásgátolt minták vizsgálati eredményei mintegy 15%-kal alacsonyabbak, mint az EDTA alvadásgátolt minták eredményei. Az 1. ábra mutatja az ACD és EDTA alvadásgátlók hatását a HIV-1 RNSeredményekre, plazmaminták esetén. 1. ábra ACD és EDTA a lvadásgátlók összehasonlítása* ACD-s minták átlagos AMPLICOR HIV-1 MONITOR eredmény (HIV RNS kópia/ml plazma, n = 2) AMPLICOR HIV-1 MONITOR EDTA-s és ACD-s minták eredményei y = 1,4381 * x^(0,93286) R= 0,90097 EDTA = ACD EDTA-s minták átlagos AMPLICOR HIV-1 MONITOR eredmény (HIV RNS kópia/ml plazma, n = 2) * Az 1. ábrán látható adatokat AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test segítségével a standard minta-előkészítő eljárást alkalmazva nyerték. A plazmát a levételtől számított 6 órán belül szeparálja el a teljes vérből centrifugálással ( g, 20 perc, szobahőmérséklet). Vigye át a plazmát egy steril polipropilén csőben. A minta transzportja A teljes vér vagy plazma transzportja meg kell, hogy feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak 35. A teljes vér 2 25 C-on transzportálandó, és a levételtől számított 6 órán belül fel kell dolgozni. A plazma 2 8 C-on vagy -20 C -80 C-ra fagyasztva transzportálandó. 16/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

17 HIV-1 MONITOR A minta tárolása A plazmaminták szobahőmérsékleten 1 napig, 2 8 C között 5 napig, illetve -20 C -80 C-ra fagyasztva tárolhatóak. A minták tárolása 2,0 ml polipropilén csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt ) µl részletekben javasolt. A plazmaminták legfeljebb három alkalommal fagyaszthatók le és olvaszthatók fel. A 2. ábra ezen fagyasztás/olvasztás vizsgálatok adatait mutatja. 2. ábra Három HIV-1 pozitív plazmaminta átlagos HIV-1 eredményei 2, 3 és 4 fagyasztás/olvasztás ciklust követően* 2,0 HIV-1 RNS kópia/ml Első felolvasztásra normalizálva 1,5 1,0 0,5 0, Felolvasztások száma Használati utasítás * A 2. ábrán látható adatokat AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test segítségével, a standard minta-előkészítő eljárást alkalmazva nyerték. Megjegyzés Megjegyzés Megjegyzés Megjegyzés A részletes üzemeltetési utasításokért, az eredmények kinyomtatásáért és a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezéséért forduljon a következő kézikönyvekhez: (1) a COBAS AMPLICOR készülék Felhasználói kézikönyve és (2) az AMPLILINK szoftver v2.41 használata esetén az AMPLILINK szoftver 2.4-es verziójú sorozat Felhasználói kézikönyve a COBAS AMPLICOR készülékkel való használatra vagy az AMPLILINK szoftver v3.2-es sorozatának használata esetén az AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozat Alkalmazási kézikönyve a COBAS AmpliPrep készülékkel, COBAS TaqMan készülékkel, a COBAS TaqMan 48 készülékkel és a COBAS AMPLICOR készülékkel való együttes használatra. Felhasználás előtt valamennyi reagensnek szobahőmérsékletűnek kell lennie. A vizsgálati eljárás megkezdése előtt valamennyi reagenst vizsgáljon meg, hogy elégséges térfogat áll-e rendelkezésre. Felhasználás előtt a plazmamintáknak szobahőmérsékletűeknek kell lenniük. Használjon aeroszolbarrieres pipettákat vagy pozitív kiszorításos hegyeket, ahol indokolt. A szelektív amplifikálás érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. A minták kiloccsanását és keresztszennyeződését megelőzendő, a minta- és a kontroll-előkészítéshez csavarókupakos csöveket kell használni. Ne használjon pattintókupakos csöveket. Megjegyzés A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 csak a Basic módban futtatható. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version /52

18 Futtatási mennyiség Valamennyi készlet elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy két 24 tesztes futtatásként. Futtatásonként legfeljebb 24 mintát (21 mintát + 3 kontrollt) lehet feldolgozni. Valamennyi futtatásnak legalább egy AMPLICOR HIV-1 ( ) kontrollt, egy AMPLICOR HIV-1 MONITOR alacsony (+) kontrollt és egy AMPLICOR HIV-1 MONITOR magas (+) kontrollt kell tartalmaznia (ld. Minőség-ellenőrzés ). A minta-előkészítő és az amplifikálási reagensek 12 tesztre elegendő, egyszer használatos üvegekben vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat a 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. Megjegyzés A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 csak a Basic módban futtatható. Munkafolyamat A COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, v1.5 egy vagy két nap alatt végezhető el. Ha a vizsgálatot egyetlen munkanap alatt kell elvégezni, kövesse sorban az utasításokat a Reagens előkészítése, Minta és kontroll előkészítése, Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépéseknek megfelelően. A vizsgálat 2 nap alatt végezhető el, ha az 1. nap a Minta és kontroll előkészítése lépést végzi, majd a 2. nap folytatja a Reagens előkészítése, Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépésekkel. Ha a minta és kontroll előkészítését az 1. napon, a reverz transzkripciót, amplifikálást és kimutatást pedig a 2. napon kívánja elvégezni, akkor végezze el vagy a Standard minta- és kontroll-előkészítést (A.1. A.14.) vagy pedig az Ultraszenzitív minta- és kontroll-előkészítést (B.1. B.19.), és tárolja a feldolgozott mintákat az A.14., illetve B.19. lépésben leírtaknak megfelelően. A 2. napon kezdje a Reagens előkészítése lépéssel, majd olvassza fel a feldolgozott mintákat és kontrollokat szobahőmérsékleten, és folytassa a Standard minta- és kontroll-előkészítés (A.15.), illetve az Ultraszenzitív minta- és kontroll-előkészítés (B.20.) lépéssel, majd a Reverz transzkripció, Amplifikálás és Kimutatás lépésekkel. Reagens előkészítése Munkaterület: Preamplifikálás Reagens-előkészítő terület 1. Határozza meg a betegminta- és a kontrollvizsgálatokhoz szükséges A-gyűrűk számát. Helyezze az A-gyűrű(ke)t az A-gyűrűtartóba. 2. Készítse el a master mix munkareagenst 100 µl HIV-1 Mn 2+, v1.5 egy ampulla HIV-1 MMX, v1.5 reagenshez való hozzáadásával. A master mix térfogatát nem szükséges megmérnie. Mérjen 100 µl HIV-1 Mn 2+, v1.5 oldatot egy teljes ampulla HIV-1 MMX, v1.5 reagenshez. Csavarja rá a kupakot, majd a cső szöri fordítgatásával keverje jól össze az oldatokat. A master mix munkareagenst ne vortexelje. A HIV-1 Mn 2+, v1.5 rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön róla, hogy a HIV-1 Mn 2+, v1.5 oldatot a master mix reagenshez adta. A maradék HIV-1 Mn 2+, v1.5 oldatot dobja ki. A master mix munkareagens 2 8 C-on tárolandó, és az elkészítést követő 4 órán belül fel kell használni. 3. Mérjen valamennyi A-csőbe 50 µl master mix munkareagenst ismétlő pipettával vagy aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával. Ezután ne zárja le az A-csöve(ke)t. A fel nem használt master mix munkareagenst dobja ki. 4. Helyezze a master mix munkareagenst tartalmazó A-gyűrű(ke)t egy újrazárható műanyag tasakba, és gondosan zárja le a tasakot. Az A-gyűrű(ke)t vigye át a Preamplifikálás Minta-előkészítő területre. A minta és kontroll előkészítése befejezéséig tárolja a master mix 18/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

19 HIV-1 MONITOR Minta és kontroll előkészítése Megjegyzés Megjegyzés Megjegyzés Standard minta- és kontroll-előkészítés reagenst tartalmazó A-gyűrű(ke)t 2 8 C-on a Preamplifikálás Mintaelőkészítő területen. A master mix munkareagens az A-csövekben, lezárt műanyag tasakban 2 8 C-on 4 óra hosszat stabil. Munkaterület: Preamplifikálás Minta- és kontroll-terület Korábban előkészített minták és kontrollok amplifikálásához először a Reagens előkészítése szakasz lépéseit végezze el. Olvassza fel a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten, majd folytassa a Standard minta- és kontroll-előkészítés (A.15.) vagy az Ultraszenzitív minta- és kontroll-előkészítés (B.20.) lépéssel. 2 8 C-on való tárolás során a HIV-1 LYS reagensben csapadék képződik. Felhasználást megelőzően melegítse C-ra és a kicsapódott anyag feloldása céljából erőteljesen keverje az oldatot. Használatot megelőzően fehér háttér előtt vizsgáljon meg minden egyes HIV-1 LYS üveget, hogy nem ereszt-e, vagy nincs-e sárgásan elszíneződve. Sárgás elszíneződés vagy szivárgás esetén az üveget ne használja fel. Csere céljából lépjen kapcsolatba a helyi Roche-irodával. A.1. Készítsen 70%-os etanolt. 12 teszthez: keverjen össze 11,0 ml 95%-os etanolt és 4,0 ml ioncserélt vagy desztillált vizet. A.2. Címkézzen meg egy-egy 2,0 ml-es csavarókupakos csövet minden egyes betegmintához és további három csövet, mint HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C és HIV-1 H(+)C. A.3. Készítsen standard roncsoló munkareagenst. Használat előtt vortexelje a HIV-1 QS, v1.5 oldatot legalább 10 másodpercig. Minden egyes, legfeljebb 12 mintát és kontrollt tartalmazó tételre számolva, mérjen 100 µl HIV-1 QS, v1.5 oldatot egy üveg HIV-1 LYS reagenshez, és keverje össze jól. A HIV-1 LYS térfogatát nem szükséges megmérnie. A HIV-1 QS, v1.5 rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön arról, hogy a HIV-1 QS, v1.5 oldatot a HIV-1 LYS reagenshez adta. A maradék HIV-1 QS, v1.5 oldatot dobja ki. A standard roncsoló munkareagens szobahőmérsékleten 4 óra hosszat stabil. Megjegyzés Fagyasztott minták használatakor olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 3 5 másodpercig. A mintának a cső aljába gyűjtéséhez a csövet rövid időre tegye centrifugába. A mintákkal való munka során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. A.4. A.5. Mérjen 600 µl standard roncsoló munkareagenst minden egyes megcímkézett csőbe, és csavarja a csövekre a kupakokat. Ellenőrizze a roncsoló munkareagens rózsaszín színét, hogy meggyőződjön arról, hogy a HIV-1 QS, v1.5 oldatot a HIV-1 LYS reagenshez adta. Készítse el a standard kontrollokat a következők szerint: Vortexelje az NHP, HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C és HIV-1 H(+)C kontrollokat 3 5 másodpercig. Mérjen 200 µl NHP-t a három kontrollcső mindegyikébe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket 3 5 másodpercig. Mérjen 50 µl HIV-1 ( ) C-t a standard roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó HIV-1 ( ) C címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3 5 másodpercig. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version /52

20 Megjegyzés A.6. A.7. A.8. Mérjen 50 µl HIV-1 L(+)C-t a standard roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó HIV-1 L(+)C címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3 5 másodpercig. Mérjen 50 µl HIV-1 H(+)C-t a standard roncsoló munkareagenst és NHP-t tartalmazó HIV-1 H(+)C címkézésű csőbe. Csavarja a csőre a kupakot, és vortexelje 3 5 másodpercig. Mérjen minden egyes betegmintából 200 µl-t a megfelelően címkézett standard roncsoló munkareagenst tartalmazó csövekbe. Csavarja a csövekre a kupakokat, és vortexelje őket 3 5 másodpercig. Inkubálja a minta- és kontrollcsöveket 10 percig szobahőmérsékleten. Minden egyes minta- és kontrollcső esetén vegye le a kupakot, mérjen be 800 µl 100%-os izopropil-alkoholt (szobahőmérsékleten) az adott csőbe, csavarja vissza a kupakot, és vortexelje 3 5 másodpercig. Ne legyen egyszerre egynél több cső nyitva. A.9. Tegyen orientációs jelzést valamennyi csőre, majd helyezze a csöveket a mikrocentrifugába úgy, hogy az orientációs jelzés kifelé nézzen, vagyis az üledék a jelzésnek megfelelően helyezkedjen majd el. Centrifugálja le a mintákat és a kontrollokat szobahőmérsékleten maximum sebességen ( g) 15 percig. A.10. Minden egyes csőhöz új, finom hegyű transzferpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót minden csőből, ügyeljen rá, hogy ne zavarja fel az üledéket (amely esetleg nem is látható). Távolítsa el a lehető legtöbb folyadékot anélkül, hogy felzavarná az üledéket. A felülúszót lassan szívja ki, lehetőséget adva a folyadéknak, hogy teljesen leszivárogjon a cső faláról. Ne használjon vákuum szívót. A.11. Mérjen be 1,0 ml 70%-os etanolt (szobahőmérsékleten) mindegyik csőbe, csavarja vissza a kupakokat, és vortexelje őket 3 5 másodpercig. A.12. Helyezze a csöveket egy mikrocentrifugába az orientációs jelzésekkel kifelé, és centrifugálja a csöveket szobahőmérsékleten maximum sebességen ( g) 5 percig. A.13. Minden egyes csőhöz új, finom hegyű átvivőpipettát használva óvatosan távolítsa el a felülúszót az üledék felzavarása nélkül. Az üledék ebben a lépésben tisztán látható. Távolítsa el a lehető legtöbb felülúszót. Az etanolmaradványok gátolhatják az amplifikálást. A.14. Mérjen be 400 µl HIV-1 DIL-t mindegyik csőbe. Csavarja vissza a csőre a kupakot. Az extrahált RNS reszuszpendálása végett vortexeljen erőteljesen 10 másodpercig. Némi oldhatatlan anyag visszamaradhat. Amplifikálja a feldolgozott mintákat és kontrollokat az előkészítéstől számított 2 órán belül. Ha az amplifikálást nem kezdi meg az előkészítéstől számított 2 órán belül, akkor a minták -20 C-ra vagy az alá fagyasztva maximum egy hétig tárolhatóak, legfeljebb egyszeri fagyasztás/olvasztás mellett. Egynél több fagyasztás/olvasztás ciklus kópiaszámbeli veszteséget eredményezhet. Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 5 másodpercig, mielőtt az A.15. lépéssel folytatná. 20/52 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version 1.5 6/2007, Revision 6.0

21 HIV-1 MONITOR A.15. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott pipettával minden egyes mintából és kontrollból 50 µl-t a megfelelő, master mix munkareagenst tartalmazó A-csövekbe. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Ügyeljen arra, hogy ne vigyen át semminemű csapadékos anyagot, amely nem ment vissza oldatba. Csavarja az A-csövekre a kupakokat. A.16. Jegyezze fel az A-gyűrű(k)ben levő kontrollok és minták helyzetét. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenst tartalmazó A-csövekhez adásától számított 45 percen belül meg kell kezdeni. Vigye át az A-gyűrűkben lévő előkészített mintákat és kontrollokat az amplifikálási/kimutatási területre. A feldolgozott minták maradéka -20 C-ra vagy az alá fagyasztva legfeljebb egy hétig tárolható, legfeljebb egyszeri fagyasztás/olvasztás mellett. Egynél több fagyasztás/olvasztás ciklus kópiaszámbeli veszteséget eredményezhet. Ultraszenzitív minta- és kontroll-előkészítés B.1. Hűtse le az ultracentrifugát és a rotort 2 8 C-ra, ahogy az az ultracentrifuga használati utasításában le van írva. B.2. Készítsen 70%-os etanolt. 12 teszthez: keverjen össze 11,0 ml 95%-os etanolt és 4,0 ml ioncserélt vagy desztillált vizet. B.3. Címkézzen meg egy-egy 1,5 ml-es csavarókupakos csövet minden egyes betegmintához és további három csövet, mint HIV-1 ( ) C, HIV-1 L(+)C és HIV-1 H(+)C. B.4. Készítsen ultraszenzitív roncsoló munkareagenst. Használat előtt vortexelje a HIV-1 QS, v1.5 oldatot legalább 10 másodpercig. Minden egyes, legfeljebb 12 mintát és kontrollt tartalmazó tételre számolva, mérjen 25 µl HIV-1 QS, v1.5 oldatot egy üveg HIV-1 LYS reagenshez, és keverje össze jól. A HIV-1 LYS térfogatát nem szükséges megmérnie. A HIV-1 QS, v1.5 rózsaszín színe alkalmas, hogy meggyőződjön arról, hogy a HIV-1 QS, v1.5 oldatot a HIV-1 LYS reagenshez adta. A maradék HIV-1 QS, v1.5 oldatot dobja ki. Az ultraszenzitív roncsoló munkareagens szobahőmérsékleten 4 óra hosszat stabil. Megjegyzés Fagyasztott minták használatakor olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd vortexelje őket 3 5 másodpercig. A mintának a cső aljába gyűjtéséhez a csövet rövid időre tegye centrifugába. A mintákkal való munka során ügyeljen a kesztyűk szennyezésének elkerülésére. B.5. Mérjen minden betegmintából 500 µl-t a megfelelően címkézett csövekbe. B.6. Mérjen 500 µl NHP-t a megfelelően címkézett kontrollcsövekbe. B.7. Tegyen orientációs jelzést valamennyi csőre, majd helyezze a csöveket az ultracentrifugába úgy, hogy az orientációs jelzés kifelé nézzen, vagyis az üledék a jelzésnek megfelelően helyezkedjen majd el. Centrifugálja le a mintákat és kontrollokat 2 8 C-on g sebességen 60 percig. B.8. Minden egyes csőhöz új, finom hegyű transzferpipettát használva óvatosan távolítsa el és dobja ki a felülúszót minden csőből, ügyeljen rá, hogy ne zavarja fel az üledéket (amely esetleg nem is látható). Távolítsa el a lehető legtöbb folyadékot anélkül, hogy felzavarná az üledéket. A felülúszót lassan szívja ki, lehetőséget adva a folyadéknak, hogy teljesen leszivárogjon a cső faláról. Ne használjon vákuum szívót. 6/2007, Revision 6.0 COBAS AMPLICOR HIV-1 MONITOR Test, version /52