DNS KLÓNOZÁS: Egy DNS molekula megsokszorozása. In vivo-különféle gazdasejtekben

Átírás

1 DNS KLÓNOZÁS

2 DNS KLÓNOZÁS: Egy DNS molekula megsokszorozása In vitro-pcr In vivo-különféle gazdasejtekben

3 POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR)

4 PCR A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ DNS MOLEKULÁK MEGSOKSZOROZÁSÁRA (AMPLIFIKÁLÁSÁRA) HASZNÁLT, NAGYON ÉRZÉKENY MÓDSZER 1985-BEN TALÁLTA FEL KARY MULLIS, 1993-BAN NOBEL DÍJAT KAPOTT

5 PCR AZ AMPLIFIKÁLT DNS AKÁR 40 KB HOSSZÚ IS LEHET. A CÉLSZEKVENCIA KÉT VÉGÉRŐL KB. 20 BP SZEKVENCIA ISMERETE SZÜKSÉGES. AZ EMBER ÉS SOK EGYÉB ÉLŐLÉNY GENOMSZEKVENCIÁJÁNAK ISMERETÉBEN GYAKORLATILAG BÁRMELY KÍVÁNT DNS SZEKVENCIA AMPLIFIKÁLHATÓ.

6 Taq POLIMERÁZ A PCR-hoz egy hőforrásokban élő baktérium, a thermus aquaticus DNS polimerázát használták először. Manapság már számos rekombináns enzim közül választhatunk.

7 Taq POLIMERÁZ A Thermus aquaticus polimeráz Nem semmisül meg 95 fokon. Működése 72 fokon ideális.

8 PCR a Taq POLIMERÁZ FELFEDEZÉSE ELŐTT ÉS UTÁN Az alkalmazott nem hőstabil DNS-polimerázt minden ciklus során pótolni kellett

9 A PCR REAKCIÓ ÖSSZETEVŐI DEOXIRIBONUKLEOTID TRIFOSZFÁTOK (dntp-k), a DNS építőkövei TEMPLÁT DNS, az amplifikálandó DNS szekvenciát tartalmazó minta PRIMEREK, bp hosszúságú oligonukleotidák, a célszekvencia két végével komplementerek HŐSTABIL DNS POLIMERÁZ PUFFER VÍZ

10 PCR A PRC EGY CIKLUSA (HÁROM ALAPVETŐ LÉPÉSE) SZER ISMÉTLŐDIK EGY REAKCIÓ SORÁN. A PCR KÉSZÜLÉK A REAKCIÓCSÖVEKET RENDKÍVÜL GYORSAN TUDJA LEHŰTENI, ÉS FELMELEGÍTENI.

11 EGY PCR CIKLUS LÉPÉSEI DENATURÁCIÓ ~94 C : A DNS egyesszálúvá válik. PRIMER KAPCSOLÓDÁS/ANNEALING ~54 C : Az egyesszálú primerek és templát DNS között bázispárosodás zajlik. EXTENZIÓ ~72 C : A Taq polimeráz a templáttal komplementer bázisokat épít be a primerek 3 végétől kiindulva. A DNS szintézis, mint mindig, most is 5-3 irányba halad.

12 EGY PCR CIKLUS LÉPÉSEI DENATURÁCIÓ PRIMER KAPCSOLÓDÁS EXTENZIÓ

13

14 A DNS MENNYISÉGE EXPONENCIÁLISAN NŐ A PCR SORÁN

15 A DNS MENNYISÉGE EXPONENCIÁLISAN NŐ A PCR SORÁN A DNS SZÁLAK SZÁMA MINDEN CIKLUS SORÁN MEGKETTŐZŐDIK AZ ELSŐ NÉHÁNY CIKLUS UTÁN MÁR A KÉT PRIMER KÖZÖTTI RÉSZ AMPLIFIKÁLÓDIK (lsd. következő kép) A PCR EREDMÉNYEKÉPPEN A PRIMEREK KÖZTI DNS SZAKASZ NAGY MENNYISÉGBEN KELETKEZIK. X n = X 0. 2 n (n: ciklusok száma)

16 AZ ELSŐ CIKLUSOK ÁTTEKINTÉSE Amplifikálandó DNS szakasz 1. ciklus 72 O 2. ciklus 72 O 3. ciklus 72 O

17 PCR REAKCIÓ ELLENŐRZÉSE GÉLELEKTROFORÉZISSEL Marker DNS PCR fragmentumok

18 PCR ÉS KONTAMINÁCIÓ Mivel a PCR nagyon érzékeny módszer, A KONTAMINÁCIÓ VESZÉLYE NAGY Leírták, hogy pipettázás során pár vérsejt még ha cserélnek is tip-et a pipetta végéhez tapadhat és átkerülhet egyik mintából a másikba, komoly bonyodalmakat okozva.

19 A PCR ALKALMAZÁSAI FERTŐZÉSEK DIAGNÓZISA Tervezzünk olyan primereket, melyek csak a kórokozó DNSével komplementerek, míg az emberi DNS-el nem Vegyünk megfelelő mintát a betegből, mely valószínűleg tartalmazza a kórokozót (pl. köpet) Végezzük el a PCR reakciót Futtassuk meg a PCR terméket gélelektroforézissel Ha a várt hosszúságú fragment képződik, a beteg fertőzött A diagnózis néhány óra alatt megvan, szemben a gyakran napokig/hetekig tartó baktérium tenyésztéssel.

20 BAKTÉRIUM FERTŐZÉSEK DIAGNÓZISA Sok patogén baktérium és vírus detektálásához szükséges primer pár már megvásárolható. Neisseria gonorrhea (tripper) Chlamydia trachomatis (Chlamydia) Mycobacterium tuberculosis (TBC) Treponema pallidum (Szifilisz) Mycobacterium leprae (lepra)

21 VÍRUS FERTŐZÉSEK DIAGNÓZISA HIV HPV CMV EBV herpes viruses rota virus Calici virus

22 A PCR ALKALMAZÁSAI ÖRÖKLÖTT BETEGSÉGEK DIAGNÓZISA Bármely gén mutációját ki tudjuk mutatni, ha PCR-amplifikáljuk majd megszekvenáljuk. CISZTÁS FIBRÓZIS-CFTR MELLRÁK-BRCA RETIONOBLASZTÓMA-Rb P53

23 A PCR ALKALMAZÁSAI PRÉNATÁLIS DIAGNÓZIS Az embrióból a kövekező módokon nyerhetünk DNS-t veleszületett betegségek PCR alapú diagnózisához: PREIMPLANTÁCIÓS GENETIKAI DIAGNÓZISSAL CHORION VILLUS MINTAVÉTELLEL AMNIOCENTÉZISSEL

24 A PCR ALKALMAZÁSAI PRÉNATÁLIS DIAGNÓZIS IN VITRO FERTILIZÁCIÓ, PREIMPLANTÁCIÓS GENETIKAI DIAGNÓZISSAL Ismert recesszív letális mutációt hordozó párok gyermekének betegsége kiküszöbölhető, ha IVF után 4-8 sejtes embrióból egy sejtet eltávolítanak, felpcr-ezik a mutáns gént, majd megszekvenálják. Ha homozigóta az embrió a mutációra, nem ültetik vissza a méhbe.

25 A PCR ALKALMAZÁSAI PRÉNATÁLIS DIAGNÓZIS CHORION VILLUS MINTAVÉTEL

26 A PCR ALKALMAZÁSAI PRÉNATÁLIS DIAGNÓZIS AMNIOCENTÉZIS A magzatvíz a fejlődő embrió elhalt bőrsejtjeit is tartalmazza. Kis mennyiségű magzatvíz kiszívásával bármely betegség PCR alapú diagnózisához elégséges mennyiségű sejtet nyerhetünk.

27 A PCR ALKALMAZÁSAI IGAZSÁGÜGYI ORVOSTAN

28 A PCR ALKALMAZÁSAI IGAZSÁGÜGYI ORVOSTAN BÁRMELY SZEMÉLY AZONOSÍHATÓ PCR-EN ALAPULÓ VNTR MÓDSZERREL. EGY HAJSZÁL, VÉR/ONDÓ CSEPP, PÁR HÁMSEJT AZ ÁLDOZAT KÖRME ALATT ELÉGSÉGES TEMPLÁT MENNYISÉGET BIZTOSÍT VNTR ANALÍZISHEZ.

29 STR/SHORT TANDEM REPEATS 2-7 BÁZIS ISMÉTLŐDÉSE 7-40 SZER AZ ISMÉTLŐDÉSEK SZÁMA KÜLÖNBÖZŐ LEHET: VNTR (VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEAT) 10 (vagy több) STR ALAPJÁN BÁRMELY EMBER BEAZONOSÍTHATÓ

30 AZ FBI STR LOKUSZAI

31 VNTR gélelektroforézis PCR PRIMEREK Homológ kromoszómák TANDEM ISMÉTLŐDÉSEK (REPEATS)

32 Ismétlődések száma VNTR gélelektroforézis A gyanúsított B gyanúsított C gyanúsított DNS a tetthelyről

33 REKOMBINÁNS DNS TECHNOLÓGIA/ DNS KLÓNOZÁS tetszőleges DNS fragmentumok illeszthetőek össze génsebészeti módszerekkel

34 REKOMBINÁNS DNS TECHNOLÓGIA/ DNS KLÓNOZÁS RAGADÓS VÉGEK Emésszük mindkét DNS molekulát ugyanazzal a restrikciós enzimmel DNS LIGÁZ REKOMBINÁNS DNS tetszőleges DNS fragmentumok illeszthetőek össze génsebészeti módszerekkel

35 REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ORVOSI ALKALMAZÁSA TÍPUS VÉRALVADÁSGÁTLÓK REKOMBINÁNS FEHÉRJE Szöveti plazminogén aktivátor (TPA) FUNKCIÓ trombusok oldása VÉRALVADÁSI FAKTOROK Faktor VIII véralvadás elősegítése KOLÓNIA STIMULÁLÓ FAKTOROK Granulocita kolónia stimuláló faktor (G-CSF) fehérvérsejt képződés stimulálása ERITROPOETIN Eritropoetin vörösvérsejtszám növelése NÖVEKEDÉSI FAKTOROK Inzulin-szerű növekedési faktor 1 (IGF-1) sejtosztódás és növekedés stimulálás, sejthalál gátlás NÖVEKEDÉSI HORMON Növekedési Hormon anabolikus hatás a sejtekre INZULIN Inzulin glükóz felvétel a sejtekbe INTERFERONOK Interferon-béta-1a Interferon béta-1b vírus replikáció gátlása, INTERLEUKINOK Interleukin 1-35 különböző fehérvérsejtek stimulálása MONOKLONÁLIS ANTITESTEK VAKCINÁK MONOKLONÁLIS ANTITESTEK hepatitis B envelope fehérje specifikus fehérje kötés immunrendszer stimulálása BETEGSÉG szívinfarktus hemofília immundeficienciák, fertőzések, kemoterápia után anémia veseelégtelenségben, dopping Laron törpeség ALS, diabetes dopping törpeség dopping diabetes hepatitisz C, egyes tumorok sebek, HIV, immundeficienciák, tumorok diagnosztika, tumorok virális és bakteriális fertőzések megelőzése

36 A RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK DNS-t hasító enzimek

37 A RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK Védelem a fágok ellen

38 A RESTRIKCIÓS-MODIFIKÁCIÓS RENDSZER RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZ + MODIFIKÁCIÓS METILÁZ FÁG DNS NUKLEÁZ NUKLEÁZ BAKTERIÁLIS GENOM FELISMERÉSI /RESTRIKCIÓS HELY: 4-8 bp palindróm szekvencia.

39 A RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK a restrikciós endonukleáz-dns interakció nem specifikus helyen a restrikciós endonukleáz-dns interakció specifikus restrikciós helyen

40 A RESTRIKCIÓS ENDONUKÁZOK RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZ

41 A RESTRIKCIÓS ENDONUKÁZOK TOMPA VÉG RAGADÓS VÉG

42 AGARÓZ GÉL ELEKTROPHORÉZIS Marker DNS DNS molekulák elválasztása méretük alapján

43 DNS KLÓNOZÁS Klónozáshoz szükséges: - Inszert: a megsokszorozni kívánt DNS darab (megfelelő restrikciós enzimekkel hasítva) - Vektor DNS (megfelelő restrikciós enzimekkel hasítva) -DNS ligáz enzim -Gazdasejt

44 DNS KLÓNOZÁS RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉS LIGÁLÁS TRANSZFORMÁLÁS REKOMBINÁNS PLAZMID IZOLÁLÁS

45 DNS KLÓNOZÁS Bakteriális promóter (P) és operátor (O) Polilinker több restrikciós felismerési hellyel Antibiotikum rezisztencia gén Riboszóma kötőhely Transzkripciós terminációs szekvencia Replikációs origó Replikációs origó Antibiotikum rezisztencia gén klónozó vektor expressziós vektor

46 DNS KLÓNOZÁS-LIGÁLÁS DNS LIGÁZ

47 DNS KLÓNOZÁS rekombináns plazmid gén lacz emésztés ligálás transzformáció R1 Ha génünket és a plazmidot két különböző restrikciós enzimmel vágjuk, génünket irányítottan illeszthetjük a plazmidba (expressziós vektornál fontos), és az üres plazmid visszazáródását is elkerülhetjük, mivel két különböző ragadós vég nem ligálódik. Szélesztés Fehér kolónia kiválasztása növesztés X: Lac Z mutáció a bakteriális kromoszómán 1. antibiotikum és X-gal Fehér kolónia: nincs X-gal lebontás, rekombináns plazmid Rekombináns plazmid izolálás Plazmidok LacZ-vel

48 REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ELŐÁLLÍTÁSA Rekombináns fehérjéket nagy mennyiségben tudunk előállítani baktériumok segítségével. A fehérjét kódoló gént indukálható bakteriális promótert tartalmazó expressziós vektorba kell klónozni.

49 REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ELŐÁLLÍTÁSA A rekombináns fehérjéket nagy mennyiségben izoláljuk a baktériumokból, pl. AFFINITÁS KROMATOGRÁFIÁval.

50 REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ELŐÁLLÍTÁSA E. COLI ÉLESZTŐ/ROVAR SEJTEK EMLŐS SEJTEK Nem minden fehérje állítható elő baktériumokban, mert az eukarióta fehérjék gyakran olyan poszttranszlációs módosításokon mennek keresztül, melyeket a baktériumok nem képesek elvégezni. Ilyenkor eukarióta sejtekben kell expresszáltatni a kérdéses fehérjét.

51

52 REKOMBINÁCIÓS KLÓNOZÁS: KLÓNOZÁS RESTRIKCIÓS ENZIMEK NÉLKÜL

53 REKOMBINÁCIÓS KLÓNOZÁS: KLÓNOZÁS RESTRIKCIÓS ENZIMEK NÉLKÜL

54 REKOMBINÁCIÓS KLÓNOZÁS: KLÓNOZÁS RESTRIKCIÓS ENZIMEK NÉLKÜL