Új generációs sporttudományi képzés és tartalomfejlesztés, hazai és nemzetközi hálózatfejlesztés és társadalmasítás a Szegedi Tudományegyetemen

Átírás

1 Új generációs sporttudományi képzés és tartalomfejlesztés, hazai Pályázati azonosító: TÁMOP E-15/1/Konv alprojekt Sportélettani képzés és tartalomfejlesztés Pilot 1: Dinamikus változások követésére szolgáló RNS markerek kimutatási módszerének kidolgozása patkány és humán nyálmintából Szakmai beszámoló

2 MEGVALÓSÍTOTT CÉLKITŰZÉSEK 1. Egy olyan nem invazív módszer optimalizálását, kidolgozását és validálását valósítottuk meg, amellyel a későbbiekben képesek leszünk nyálból génaktivitási mintázatok pontos és reprodukálható elemzésére akár nagyobb populáció esetében is. 2. A mérésekhez megfelelő mintavételi és nukleinsav preparálási módszert dolgoztunk ki. 3. Markergén panelt hoztunk létre a későbbi átfogó vizsgálatokhoz. 4. Vizsgáltuk a fizikai állapottal, immunrendszerrel, gyulladással kapcsolatos gének kifejeződését. 5. Létrehoztunk egy kezdeti génpanel reagens készletet, amely már validált génaktivitási mintázat meghatározására is alkalmas EREDMÉNYEK 1. Nem invazív módszer optimalizálása, kidolgozása és validálása Az eddigi eredmények arra utalnak, hogy a nem-invázív módszerrel nyerhető nyálminták alkalmasak lehetnek a különböző génmarkerek kimutatására a vizsgált csoportokban. Tapasztalataink alapján egy olyan protokoll kidolgozását végeztük el, mely alkalmas a nyálminták mintavételezésére, stabilizációs puffer alkalmazásával annak szállítására, RNS kinyerésére, cdns átírásra és abból valós-idejű kvantitatív PCR (QRT-PCR) módszerrel történő génexpresszió meghatározására. A mintavétel során centrifugált nyál mintákat az RNS degradációját megakadályozó pufferben tároltuk fagyasztott állapotban. A protokoll szerint több fagyasztott minta együttes, párhuzamos feldolgozása is lehetővé vált. A módszer kidolgozása során belső kontrollgének paneljével definiáltuk az optimálisan használható referenciagéneket. A nem invazív módszer validálását erős fizikai stressznek kitett, egészséges emberek és kontrollként, nyugalmi állapotban lévő, egészséges emberek nyálának génexpressziós vizsgálatával validáltuk immunrendszerrel kapcsolatos gének aktivitásának kimutatásával. 2. A mérésekhez megfelelő mintavételi és nukleinsav preparálási módszer kidolgozása A protokollnak egyik fontos eleme, hogy amíg a korábban alkalmazott módszer során teljes nyálmintát alkalmaztak például szájüregi és fej-nyaki tumorok diagnosztikája érdekében, addig mi a jelen projektben kifejezetten a keringő, szabad mrns-re koncentráltunk. Ennek érdekében a nyálmintákat a levétel után centrifugáltuk, így a nyálban található sejtes elemektől megszabadulva csökkentettük azt a hátteret, mely elsősorban a száj nyálkahártyájáról leváló sejtek okozhatnak. Amíg a tumordiagnosztika elsősorban a nyálban előforduló tumorsejtek szeparációját és annak molekuláris vizsgálatát végzi, a mi megközelítésünk során a nyálmirigyek, epitélsejtek, immunsejtek által kiválasztott, elsősorban vezikulákban található RNS-ek tanulmányozására alkalmas módszer kidolgozása volt a cél.

3 Mivel nehéz a centrifugálást követően a felülúszóból mintát felpipettázni, nagyon viszkózus és a pipettázás könnyen felszív a csapadékból is, megpróbáltuk centrifugálás előtt a nyálmintával azonos térfogatú fiziológiás sóoldattal elkeverni a nyálmintát, majd újabb stablilitásvizsgálatot végeztünk. Az eredmények értékeléséből az látszott, hogy a nem centrifugált nyálminták eredményei nagyobb szórást adtak, mint a centrifugált minta felülúszója. A centrifugált nyálminta időfüggés vizsgálata pedig azt mutatta, hogy még 16h szobahőn állást követően is stabil volt a minta DNS kimutatáshoz. A génexpressziós vizsgálatokhoz azonban az általunk beállított protokoll szerint a nyál centrifugálása után azonnali stabilizáció és fagyasztás következik. A nukleinsav preparálási módszer során módosított Bioneer protokollt alkalmaztunk, melynek során a centrifugálás után a nyál felülúszójához merkaptoetanolt és alkoholt tartalmazó lízispuffert adtunk. A feldolgozás után az RNS mennyiségét spektrofotometriásan mértük le. Egységnyi teljes RNS-t alkalmaztunk a cdns szintézis során az egyes minták pontos összehasonlítása érdekében. Összefoglalásként megállapítható, hogy a nukleinsav kinyerési módszerek optimalizálásakor az irodalomban található leírások és hozzáférhető reagens kitek alapján dolgoztunk ki egy validált eljárást, amely képes nagy tisztaságú RNS-t eredményezni további vizsgálatokhoz. 3. Markergén panel létrehozása a későbbi átfogó vizsgálatokhoz Első lépésben a módszer optimalizációját követve belső kontrollgének paneljét hoztuk létre, mely különösen fontos az egyedi minták standardizált génexpressziós vizsgálatakor. A vizsgálathoz egészséges, kontroll emberek nyálát használtuk fel. A következő gének aktivitását végeztük el QRT-PCR módszerrel: ACTB, GUSB, GAPDH, HPRT, P6GD, TBP. A vizsgált hat referenciagén közül öt mutatott szignifikáns, és markergén vizsgálatban is alkalmazható aktivitásszintet: ACTB, GUSB, GAPDH, HPRT, TBP. A P6GD gén kifejeződését az általunk alkalmazott kísérleti körülmények között nem tudtuk kimutatni.

4 GAPDH ACTB GUSB HPRT TBP P6GD Összefoglalva, olyan stabil markergéneket azonosítottunk, melyeket belső kontrollként lehet alkalmazni. Ennek a módszer beállításnak kifejezetten nagy jelentősége van a pályázaton túlnyúló, új a nyálból azonosítható diagnosztikai markerek átfogó vizsgálatára épülő projektek során. Korábbi vérből kapott génexpressziós eredményeinkre és ugyancsak vérből származó irodalmi adatokra támaszkodva több olyan génre terveztünk primer szekvenciákat SybrGreen és Taqman QRT-PCR módszerekre, amelyek a fizikai teljesítménnyel összefüggésbe hozható immunfolyamatokkal kapcsolatos fehérjéket kódolnak. A pályázat során olyan markergén panelt hoztuk létre a későbbi átfogó vizsgálatokhoz, melyek az immunrendszerrel és stresszfolyamatokkal is kapcsolatosak. A feladat során a vizsgálni kívánt referenciagénekkel együtt összesen 64 markergén panelt hoztunk létre, melyet az alábbi táblázat mutat be:

5 Gén kód Hozzáférési szám Gén teljes neve 1 Daxx AB Daxx 2 Ccr3 AF chemokine receptor CCR3 gene 3 Elk1 AF potassium channel (elk1) mrna 4 Cdc42 AF cell division cycle 42 (cdc42) mrna 5 Csf1 AF colony stimulating factor-1 (Csf1) mrna 6 Il18 AY IFN-gamma-inducing factor IL-18 (Il18) mrna, completecds. 7 Ccr7 AY chemokine receptor 7-like protein (Ccr7) mrna, 8 H2-Ea AY strain ACI/SegHsd MHC class II antigen (RT1-Da) mrna 9 Cd55 BC Cd55 molecule (cdna clone MGC:72267 IMAGE: ) 10 Fos DQ proto-oncogene cfos (Fos) gene 11 Gapdh M Rat glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH) 12 Ccl7 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 7 (Ccl7) 13 Ccl21b NM_ chemokine (C-C motif) ligand 21 (Ccl21) 14 Ccl24 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 24 (Ccl24) 15 Hmgn1 NM_ high-mobility group nucleosome binding domain 1 (Hmgn1) 16 Ifna1 NM_ interferon-alpha 1 (Ifna1) 17 Hras1 NM_ Harvey rat sarcoma virus oncogene (Hras) 18 Hras1 NM_ Harvey rat sarcoma virus oncogene (Hras) 19 Il10rb NM_ interleukin 10 receptor, beta (Il10rb) 20 Ccl19 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 19 (Ccl19) 21 Ddit3 NM_ DNA-damage inducible transcript 3 (Ddit3) 22 Hprt1 NM_ hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (Hprt1) 23 Cd4 NM_ Cd4 molecule (Cd4) 24 Il10 NM_ interleukin 10 (Il10) 25 Fasl NM_ Fas ligand (TNF superfamily, member 6) (Faslg) 26 Ccl3 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 3 (Ccl3) 27 Il15 NM_ interleukin 15 (Il15) 28 Gusb NM_ glucuronidase, beta (Gusb) 29 Il1a NM_ interleukin 1 alpha (Il1a) 30 Crp NM_ C-reactive protein, pentraxin-related (Crp) 31 Csf3 NM_ colony stimulating factor 3 (granulocyte) (Csf3) 32 Ccl11 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 11 (Ccl11) 33 Hc NM_ clathrin, heavy chain (Hc) (Cltc) 34 Cltc NM_ clathrin, heavy chain (Hc) (Cltc) 35 Ccr1 NM_ chemokine (C-C motif) receptor 1 (Ccr1) 36 Cxcl5 NM_ chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (Cxcl5) 37 Il12b NM_ interleukin 12B (Il12b) 38 Cebpb NM_ CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta (Cebpb) 39 Cxcl1 NM_ chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (Cxcl1) 40 Atf2 NM_ activating transcription factor 2 (Atf2) 41 Ccl5 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 5 (Ccl5) 42 Il1b NM_ interleukin 1 beta (Il1b) 43 Ccl2 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 2 (Ccl2) 44 Hspb1 NM_ heat shock protein 1 (Hspb1) 45 Pgk1 NM_ phosphoglycerate kinase 1 (Pgk1) 46 Cd40lg NM_ CD40 ligand (Cd40lg) 47 Il12a NM_ interleukin 12A (Il12a) 48 Cxcl2 NM_ chemokine (C-X-C motif) ligand 2 (Cxcl2) 49 Il13 NM_ interleukin 13 (Il13) 50 Ccl4 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 4 (Ccl4) 51 Ccl22 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 22 (Ccl22) 52 Il11 NM_ interleukin 11 (Il11) 53 Ccr4 NM_ chemokine (C-C motif) receptor 4 (Ccr4) 54 Creb1 NM_ camp responsive element binding protein 1 (Creb1) 55 Ifng NM_ interferon gamma (Ifng) 56 Cxcl10 NM_ chemokine (C-X-C motif) ligand 10 (Cxcl10) 57 Cxcl9 NM_ chemokine (C-X-C motif) ligand 9 (Cxcl9) 58 Tubb5 NM_ tubulin, beta 5 class I (Tubb5) 59 Hspb2 U HSPB2 gene 60 Ccr2 U chemokine receptor CCR2 gene 61 Cxcr4 U CXC chemokine receptor (CXCR4) mrna 62 Hdac4 XM_ histone deacetylase 4 (Hdac4) 63 Csf2 XM_ colony stimulating factor 2 (Csf2) 64 Il18rap XM_ interleukin 18 receptor accessory protein (Il18rap)

6 4. A fizikai állapottal, immunrendszerrel, gyulladással kapcsolatos gének kifejeződésének vizsgálata Korábbi vérből kapott génexpressziós eredményeinkre és ugyancsak vérből származó irodalmi adatokra támaszkodva több olyan génre terveztünk primer szekvenciákat SybrGreen és Taqman QRT-PCR módszerekre, amelyek a fizikai teljesítménnyel összefüggésbe hozható immunfolyamatokkal kapcsolatos fehérjéket kódolnak. A pályázat során sikeresen kimutattuk a következő gének kifejeződését. Legfontosabb eredményeink között szerepel, hogy a protokoll kidolgozása után validációs vizsgálatokat is végeztünk. A SybrGreen protokoll is megbízható eredményt adott, amit a reakciók utáni olvadásgörbe, és a csak primert tartalmazó negatív kontrollreakciók is igazoltak. Ennek a validációs módszernek az volt a fő célja, hogy a sokkal költséghatékonyabb SybrGreen protokollt is tudjuk alkalmazni a jövőben, így sokkal több gén vizsgálata is lehetővé válik. Az alábbi ábra bemutatja, hogy a templát nélküli (rózsaszínnel jelölt olvadási görbe) eltérő (nem helyes) Tm-pontot definiál, míg a validációs expressziós vizsgálatban alkalmazott különböző nyálminták által kapott olvadási görbék (rózsaszíntő eltérő görbék) helyes Tmpontot eredményeztek.

7 A fizikai állapottal, immunrendszerrel, gyulladással kapcsolatos gének kifejeződésének vizsgálatát erős fizikai stressznek kitett, egészséges emberek és kontrollként, nyugalmi állapotban lévő, egészséges emberek nyálának génexpressziós vizsgálatával validáltuk. 5. Kezdeti génpanel reagens készlet létrehozása, amely már validált génaktivitási mintázat meghatározására is alkalmas A korábban a markergén panel létrehozása a későbbi átfogó vizsgálatokhoz alfeladat során definiált 64 gént lefuttattuk QRT-PCR módszerrel több nyugalmi állapotban lévő, egészséges emberek nyálából tisztított, majd abból cdns-t szintetizált templáton. Célunk az volt, hogy a későbbi vizsgálatokhoz leszűkítsük azt a marker génpanelt, amely már validált génaktivitási mintázat meghatározására is alkalmas. Ez a kezdeti génpanel természetesen a továbbiakban tovább bővíthető, vagy akár módosítható is olyan fókuszált, esetleg betegséggel kapcsolatos markergének beiktatásával is, amelyek egy nagyobb szűrési projekt része lehet. A jelen projektben a validációs QRT-PCR kísérletek során összesen 24- es panelt hoztunk létre, amely tartalmazta az általunk optimalizált referencia génpanelt is. Az alábbi táblázat mutatja be a végső 24-es génpanelünket:

8 Gén kód Hozzáférési szám Gén teljes neve 1 Csf1 AF colony stimulating factor-1 (Csf1) mrna 2 Il18 AY IFN-gamma-inducing factor IL-18 (Il18) mrna, completecds. 3 Gapdh M glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase (GAPDH) 4 Hmgn1 NM_ high-mobility group nucleosome binding domain 1 (Hmgn1) 5 Ccl19 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 19 (Ccl19) 6 Ddit3 NM_ DNA-damage inducible transcript 3 (Ddit3) 7 Hprt1 NM_ hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (Hprt1) 8 Gusb NM_ glucuronidase, beta (Gusb) 9 Il1b NM_ interleukin 1 beta (Il1b) 10 Crp NM_ C-reactive protein, pentraxin-related (Crp) 11 Csf3 NM_ colony stimulating factor 3 (granulocyte) (Csf3) 12 Ccl11 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 11 (Ccl11) 13 Cxcl5 NM_ chemokine (C-X-C motif) ligand 5 (Cxcl5) 14 Il12b NM_ interleukin 12B (Il12b) 15 Cebpb NM_ CCAAT/enhancer binding protein (C/EBP), beta (Cebpb) 16 Cxcl1 NM_ chemokine (C-X-C motif) ligand 1 (Cxcl1) 17 Atf2 NM_ activating transcription factor 2 (Atf2) 18 Ccl2 NM_ chemokine (C-C motif) ligand 2 (Ccl2) 19 Hspb1 NM_ heat shock protein 1 (Hspb1) 20 Pgk1 NM_ phosphoglycerate kinase 1 (Pgk1) 21 Ifng NM_ interferon gamma (Ifng) 22 Tubb5 NM_ tubulin, beta 5 class I (Tubb5) 23 Hspb2 U HSPB2 gene 24 Csf2 XM_ colony stimulating factor 2 (Csf2) Összefoglalva, a jelen feladatban létrehoztunk egy olyan kezdeti génpanel reagens készletet, amely már validált génaktivitási mintázat meghatározására is alkalmas lesz nyálból, és amelynek bővítését a pályázat befejezése után, más források bevonásával valósítunk meg.