A jelátviteli folyamatok tanulmányozása sejtbiológiai, biokémiai és molekuláris biológiai technikák segítségével II.

Átírás

1 Szöllősi Attila A jelátviteli folyamatok tanulmányozása sejtbiológiai, biokémiai és molekuláris biológiai technikák segítségével II. Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum, Molekuláris Medicina Kutató Központ, Élettani Intézet

2 RT-PCR

3 RT-PCR Általánosan - a sejtalkotók kimutatása mrns szinten (génexpresszió) - minden olyan sejtalkotó kimutatható, amit a sejt termel, tehát kódol - enzimek, receptorok, citoszkeletális komponensek, mediátorok, etc, - csak szemikvantitatív, de kvantitálható (belső kontroll) Alapfeltétel - nagyfokú molekuláris biológiai műszerezettség - sterilitás, RNA-ase mentesség - mindig legyen stabil belső kontroll (pl. b-actin, GAPDH)! Módszer - a primerek tervezése & szintézise - teljes RNS preparálása (Trizol) - cdns előállítása reverz transzkripcióval (RT) - a vizsgálni kívánt cdns szakaszok amplifikálása a szintetizált primerek segítségével, PCR alkalmazásával

4 A PCR reakció elve

5 TGFb 2 expression (% of control) Példa az RT-PCR technikára PKC IZOFORMA TGFb bp 565 z q l b-actin Control Caps * 1 2 Culturing days

6 Q-PCR

7 Alapismeretek PCR: egy DNS függő polimeráz két specifikus oligonukleotid primer segítségével a primerek közötti target DNS szekvenciát amplifikálja Q-PCR: a primerek mellett a targetre specifikus próbákat is használ, melynek: 5 végén Reporter 3 végén Quencher R-Q Fluoreszcencia Polimerizáció Q + R Fluoreszcencia Fluoreszcencia ~ amplifikált DNS mennyiség

8

9 Példa: primer & próba Exon -exon határ * Consensus szekvencia primerek próba

10 A primerek és próbák tulajdonságai Primer Próba Amplicon Tm 58-60ºC 20-80% GC Hosszúság: 9-40 <2ºC különbség a két primer Tm-je között Maximum 2/5 G vagy C a 3 végen 10ºC kal a primerek Tm-je fölött 20-80% GC Hosszúság: MGB (non-fluor.) 9-40 TAMRA <4 G egymás után Ne legyen G az 5 végen (Ne legyen több G mint C) bp hosszú Minél közelebb a próbához

11 Mi szükséges a Q-PCR reakció végrehajtásához? PÉÉÉÉÉÉNZ!!!! DNS vagy cdns H 2 O MgCl 2, egyéb pufferek dntp-ok AmpliTaq Gold DNS Polimeráz Specifikus próba Forward Primer Reverse Primer Q-PCR műszer TaqMan Universal PCR MasterMix

12 Quantitációs követelmények Abszolút Standardre van szükség, melynek ismerjük a koncentrációját Standard görbét használ A legtöbb kísérlet nem igényli Relatív A génexpresszió vizsgálata Endogén referenciát használ Standard görbe vagy comparatív C T

13 Abszolút Quantitáció - Standard görbe

14 Abszolút Quantitáció - Standard görbe

15 Endogén kontroll használata 18S rrna Acidic ribosomal protein b- Actin Cyclophilin Glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase Phosphoglycerokinase b2-microglobulin b-glucuronidase Hypoxanthine ribosyl transferase Transcription factor IID, TATA binding protein Transferrin receptor

16 Kontroll Komparatív Ct módszer(ddct) PKCα Ct=26 Ct=36 GAPDH amplifikáció PKCα amplifikáció DCt = pkcα Ct - gapdh Ct DCt = 10

17 Kontroll Komparatív Ct módszer (DDCt) DCt = pkc Ct - gapdh Ct PKC PKC DCt=10 Ct=26 Ct=36 DCt=7.5 Ct=25 Ct=32.5 Steroid PKCβ PKCβ DCt=5 Ct=27 Ct=32 DCt=6 Ct=26.5 Ct=32.5

18 Komparatív Ct módszer (DDCt) Ha kétszeres cdns mennyiséget alkalmazunk, mindkét target egy ciklussal hamarabb éri el a küszöböt A DCt viszont állandó marad, tehát független a kiindulási cdns mennyiségétől 10ng cdna 20ng cdna PKCα PKCα Ct=26 Ct=36 DCt=10 Ct=25 Ct=35 DCt=10

19 Komparatív Ct módszer (DDCt) Hogy összehasonlítsuk a kezelés hatására bekövetkező expressziós szintek változásait, a steroid DCt értékekből ki kell vonni a kontroll DCt értékeket PKCα PKCβ PKCδ PKCε K: S: DCt=10 DCt=10 DCt=7.5 DCt=5 DCt=5 DCt=0 DCt=6 DCt=2 DDCt = DCt[steroid]- DCt[kontroll] DDCt= 0 DDCt= -2.5 DDCt= -5 DDCt= -4

20 Komparatív Ct módszer (DDCt) A DDCt értékeket használva az alábbi egyenlet segítségével megkaphatjuk a PKC izoformák szintjeinek a steroid kezelés hatására bekövetkező változását a kontrollra normálva PKCα PKCβ PKCδ PKCε DDCt=0 DDCt=-2.5 DDCt=-5 DDCt=-4 Normalizált PKC a kontrollhoz viszonyítva = 2 - DDCT 2 - DDCT =1 2 - DDCT = DDCT = DDCT =16

21 A KÜLÖNFÉLE SEJTVÁLASZOK VIZSGÁLATI LEHETŐSÉGEI

22 A ligand-receptor interakció vizsgálata - a kötődési (binding) assay Általánosan - elsősorban farmakológiai megközelítés - dózis-hatás görbék & kompetíciós assay-k Alapfeltétel - radioaktivitás használatának lehetősége és képessége Módszer - receptor a sejtben vagy kémiailag tisztítva - inkubáció a radioliganddal - a kapcsolódás leállítása - a non-specifikus kötődés csökkentése (non-radioaktív liganddal) Probléma - gyakran pm nagyságrendű receptor-protein szint meghatározása

23 Percent of maximal binding Fraction of control A ligand-receptor interakció vizsgálata - a kötődési (binding) assay Fig. 1A 1,2 1,0 Fig. 2A 1,2 1,0 0,8 0,8 0,6 0,4 0,2 0, [ 3 H]RTX, pm 0,6 0,4 0,2 0,0 0,01 0, [CAP], M

24 Az enzimek vizsgálata Az enzim, mint fehérje azonosítása - Western blot, immuncito- és -hisztokémia, RT-PCR, Q-PCR Az enzimaktivitás mérése - a kináz assay - enzim (sejtben vagy tisztítva vagy immunkomplexben IP) - aktivátor - szubsztrát, mely foszforilálódik - ATP, ami 32 P jelölt - RADIOAKTÍV!!! - lehet farmakológiai alkalmazása is Az enzim intracelluláris lokalizáció-változásának meghatározásával 1. Szubcelluláris frakcionálás - a citoszol, membrán és citoszkeletális kompartmentek elválasztása - Western blot 2. Konfokális mikroszkópia - immunfluoreszcens festést követően - a mozgás nem (nincs real-time), de az eredmény látható

25 Példa a transzlokációra (PKC)

26 Példa a transzlokációra Frakcionálást követő Western-blot Citoszól Membrán Citoszkeleton Control BRX-235

27 Példa a transzlokációra - konfokális mikroszkópia TRANSZLOKÁCIÓ Kontroll PMA PKC PKCz PKCh PKCq PKCg

28 Az enzimek vizsgálata IGF-I RTK Gab-1 GRB-2 PLC-g PI 3-kináz Ras IP 3 & DAG Raf-1 MAPKK PKC Sejtmag

29 Az enzimek vizsgálata Az enzim-szubsztrát foszforilációjának vizsgálata Az IGF-I hatására nem foszforilálódik az Erk-1, ellentétben az FGF pozitív hatásával Erk-1 perk-1

30 Sejtmagszám Fúziós index A sejtproliferáció vizsgálata Növekedési görbék sejtszámolás, sejtmagszámolás kontroll 0.1 nm 1 nm 10 nm 100 nm 1 M Tenyésztési napok

31 A sejtproliferáció vizsgálata Kettőződési idő = D/log 2 (N/N 0 ) D: tenyésztési napok N 0 : kezdő sejtszám N: maximális sejtszám Kettőződési idő (óra) Szaturációs denzitás (sejtszám/ cm 2 ) Kontroll 23,2 1,4 x 10 5 Szaturációs denzitás A maximális sejtszám meghatározása a konfluencia elérése után 3 nappal. cpkcb 16,5 2,1 x 10 5 npkc 13,2 2,8 x 10 5 cpkc 27,4 1,0 x 10 5 npkc 30,5 0,8 x 10 5

32 A sejtproliferáció vizsgálata Növekedési görbék szőrtüsző szervkultúra

33 A sejtproliferáció vizsgálata Növekedési görbék szőrtüsző szervkultúra Elongatio (%) = L - Lo Lo

34 A sejtproliferáció vizsgálata Ki67 festés immunhisztokémia VIP Rhodamide

35 A sejtproliferáció vizsgálata Nukleotid analógok beépülésének vizsgálata 1. 3 H-timidin inkorporációs assay - radioaktív 2. BrdU (és MTT) kolorimetriás assay - bróm-deoxi-uridin (BdrU), mint timidin-analóg - inkubáció, beépülés - DNS denaturálás - jelölés anti-brdu monoklonális, peroxidáz-konjugált antitesttel - inkubáció a szubsztráttal - kolorimetriás meghatározás 450 nm-en - előnyök: - NEM radioaktív - könnyen ismételhető - ELISA módszer, akár farmakológiai felhasználásra is

36 A kolorimetriás ELISA assay-k (BrdU, MTT)

37 Sejtproliferáció (a kontroll %-a) Sejtproliferáció (a kontroll %-a) Példa a BrdU assay-re PMA [nm] GF109203X [nm]

38 Sejtproliferáció (A 550nm ) Példa az MTT assay-re 1,4 npkc cpkcb 1,2 1,0 Kontroll 0,8 0,6 cpkc npkc 0,4 0,2 0,0 Tenyésztési idő (nap) átlag SEM

39 5d 8d 9d 10d 14d 16d 24d 28d 36d A differenciálódás vizsgálata A differenciálódási markerek kimutatása - Western blot, immunhisztokémia, áramlási citometria, RT-PCR, Q-PCR tenyésztési napok DESMIN

40 Normalized OD (%) A differenciálódás vizsgálata Western blot A B PMA [nm] K10 K INV FIL TG K10 K17 INV FIL TG PMA [nm]

41 A porcosodás mértéke (%) A differenciálódás vizsgálata hisztológia Dimetil-metilénkék festés 220 K K+OA GF GF+OA Gö Gö+OA

42 A differenciálódás vizsgálata Oil-Red festés 0% FCS 10% FCS Oil Red O festés 40x

43 A sejthalál vizsgálata Necrosis - a sejttenyésztő médium mikroszkópos vizsgálata - sejtszámolás - az MTT assay - az élő sejtszám meghatározása - MTT - tetrazólium gyűrű - mitokondriális hasítás - az élet jele - oldhatatlan formazán - kolorimetriás meghatározás - az LDH assay a sejtekből necrosis hatására felszabaduló laktát-dehidrogenáz kolorimetriás mérése Apoptosis 1. Korai apoptosis - membránperturbáció - annexin-v, FITC, áramlási citometria - DNS fragmentáció - specifikus ELISA 2. Késői apoptosis - necroticus jelleg - propidium-jodid - magfestés, flow cytometry

44 Apoptotic cell number (% of total) Az apoptosis vizsgálata Annexin-V meghatározása áramlási citometriával Basal Vitamin D 3 TNF C b

45 Az apoptosis vizsgálata TUNEL immunhiszto- és -citokémia Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling

46 Percentage of positive cells Sejtproliferáció és apoptosis együttes vizsgálata Ki67 és TUNEL kettős festés MK MK DP DP Control * * Capsaicin Ki-67 TUNEL

47 A mediátortermelés vizsgálata Általánosan - vazoaktív metabolitok (pl. hisztamin) - növekedési faktorok - citokinek (pl. interleukinok) Módszerek - RT-PCR, Q-PCR - Western blot - Immunhiszto- és -citokémia - Áramlási citometria - RIA, EIA, ELISA - citotoxicitás assay sejtkultúrában (pl. TNF- )

48 MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI TECHNIKÁK

49 Molekuláris biológiai technikák Általánosan - rekombináns technikák - vektorok, mint cdns hordozók - rezisztencia - bevitel baktériumba: transzformáció - bevitel eukariótába: transzfekció - módok: Ca-foszfát, detergens - nukleofekció - stabil - klónok szelektálása - tranziens - tag - azonosítás & megkülönböztetés & ellenőrzés (Western, IH) - elméletileg minden expresszálható, ami nem toxikus - mutánsok, domináns-negatív mutánsok -???fiziológiás???

50 Transzfekció lipid detergens segítségével

51 Nukleofekció

52 Nukleofekció

53 Molekuláris biológiai technikák Expressziós rendszerek 1. Homológ rendszer - az adott sejt működésének vizsgálata a cél - a rekombináns sejtalkotó(k) overexpressziójának hatása - lehet primer kultúrákban is (csak tranziens) 2. Heterológ rendszer - az adott overexpresszált sejtalkotó működésének vizsgálata a cél - általában host-sejtek (cos-7, CHO, tsa-hek), melyek üresek - lehetőség (ajánlott) stabilan transzfektált klónok szelektálása - általában csatornák, receptorok, enzimek overexpressziója - farmakológiai lehetőségek

54 Molekuláris biológiai technikák A Green Fluorescent Protein (GFP) rendszer - speciális vektorok - X-GFP fúziós protein expressziója - N- vagy C-terminális fúzió (nem mindegy!) - tranziens & stabil expressziós lehetőségek - van BFP & RFP is - előny: - azonosítás egyedi sejtszinten - sejtélettan - real-time : a mozgás vizsgálatának lehetősége!!! - hátrány: - nagy (30 kd), tehát befolyásolhat mozgást, aktivációt - megfelelő műszerezettséget igényel - nálunk: - TRPV1 - DHPR - PKC izoformák

55 Fluorescent ratio Példa a GFP-kapcsolt fúziós proteinekre A vanilloid receptor (VR1) funkcionális expressziója cos-7 sejtekben 4 CAPSAICIN Time [s] Konfokális kép Funkcionális kalciummérés

56 Molekuláris biológiai technikák A p MTH vektor - MTH vektor metallotionein promoter (Zn) - a PKC specifikus 12 aminosav szekvenciája - C-terminális fúzió - stabil expressziós klónok szelektálhatók (G418) - előny: - tranziens és stabil expresszió - indukálhatóság, az expresszió fokozása - kicsi, ezért nem befolyásol mozgást és aktivitást - endogén-exogén megkülönböztethetőség - immunprecipitáció - hátrány: - nem látható egyedi sejtszinten - nálunk: - PKC izoenzimek - VR1

57 Kinase activity (% of control) Példa az p MTH-PKCx vektorokra PKC overexpresszor HaCaT klónok endogén PKC PKC overexpressers C b b C T rekombináns PKC izoforma H-III MLCK C b

58 Molekuláris biológiai technikák A Tet-Off vektor rendszer - ptet-off regulátor plazmid - puhg plazmid a kivánt cdns szekvenciával - folyamatos tenyésztés tetraciklin jelenlétében represszió - tetraciklin elhagyása - indukció - előny: - indukálhatóság - szabályozható az expresszió mértéke (toxicitás) - stabil expresszió - hátrány: - nem látható egyedi sejtszinten - nálunk: - VR1

59 Példa a Tet-Off expressziós rendszerre VRI-CHO sejtek (hrs) VR1 A tetraciklin megvonás hatása

60 Molekuláris biológiai technikák sirna