ABC transzporterek az ssejtekben

Átírás

1 E01 ABC transzporterek az ssejtekben Sarkadi Balázs 1, Laczka-Özvegy Csilla 1, Barry N.Elkind 1, Homolya László 1, Szentpétery Zsófia 1,2, Váradi András 2, Várady György 1, Ujhelly Olga 1, Cervenák Judit 1, Bácsi Krisztián 1, Német Katalin 1 1 Országos Gyógyintézeti Központ, Haematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest, 2 MTA-SZBK Enzimológiai Intézet, Budapest Az ABC (ATP-Binding Cassette) fehérjecsalád tagjai homológ transzmembrán doménekb l (TMD) és nukleotid-köt doménekb l (ABC) épülnek fel. Az ABC fehérjék az ATP kötése és hidrolízise révén felszabaduló energiát úgy alakítják át konformációs mozgássá, hogy különböz fiziológiai funkciókat látnak el: lehetnek aktív transzporterek, ion-csatorna regulátorok, vagy receptorok. Az emberi genomban 48 ABC fehérjét kódoló gént azonosítottak, de az ABC fehérjék valamennyi eddig megismert genomban megtalálhatóak. Munkacsoportunk els sorban azokkal az ABC transzporterekkel foglalkozik, amelyek gyógyszerek és változatos xenobiotikumok aktív transzportjára képesek (ún. multidrog transzporterek). A három nagyobb alcsaládba (ABCB/MDR, ABCC/MRP, és ABCG2) tartozó multidrog transzporterek a szervezetben els sorban méregtelenít funkcióval rendelkeznek, míg felszaporodásuk esetén a rákos daganatokban széleskör gyógyszerrezisztenciát okoznak. ssejtekben. Különösen az ABCG2 fehérjér l vált ismertté, hogy több ssejt-típusban is Az elmúlt évek kutatásai szerint egyes ABC transzporterek kitüntetett szerepet játszanak az nagymértékben kifejez dik, így az ssejtek kiválogatására is felhasználható. A vérképz ssejtek esetében ugyanez a fehérje védelmet biztosít a hipoxiás károsodással szemben, míg a daganat- ssejtekben való megjelenése éppen a betegséget fenntartó sejtek gyógyszeres eltávolítását gátolhatja meg. Az el adásban azokról az új eredményekr l számolok be, amelyeket munkacsoportunk az emberi ABCG2 fehérje funkciójának és molekuláris mechanizmusának vizsgálatában, ill. antitestekkel és funkcionális módszerekkel történ specifikus detektálásában ért el. Különösen izgalmas területet jelent kutatásainkban az ABCG2 fehérje génterápiás - sejtterápiás alkalmazásának kidolgozása. A saját ssejtek genetikai módosítása forradalmi áttörést ígér az orvoslásban, ugyanakkor az ex vivo génterápia fontos segít je megfelel szelekciós markerek alkalmazása. Az ABCG2 pont-mutáns formái nagy hatékonysággal, de az endogén fehérjét l eltér en transzportálnak változatos gyógyszereket, így az ssejtekben elvégezhet kifejeztetésük lehet séget ad a génterápiás alkalmazásra. Legújabb in vitro és in vivo eredményeink egyaránt ígéretesek ezen a területen. Kulcsszavak: ABC (ATP-Binding Cassette) transzporterek, ABCG2, MDR1/Pglycoprotein, multidrog transzporter fehérjék, gén-terápiás szelekciós marker 26

2 E02 A lipid környezet hatása az ErbB2 receptor tirozinkináz jelátviteli folyamataira Herceptin rezisztens és szenzitív sejtvonalakon Szöll si János, Nagy Péter, Vereb György Debreceni Egyetem, Biofizikai és Sejtbiológia Intézet, Debrecen Az ErbB2 (HER2) fehérje az EGF transzmembán receptor tirozinkináz család (ErbB család) tagja. Bár az ErbB2 fehérjének nincs ismert ligandja, a legújabb biofizikai és biofizikai eredmények szerint az ErbB2 fehérje más ErbB fehérjék preferált heteroasszociációs partnere. Orvosi jelent sége abban áll, hogy túlzott kifejez dése eml és egyéb tumorokban együtt jár különböz tumoros fenotípus változással, például magasabb transzformációs képességgel, emelkedett metasztatikus potenciállal, megnövekedett angiogenezissel és drog rezisztenciával. A klinikai gyakorlatban már alkalmaznak egy ErbB2 ellenes humanizált antitestet a Herceptint (vagy trastuzumab-t), amely az ErbB2 pozitív eml tumorok ~40%-ában citosztatikus hatással bír. Munkahipotézisünk szerint az ErbB receptor tirozinkinázok expressziós szintje, egymással, valamint más sejtfelszíni molekulákkal mutatott kölcsönhatása a multimolekuláris komplexekben, ill. a komplexek lipid környezete meghatározza a ErbB2 ellenes terápia eredményét. Összehasonlítottuk az ErbB2 fehérje integrinnel és lipid tutajokkal mutatott asszociációs mintázatát Herceptin rezisztens (JIMT-1, MKN-7) és szenzitív (SKBR-3, N-87) sejtvonalakon. Áramlási citometriás fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) mérések és konfokális mikroszkópos vizsgálatok alapján megállapítottuk, hogy az ErbB2 és beta1- integrin molekuláris asszociációt mutat a sejtek felszínén, és kolokalizálódnak egymással és a lipid tutajokkal. Az a tény, hogy az ErbB2 és a beta1-integrin gyenge funkcionális kölcsönhatást mutat és, hogy az ErbB2 nem követi az beta1-integrin keresztkötésével kiváltott foltképz dést a sejtek felszínén, arra utal, hogy az ErbB2 és a beta1-integrin funkcionális szempontból jól megkülönböztethet molekuláris klasztereket képez. Bár a Herceptin szenzitív sejtek felszínén több ErbB2 és kevesebb beta1-integrin molekula volt, mint a rezisztens sejtekén, ez a megfigyelés valószín leg nem magyarázza meg a Herceptin rezisztencia fenotípusát, miután csak gyenge kölcsönhatást tapasztaltunk az ErbB2 és az beta1-integrin között. Megfigyeléseink arra utalnak, hogy a Herceptin rezisztens sejtek felszínén jóval kevesebb az aktív ErbB2 homodimer, ezért a sejtosztódását kiváltó jelátviteli folyamatok más ErbB dimert l, valószín leg ErbB2-ErbB3 heterodimert l indulhatnak ki. Eredményeink azt sugallják, hogy a tumoros transzformációban szerepl fehérjék szerepének megítélésekor az expressziós szintjükön túl, molekuláris kölcsönhatásaikat is figyelembe kell vennünk. Kulcsszavak: ErbB2 receptor tirozin kináz, lipid tutaj, trastuzumab rezisztencia, beta-1 integrin, fluoreszcencia rezonnacia energia traszfer 27

3 E03 Exploring the interplay between chromosome structure, nuclear architecture and genome stability Chi Tang, Apolinar Maya-Mendoza, and Dean Jackson University of Manchester, Faculty of Life Science, UK In higher eukaryotes, extremely complex regulatory systems are known to control fundamental chromatin functions transcription, DNA replication and DNA repair. In the cell, these different regulatory systems must interact to define a coherent regulatory network. In proliferating cells, and particularly during development, patterns of gene expression must be preserved in cells that have active DNA repair mechanisms and efficiently duplicate both DNA and the associated chromatin status the histone code. The systems that regulate DNA synthesis and genome stability are integrated with those that regulate the efficacy of RNA synthesis so that both the integrity of the genome and patterns of gene expression are maintained. I will describe how a detailed understanding of nuclear architecture is allowing us to explore the interplay between the nuclear systems that regulate fundamental aspects of chromatin function. The principles of nuclear organisation will be explored and the molecular mechanisms that define chromosome structure and nuclear architecture discussed. A critical aspect of this analysis will be to understand how active nuclear compartments are defined and how cross talk between the different chromatin functions is established. For example, using RNAi techniques to manipulate the structure of the nucleoskeleton in mammalian cells, I will describe how the nuclear compartments can be structured in space and evaluate the impact of these observations on chromatin function. In describing how both nuclear architecture and chromosome structure can impact on chromatin function I will emphasise how DNA foci represent structural units of chromosomes and also play a crucial role in dictating the course of S phase in mammalian cells. I will describe how S phase is regulated in vertebrate cells and how surveillance mechanisms control the activation of potential replication origins and the interaction of systems that drive DNA replication and repair. 28

4 E04 Sejtmagi fehérjekomplexek szerepe a fényindukált jelátvitelben Kishore Panigrahi, Tim Kunkel, Ádám Éva, Medzihradszky Katalin, Klement Éva, Eberhard Shchäfer, Nagy Ferenc MTA SZBK és Albert-Ludwigs Universität, Németország A magasabbrend növények vörös/távoli vörös fényt elnyel fotoreceptorai, a fitokrómok meghatározó szerepet játszanak a növények fényfügg egyedfejl désében (fotomorfogenezis). A fitokróm fotoreceptor család által indukált jelátviteli lánc(ok) a fotomorfogenezist els sorban a transzkripció szintjén szabályozzák. A fitokrómok a fotonabszorbciót követ en a sejtmagba transzlokálódnak és a ott különböz fehérje-komplexek alkotórészeként detektálhatók. A fitokrómok sejtmagba iráyuló importját és a sejtmagi komplexek szervez dését a fény min sége és intenzitása szabályozza. A sejtmagi, fitokrómokat tartalmazó fehérje-komplexek biológiai funkciójának felderítése érdekében a fitokróm-b fotoreceptort tartalmazó fehérje-komplexet izoláltuk, a komplexben található fehérjéket tömegspektrogáfiás és immun-elektronmikroszkópos módszerekkel azonosítottuk és szerepüket a fényindukált jelátviteli láncban specifikus mutánsok izolálásával és jellemzésével meghatároztuk. Eredményeink arra engednek következtetni, hogy ezek a növényi sejtmagban fény hatására szervez d fehérje-komplexek az állati sejtekben található ICG komplexek (interchromatin granule clusters) növényi homológjai és valószín leg szerepet játszanak a fotoreceptorok degradációjában és specifikus mrns-ek fényfügg processzálódásában. Kulcsszavak: fény, fotoreceptor, sejtmag, transzkripció, ICG komplex E05 Miért tesznek a muslica n stények anyai eredet -tubulint petéikbe? Szabad János, Venkei Zsolt és Gáspár Imre Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Biológiai Intézet A Kavar 18c domináns mutációt hordozó Kavar 18c /+ Drosophila n stények petéiben, bár megtermékenyülnek, nem kezd dik el az embriógenezis. S t azokban a petékben sem, amelyek a kavar r revertáns allélokra homo-, vagy hemizogóták. A Kavar 18c /+ és a kavar r / n stények petéiben egy kis mikrotubulus pamacs és két leánycentroszóma látszik egymás közelében. Duplikációkkal, betérképeztük a Kavar 18c mutációt: a Kavar 18c /+/+ n stények sok petéjében elkezd dik (de nem fejez dik be) az embriógenezis, jelezve, hogy Kavar 18c a funkciónyeréses, azon belül is a domináns negatív mutációk egyike. A Kavar 18c mutáció funkciónyeréses természetét az is mutatja, hogy a Kavar 18c / n stények petéib l izolált citoplama toxikus: vadtípusú embrióba injektálva megakadályozza a hosszú mikrotubulusok (MTk) képz dését, az orsórendszer kialakulását. De csak akkor, ha olyan 29

5 szinciciális embriókba injektáljuk, amelyekben a sejtmagok még távol vannak egymástól. A blasztoderma stádium el tti embriókba injektálva, melyekben a sejtmagok közel vannak egymáshoz, a citoplazma hatástalan. A kavar r / n stények (ahol egy deficienciát szimbolizál), megmutatták, hogy az ép Kavar gén a 67C citológiai régióban, egy olyan 30 kbpnyi szakaszban van, amelyben négy gén ismert. Az egy-egy gént tartalmazó transzgének (TG) megmutatták, hogy Kavar 18c és kavar r allélok az Tubulin67C gént azonosítják: a Kavar 18c /+; TG Tub n stények utódai csaknem kikelnek, a kavar r / ; TG Tub n stények fertilisek. Az Tubulin67C gén az anyai hatású -tubulin 4 izoformát kódolja. Egy vadtípusú Drosophila n stény petéjében három -tubulin féleség van: a konstitutiven expresszálódó, evolúciósan er sen konzervált -tubulin 1 és -tubulin 3, amelyek a pete citoplazma - tubulin készletének 80%-át teszik ki, valamint -tubulin 4. Bár kavar r / n stények petéiben meglehet sen sok -tubulin van a -tubulinok mellett, mégis csak rövid MTk képz d- nek, jelezve, hogy az -tubulin 4 a hosszú MTk képz déséhez szükséges. Azt gondoljuk, hogy az -tubulin 4 funkciója a RanGTP/RanGDP gradiens érzékelése. Az EMS-indukált Kavar 18c egyetlen bázispárcsere típusú mutáció (G 244 A) eredménye. A Kavar 18c -kódolt -tubulin 4 mutáns E82K molekulában annak a Glu 82 nak a helyét Lys foglalja el, amely egy Mg 2+ ionon át GTP-t köt, az -tubulin szerkezeti elemét. Az E82K -tubulin 4 molekulák ugyan beépülnek a MTk-ba, ám lévén instabilak, a mikrotubulusok széteséséhez vezetnek. Kulcsszavak: -tubulin, mikrotubulus, anyai hatás, domináns negatív mutáció, Drosophila E06 Genetikai fogékonyság eml rákra Oláh Edit Országos Onkológiai Intézet, Molekuláris Genetikai Osztály, Budapest Az orvostudomány korszakos felfedezésének bizonyult az ezredforduló éveiben azon gének megismerése, amelyek öröklött meghibásodása nagymértékben fokozza a mutációhordozók daganatos megbetegedési kockázatát. Tíz éve ismertük meg a legtöbb örökletes eml rákkal kapcsolatba hozható BRCA1 és BRCA2 gént. E gének m ködésével, meghibásodásaikkal kapcsolatos kutatás az utóbbi években sok új ismeretet eredményezett az eml rákról, a rák iránti genetikai fogékonyságról, de a várt áttörés az eml rákok (és petefészekrákok) kezelésében és megel zésében még nem következett be. A kockázati adatok korlátozott értékelhet sége ellenére a BRCA-teszt (a BRCA1 és BRCA2 gének öröklött meghibásodásával kapcsolatos genetikai rákhajlam meghatározása) mára beépült a klinikai onkológiai gyakorlatba. Az el adás ismerteti a daganatos prediszpozició genetikai alapjait tisztázó nemzetközi vizsgálatok és munkacsoportunk legfrissebb kutatási eredményeit, valamint bemutatjuk a daganatos betegséghajlam felmérésére végzett molekuláris genetikai sz r vizsgálataink hazai tapasztalatait. OTKA T és OM Széchenyi terv NKFP 1/48/2001 támogatással végzett munka. 30

6 E07 Lipidomika: új módszerek - új szemlélet Balogh Gábor, Horváth Ibolya, Vígh László MTA Szegedi Biológiai Központ Biokémiai Intézet, Szeged A lipidomika - a genomika és a proteomika tesvéreként - robbanásszer fejl désnek indult azzal a céllal, hogy rendszerszemlélet megközelítéssel tanulmányozhassuk az él lények szerv, sejt vagy akár sejtorganellum szint lipidprofilját - lipidom -ját, valamint a lipidek és fehérjék funkcionális szervez dési hierarchiát, amelyek az életfolyamatok m ködését meghatározzák. Az elmúlt húsz és különösen az utóbbi néhány év gyökeresen megváltoztatta a lipidek szerepér l alkotottt képünket. Egyre több lipidosztályhoz, ill. molekula specieszhez rendelhet ek egyedi funkciók: az arachidonsav kitüntetett szerepének megértését l mára eljutottunk az omega3 zsírsavak beható funkcionális vizsgálatáig, vagy a sejtben csak mintegy 3%-ban jelenlev foszfatidil-szerin szubmembrán szint viselkedésének elemzéséhez az apoptózis folyamataiban. Bizonyos membrán mikrodomének - a raftok, a receptorm ködés, az immunválasz vagy a transzportfolyamatok tanulmányozásának megkerülhetetlen objektumaivá váltak. A mikrodomének olyan különleges lipid-fehérje asszociációk, melyekben a fehérjék m ködésének tanulmányozása a specifikus lipidkörnyezet összetételének és tulajdonságainak leírása nélkül már nem vezethet kell eredményre. A lipidek vizsgálata nem korlátozódik kizárólag a membránalkotó valamint tároló funkciójú lipidek analízisére. A lipid eredet jelátviv molekulák nagy, és egyre növekv száma arra serkent minket, hogy minél teljesebb elemzést végezhessünk a lipidekb l származó metabolitok pl. ciklooxigenáz, lipoxigenáz termékek, ceramidok és egyéb szfingolipidek, lizoszármazékok terén. Ily módon a korszer lipidomika részben magában foglalja a metabolomikát is. Hogyan tudunk megfelelni ennek a kihívásnak? A lehet séget, hogy néhány perc alatt több száz egyedi lipid specieszr l kaphassunk kvantitatív információkat, a tömegspektrometria és a számítógépes háttér ugrásszer fejl dése teremtette meg. A ma már elérhet nagyérzékenység, jó felbontású MS-MS ill. MS n elemzést is lehet vé tev tömegspektrométerek az elektrospray ill. az atmoszférikus nyomású kémiai ionizációs ionforrásaik révén közvetlenül oldatból, vagy HPLC-hez kapcsolva képesek rövid id alatt többdimenziós analízisre. Meglep módon a módszer fejl dését az analitikai és m szerfejlesztési ipar még nem követte, mivel a kívánatos standardok, a lipidvizsgálathoz optimalizált ionforrások vagy a hatalmas mennyiség adatot kiértékelni képes szofverek kereskedelmi forgalomban még nem kaphatók. A lipidomika módszertana ezért intenzív fejlesztést igényl terület, mely a közvetlen kutatási kérdések megválaszolásában is rendszerszemlélet matematikai és statisztikai eljárások bevezetését teszi szükségessé. Az el adásban betegségmodelleken és tenyésztett sejteken végzett kísérleteink példáival mutatjuk be a fenti eszköztár hatékonyságát, és felvázoljuk a hamarosan üzembe helyezend új tömegspektrométer alkalmazásában rejl lehet ségeket, valamint azt a most alakuló európai hálózati struktúrát, mely az információcsere révén az ilyen, egymástól több száz kilométerre lev központok m ködését megkönnyíti és hatékonyságát jelent sen növelni képes. Kulcsszavak: lipidomika, tömegspektrometria, membrán, mikrodomén, jelátvitel 31

7 E08 A sejtfelszíni P-glikoprotein molekulák konformációs és topológiai heterogenitása Goda Katalin, Bacsó Zsolt, Fenyvesi Ferenc, Nagy Henrietta, Pataki Judit és Szabó Gábor Debreceni Egyetem, OEC, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet, Debrecen, A daganatos betegségek kemoterápiás kezelésének egyik súlyos problémája a citosztatikumok széles spektrumával szemben fellép ún. multidrog rezisztencia, melynek kialakulásában egyéb mechanizmusok mellett fontos szerepet játszanak az ABC transzporterek, közöttük, a P-glikoprotein (Pgp). A Pgp amfifil, lipofil molekulák sokaságát, köztük a daganatos betegségek kemoterápiájában alkalmazott citosztatikumok többségét szubsztrátként ismeri fel és képes a sejtekb l ATP hidrolízis energiájának felhasználásával eltávolítani. Az UIC2 antitest, vagy ennek Fab fragmentuma, kezeletlen sejteken csak a Pgp molekulák kis hányadát jelöli meg, míg bizonyos Pgp szubsztrátok/modulátorok jelenlétében vagy a sejtek ATP depléciója hatására köt dése 2-10-szeresére n. Az UIC2-vel szubsztrátok adása nélkül is megjelölhet Pgp populáció (PgpI) nagysága id ben nem változik (1.5-2 óra), ami ezen molekulák esetleges funkcionális elkülönülésével lehet magyarázható. Fluoreszcein-konjugált UIC2 Fab-vel (vagy teljes antitesttel) szelektíven megjelöltük a szubsztrátok adása nélkül is (PgpI) ill. a csak szubsztrátok jelenlétében elérhet Pgp populációkat (PgpII), vagy az összes sejtfelszíni Pgp-t (PgpT), és áramlási citometriás, TritonX-100 kioldási kísérletekben (Bacsó et al. és Gombos et al., Cytometry 61, , 2004) vizsgáltuk a detergens-oldhatatlan membrán régiókhoz asszociált Pgp molekulák arányát a különböz Pgp populációkban. Sejtvonalakon (NIH 3T3 MDR1, KB-V1, 2780AD) végzett kísérleteink alapján a PgpI molekulák 50-60%-a koleszterinben gazdag membrán mikrodoménekhez asszociált (caveolák, raftok), szemben a PgpII-kel, melyeknek csak kb. a %-a ilyen tulajdonságú. NP-40 detergenssel végzett kioldási kísérletekben szintén különbséget tapasztaltunk a PgpI és II populációk detergens rezisztenciájában, ami kapcsolatos lehet a PgpI fokozott asszociáltságával citoszkeletonhoz kapcsolódó fehérjékhez. A PgpI populáció raft ill. citoszkeleton asszociáltsága a sejtmembrán koleszterin tartalmának depléciójával ill. citoszkeleton depolimerizáló ágensekkel csökkenthet volt. A PgpI és PgpII populációk membrán mikrodoménekhez való különböz mérték asszociáltságát a raft-ok biokémiai szeparálásával és a bennük lév Pgp-k mikrogyöngyáramlási-fluorimetriás kimutatásával is meger sítettük. A két Pgp populáció biofizikai tulajdonságait FRAP (fluoreszcencia újraéledés fotokioltás után) és FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) alkalmazásával tanulmányoztuk. Jelenleg ezen topológiai különbségek fehérje trafficking-gel való esetleges összefüggését vizsgáljuk. Ismert, hogy az UIC2 antitest köt dése változó fokban - gátolja a Pgp általi drog transzportot. Kimutattuk, hogy a Pgp er s gátlószerei hatására (pl. ciklosporin A, PSC833, vinblasztin) az UIC2 mind a PgpI, mind a II populáció molekuláioz kapcsolódik és a modulátorok eltávolítása után is és szinte teljes mértékben - meggátolja a drog transzportot. Az UIC2 gátlás teljes vérben is kifejl dik, ami a fenti jelenség terápiás alkalmazását is 32

8 el re vetítheti. Ennek további vizsgálatára jelenleg in vivo kísérleteket végzünk SCID egerekbe transzplantált, Pgp-t expresszáló tumorokon. Kucsszavak: P-glikoprotein, multidrog rezisztencia, citoszkeleton, membrán mikrodomének, raft E09 Az endoplazmás retikulum mint metabolikus kompartimentum Csala Miklós és Bánhegyi Gábor Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet Az endoplazmás retikulum (ER) számos biokémiai reakciónak, illetve sejt-biológiai folyamatnak otthont adó organellum. Az ER luminális kompartimentumát a citoplazmától folyamatos membrán különíti el. Mivel a legtöbb intraluminális reakció szubsztrátja a citoplazmában szintetizálódik, illetve terméke oda távozik, a két kompartimentum közötti anyagforgalom jelent sége vitathatatlan. Ennek ellenére nincs konszenzus abban az alapvet kérdésben, hogy az ER membránja rés-e, avagy er s bástya. Az egyik széls séges álláspont szerint kisebb molekulák nem szelektív diffúzióval viszonylag szabadon jutnak át. Mások azt vallják, hogy az ER membrán gyakorlatilag impermeábilis, érdemleges sebesség anyagforgalom csak transzporterek által történhet. Ezt az álláspontot gyengíti az a tény, hogy mindezidáig csak néhány ER transzportert sikerült molekuláris szinten azonosítani. A csak funkcionálisan jellemzett transzporterek közül is többnek széles ligandspecifitása van. Mégis, a legtöbb kísérleti eredmény azt sugallja, hogy az ER lumen a citoszóltól mer ben eltér sajátosságokkal bír, melyek az intraluminális reakciók meghatározói. Az el adás összefoglalja és értékeli azokat a biokémiai, farmakológiai, patológiai, klinikai és genetikai adatokat, melyek alátámasztják azt, hogy az ER lumen elkülönült metabolikus kompartimentumnak tekinthet. Kulcsszavak: endoplazmás retikulum, transzport, permeabilitás, lumen, kompartimentum E10 Hogyan függ a mikrotubulusok hossza az anyai eredet -tubulintól? A méret a lényeg? Gáspár Imre, Venkei Zsolt és Szabad János Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Biológiai Intézet, Szeged Az embriógenezis egyik legfontosabb mozzanata az anyai, és az apai eredet pronukleuszok fúziója az els mitotikus osztódás során. A pronukleuszok egymásra találásához szükség van olyan pályákra, amelyek legf bb alkotói a mikrotubulusok (MT), és MTk-hez kapcsolódó motor molekulákhoz. Ha bármely komponens funkciója sérült (vagy hiányzik), az embrióge- 33

9 nezis el sem kezd dik, vagy elakad, és az embriók elpusztulnak, a n stények sterilek. A Kavar 18c /+ domináns n stény-steril mutációt hordozó, illetve a kavar null / hemizigóta Drosophila n stények petéiben a MTk szokatlan jellege miatt el sem kezd dik az embriógenezis. A Kavar 18c és a kavar null mutációk az -tubulin 4 anyai hatású, embrió-specifikus -tubulin féleséget kódoló gént azonosítják. A Kavar 18c allél egy olyan bázispár-csere típusú mutáció (G 244 A) nyomán képz dött, amely a Glu 82 Lys (E82K) cserét eredményezi. A Glu 82 egy Mg 2+ ionon keresztül köti azt a GTP-t, amely az -tubulin szerkezeti eleme. Az E82K - tubulin 4 molekulák nem kötik a GTP-t. A Kavar 18c /+ anyák embrióiban az els mitotikus orsó önmagába roskad, az osztódás gátolt, éppúgy, mint az -tubulin 4 fehérjét nem tartalmazó kavar null / hemizigóta n stények petéiben. Az -tubulin 4 szerepét megértend, in vitro polimerizációs kísérletekben tanulmányoztuk az ép, valamint az E82K -tubulin 4 molekulák szerepét. Megtudtuk, hogy az E82K -tubulin 4 molekulák beépülnek a MT-okba, és a MT-ok instabilitását okozzák. Kiderült, hogy -tubulin 4 hiányában (vagy E82K molekulák jelenlétében) bár képz dnek MT-ok, azok szignifikánsan rövidebbek, mint azok, amelyek ép - tubulin 4 jelenlétében képz dnek. A rövid MTk alkalmatlanok azoknak a nagy távolságoknak az áthidalására, amelyek az óriás citoplazmát jellemzik. Azt gondoljuk, hogy az -tubulin 4 szerepe kett s: egyrészt lehet vé teszi a hosszú MTk képz dését, amelyek az embriógenezis kezdetén pályákat képeznek a legkülönfélébb sejtalkotók szállításához, másrészt a MTk dinamikáját a polimerizáció irányba tolja el, amely a mitotikus orsó kialakításához nélkülözhetetlen er k forrása. Kulcsszavak: anyai hatás, alfa-tubulin 4, mikrotubulus, in vitro polimerizáció, dinamikus instabilitás E11 Mikrotubulusok az osztódási orsóban: váz, pálya, és er kifejtés Venkei Zsolt, Gáspár Imre és Szabad János Szegedi Tudományegyetem, Általános Orvostudományi Kar, Orvosi Biológiai Intézet, Szeged Egy mitózis folyamán a megkett z dött örökít anyag egyenl en oszlik meg az utódmagokban. A kromoszómák egyenl elosztását az osztódási orsó biztosítja. Az orsók alakját azok a mikrotubulusok (MTk) adják, amelyek (i) a replikálódott centroszómákból indulnak ki, egymással átfed k, és antiparallel állásúak, valamint (ii) azok a MTk, amelyek a kromoszómák kinetochorjaihoz kapcsolódnak. Milyen er k határozzák meg az orsó alakját, méretét? Milyen er k határozzák meg a centroszómák, a kromoszómák, és a leánykromatodák pozícióját? A létez modellek szerint az osztódási orsó méretét és alakját a sejtciklus szabályozása alatt álló motormolekulák, valamint azok a MTk határozzák meg, amelyekhez a motor molekulák kapcsolódnak. A MTk dinamikája (felépülése és szétszerel dése) toló- és vonóer t fejt ki a centroszómákra, illetve a kromoszómákra. A motormolekulák a kötegekké rendez dött MTk mentén haladva alakítják az orsó szerkezetét. Ismertek olyan motormolekulák (citoplazmatikus dineinek, bipoláris kinezinek), melyek hiánya az osztódási orsó összezuhanásához, mások (Ncd) hiánya pedig az orsó megnyúlásához vezet. A különféle motorok és a 34

10 MT pálya közti kapcsolat min sége meghatározza a motorok által kifejtett hatás jellegét és mértékét. Nyilvánvaló, hogy a motor-mt kapcsolat megismerése elengedhetetlen az orsót felépít folyamatok megértéséhez. Több olyan motormolekula mutáció ismert, melyek a motorok MT-köt helyeit szüntetik meg. Meglep, de a MT felszínén mutációval eddig nem azonosítottak olyan elemet, ami a motor-mt kapcsolathoz szükséges. Az el adásunkban olyan, az anyai hatású -tubulin 4 felszínén történt aminosav cserét (E426K) mutatunk be, amely a motorok egyik kapcsolódási helyét azonosítja. A mutáció hatása megnyilvánul (i) a mutáns fehérjét hordozó embriók fenotípusában (leszakadt, és önállósodott centroszómák, összezuhant orsók és a szinciciális magok megrekedése a Drosophila pete citoplazma mélyén), (ii) motormolekula génekkel való interakcióban, valamint (iii) az E426K anyai hatású -tubulin 4 -et tartalmazó MTk viselkedésében in vitro kísérleti rendszerben. Kulcsszavak: anyai hatás, embriógenezis, osztódási orsó, -tubulin, motorköt hely E12 Egy új Drosophila formin szerepe a trachea sejtek aktinvázának kialakulásában és az idegsejt nyúlványok növekedésében Matusek Tamás 1, Pataki Csilla 1, Gombos Rita 1, Alexandre Djiane 2, Marek Mlodzik 2 és Mihály József 1 1 MTA SZBK, Genetikai Intézet, Szeged; 2 Mount Sinai School of Medicine, New York A forminok családjába tartozó fehérjék funkciója az aktin sejtváz szabályozása. A forminok két fontos aktivitással bírnak, egyrészt képesek arra, hogy G-aktin jelenlétében új aktin szálak képz dését indítsák el, másrészt az aktin filamentumok ún. növekv végéhez köt dve a polimerizáció sebességét is befolyásolják. A forminok szupercsaládjának egyik nemrégiben leírt új tagja a DAM alcsalád, amelyr l azt feltételezik, hogy részt vesz egy morfogenetikus sejtmozgás, az ún. konvergens extenzió szabályozásában. Mindemellett az a hipotézis is felmerült, hogy a DAM fehérjék egy olyan jelátviteli út elemei, amelyet korábban szöveti polaritási jelátviteli útként írtak le. Tekintve, hogy laboratóriumunk f kutatási területe a szöveti polaritás vizsgálata Drosophila modell organizmusban, megvizsgáltuk a DAM gén muslicában betöltött funkcióját. Ennek érdekében ddam mutánsokat állítottunk el és elvégeztük a mutánsok fenotípus analízisét. Eredményeink azt mutatják, hogy a ddam gén ecetmuslicában nem szükséges a vad típusú síkbeli polaritási minták kialakításához, viszont szövetspecifikus módon szabályozza bizonyos aktin vázelemek felépülését a tracheában, az idegsejtekben és a petekamrákban. Eredményeink azt mutatják, hogy a ddam gén terméke a trachea sejtekben a kutikula kiválasztását szabályozza oly módon, hogy a sejtek apikális részén aktin gy r k képz dését segíti el, amelyek kijelölik a kutikula szekréció helyét. Idegsejtek esetében a ddam fehérje hozzájárul a nyúlványok növekedéséhez, míg a petekamrákban szabályozza az aktin gazdag, ún. gy r csatornák képz dését. Kísérleteink arra is fényt derítettek, hogy mindezen szövetspecifikus funkciókat a ddam fehérje a src családba tartozó SRC42 és Tec29 tirozin kinázokkal együttm ködve látja el. Kulcsszavak: trachea, sejtváz, idegrendszer, DAM, formin 35

11 E13 Collagént termel haemopoietikus eredet sejtek a fejl d szívben Hajdú Zoltán, Magyar Attila, Nagy Nándor, Oláh Imre Semmelweis Egyetem, Humánmorfológiai és Fejl désbiológiai Intézet, Budapest Az endocardium cs, a myocardium, a coronariák és az ingervezet rendszer fejl dése az embryológiai kutatások homlokterében állnak, de a szív rostos vázának kialakulása alig kapott figyelmet. A billenty k, valamint az ingervezet rendszer fejl désével párhuzamosan történik az egységes pitvar-kamrai myocardium szétvágása pitvari és kamrai izomzatra, melyek között a folytonosság megsz nését a szív vázának kialakulása jelzi. Az újabban eml sben leírt u.n. peripheral blood fibroblast -okat (PBF) kimutattuk csirke embryonális fehérvérsejtek között és kimérás kísérletekkel igazoltuk, hogy ezek a sejtek szerepet játszanak az organogenesisben. Jelen munkánk célja volt: megvizsgálni hogy a PBF-ok résztvesznek-e a myocardialis cs szétvágásában, azaz a szív rostos vázának és a szívbillenty k kialakulásában? Collagént expresszáló CD45 pozitív (haemopoietikus eredet ) sejtek a 4. embryonális napon kimutathatóak a fejl d endocardium párnákban. A fejl d rostos vázban és a billenty kben számuk a embryonális napon tet z dik, majd csökken, de postembryonálisan is kimutatható néhány CD45 és collagen pozítv sejt. Eddigi immuncytokémiai és kimérás vizsgálataink azt mutatják, hogy a szív rostos vázának és billenty inek kialakulásában haemopoietikus eredet (CD45 pozitív) fibrocyták is részt vesznek. Kulcsszavak: szívfejl dés, rostos váz, CD45, collagen, csirke Készült az OTKA T számú pályázatának támogatásával. E14 A madarak Langerhans sejteinek- és vándorlásuknak vizsgálata Igyártó Botond-Zoltán, Lackó Erzsébet, Oláh Imre, Magyar Attila Semmelweis Egyetem, Humánmorfológiai és Fejl désbiológiai Intézet, Budapest A Langerhans sejt a dendritikus sejtek családjába tartozik, és az eml sepidermiszben megtalálható sejtek közül a legfontosabb antigénprezentáló sejt. A csontvel b l származó el alakok a véráram útján jutnak el az epidermiszbe, ahol a b rt alkotó sejtek mintegy 2-3%-át teszik ki. Ezen sejtek jellegzetes markerei közé tartoznak az MHCII valamint a CD1a molekulák, illetve jellemz rájuk a Bierbeck granulumok megléte. A Langerhans sejtek szerepe a b r felületére jutott antigének felvétele. Elhagyva az epidermiszt a legközelebbi nyirokcsomó parakortikális régiójába vándorolnak, ahol a vándorlás közben feldolgozott antigéneket immunkompetens sejteknek mutatják be. Mindezen adatok nagy általánosságban valamennyi eml sre jellemz ek. Jelenleg nem ismert, hogyan zajlanak ezek a folymatok a madaraknál. 36

12 A madarak b rének hámja is tartalmaz az eml s Langerhans sejtekhez morfológiailag hasonló sejteket. Ezek a sejtek Ca2 + és Mg2 függ + ekto-atpáz-, valamint MHCII pozitívaknak bizonyultak. Korábbi vizsgálataink során kiderült, hogy a madár Langerhans sejtek is hemopoetikus eredet ek (CD45 + ), ugyanakkor a többi dendritikus sejtre jellemz vimentin intermedier filamentumot is tartalmazzák. In vitro végzett kísérletekkel kimutattuk, hogy a madár Langerhans sejtek, hasonlóan az eml sökéhez, képesek antigénfelvételre. Jelen munkánkban a madár Langerhans sejteken végzett újabb morfológiai és funkcionális eredményeinkr l számolunk be. Új hámleválasztásos (enzime, illetve mechanikus) módszert dolgoztunk ki az epidermisz, illetve ennek sejtjeinek izolálására. Ezekkel a módszerekkel sikerült a Langerhans sejtek részletes fenotipizálása. Így, többek között azonosítottunk bennük különböz lizoszomális fehérjéket és enzimeket, sejtfelszínükön megtaláltunk makrofág-alpopulációkra jellemz markereket, de, ellentétben az eml sökkel, a madár Langerhans sejtek nem expresszálnak E-kadherint. Citoszoljukban megtalálhatók a Bierbeck granulumok. Kett s festésekkel a CD45 + /vimentin + /ATPáz + populáción belül több alpopuláció azonosítható, ami a Langerhans sejtek intradermális differenciálódására utal. Funkcionális vizsgálat során 1% FITC oldatot vittünk fel az állat b rére. A kezelt b rterületet kimetszettük és vagy in vitro tenyésztettük vagy immunhisztokémiai festést végeztünk rajta. A hámból kivándorolt CD45 + sejtek FITC pozitívaknak bizonyultak. A b rb l készült metszeteken FITC + sejteket találtunk a dermisz nyirokerei körül. A nyirokerek mentén kis, kerekded nyirokszövetképletek találhatók, melyekben a nyiroktüsz höz hasonló képletek perifériáján fordultak el FITC + sejtek. Ezen ovális limfoid képletekben els sorban T h sejteket és dendritikus sejteket találunk, míg B-limfociták kisebb számban vannak jelen. A limfociták egy MHCII + hálózatban foglalnak helyet. Mindez hatékony antigénprezentációra utal. Kulcsszavak: Langerhans sejt, b rhöz asszociált nyirokszövet, Bierbeck granulum, E- kadherin, in vitro OTKA: T , 145/99 E15 A Rho-ka és a kináz egy növénymese Dorjgotov Dulguun, Sz cs Attila, Ötvös Krisztina, Dudits Dénes, Fehér Attila MTA Szegedi Biológiai Központ, Növénybiológia Intézet, Funkcionális Sejtbiológiai Laboratórium A magasabbrend szervezetek összehangolt m ködése bonyolult molekuláris jelátviteli hálózatokon alapul. A jelek továbbítását a sejtek között és a sejteken belül az esetek nagy részében fehérjék végzik más fehérjék poszt-transzlációs módosítása révén. Bár a GTP-köt fehérjék és a fehérjék foszforilációs változásait katalizáló kinázok és foszfatázok mind az állati, mind a növényi sejtekben alapvet szerepet töltenek be ezekben a folyamatokban, napjaink genomikai kutatásai alapvet különbségekre derítettek fényt. A növényi sejtekb l számos olyan fehérje hiányzik vagy alul reprezentált (pl. RAS, heterotrimerikus GTP-köt 37

13 fehérjék, tirozin-specifikus receptor kinázok stb.), amelyek az állati sejtekben köztudottan központi szereppel rendelkeznek, ugyanakkor bizonyos fehérje típusok csak a növényekre jellemz k (pl. citoplazmatikus receptor-szer kinázok), vagy a növényekben lényegesen nagyobb változatosságot mutatnak (pl. általánosságban véve a kinázok és a transzkripciós faktorok). Az el adásban egy, a jelátviteli modulokban meglév azonosságokat és különbségeket jól demonstráló, példa kerül bemutatásra, amely a kis molekulasúlyú RHO típusú GTPázokhoz kapcsolódik. A RAS szupercsaládba tartozó RHO GTPázok, mind az állati mind a növényi sejtekben, alapvet en a citoszkeleton szervez désének szabályozásában vesznek részt, bár emellett fontos szerepet töltenek be oxidatív folyamatok (NADPH oxidáz aktiválás) és génexpressziós változások (mitogenezis, stressz) kontrollálásában is. Ezek a fehérjék, szemben az állati sejtek három csoportjával (RHO, RAC, CDC42), növényekben egy speciális csoporttal (ROP) képviseltetik magukat. Az utóbbi évek kutatásai nyilvánvalóvá tették, hogy mind a ROP GTPázok szerkezete, mind a jelátviteli hálózatban felettük álló (regulátor) mind az általuk szabályozott (effektor) fehérjék csoportja mutat evolúciósan konzerválódott és csak a növényekre jellemz elemeket egyaránt. Máig sem ismert azonban az, hogy a meglev különbségek hogyan befolyásolják a ROP GTPázok jelátviteli szerepét, beleértve a receptorok és a GTPázok közötti kapcsolatot és az effektorok-felé történ jelátadás mechanizmusát. Laboratóriumunkban lucernában vizsgáltuk ennek a fehérje csoportnak néhány reprezentánsát. Fehérje-fehérje kapcsolataikat vizsgálva azonosítottunk egy olyan növényspecifikus kináz csoportot, melynek tagjai képesek a GTPázokat specifikusan foszforilálni. In vitro vizsgálataink arra engednek következtetni, hogy a foszforiláltsági állapot befolyásolja a ROP GTPázok jelátviteli aktivitását. Ezeknek az eredményeknek az in vivo meger - sítésével egy, a növényekben eddig ismeretlen jelátviteli kapcsolatra derülne fény, amely jelent sen hozzájárulhat a növényekben zajló jelátviteli folyamatok megértéséhez. Az el - adásban ezeknek az eredmények az ismertetésére és megvitatására is sor kerül. Az el adásban ismertetett kutatások az OTKA (T és T ) támogatásával folytak és folytatódhatnak, amelyért a kutatók köszönetüket fejezik ki. Kulcsszavak: jelátvitel, foszforiláció, RHO GTPáz, receptor kináz, Medicago sp. E16 Jelátviteli útvonal kapcsolatok Caenorhabditis elegansban Vellai Tibor Eötvös Loránd Tudományegyetem, Genetikai Tanszék, Budapest Az állati egyedfejl dés f lépéseit, a sejt differenciációt és a mintázatképz dést, csupán korlátozott számú jelátviteli útvonal szabályozza. A legtöbb sejt-sejt kölcsönhatást az embrionális fejl dés során a Hedgehog, Wingless (Wnt), TGF- (transforming growth factorbeta), RTK/Ras/MAPK (receptor tyrosine kinase), insulin/igf-1 (insulin-like growth factor 1), Notch, JAK/STAT és a nukleáris hormon receptor genetikai útvonalak közvetítik. Hogyan alakítja ki ez a néhány útvonal a meglep en sokféle sejttípust és morfológiai 38

14 változatosságot az egyedfejl dés során, valamint hogyan járulnak hozzá az állati fajok szembet n diverzitásához (testfelépítési evolúciójához)? Ezek a problémák a biológiai megismerés központi kérdései közé tartoznak. Laboratóriumunkban a fonálféreg Caenorhabditis elegans fejl dés genetikai rendszeren kutatjuk a jelátviteli útvonalak potenciális kapcsolatait ( signalling crosstalk ). Genetikai interakciók vizsgálatával és episztázis elemzéssel jelenleg a hermafrodita vulva fejl dés jelátviteli hálózatát térképezzük. A sejtosztódás, sejtnövekedés és sejtpusztulás jelátviteli szabályozásának vizsgálata a másik kutatási területünk. Az el adásban kutatásaink utóbbi éveinek eredményeit mutatom be. Választ keresek arra, hogyan specifikálhat egy vagy néhány genetikai kaszkád elméletileg korlátlan sejttípust. Kulcsszavak: genetikai útvonal, differenciáció, episztázis, a fonalféreg Caenorhabditis elegans, sejtsors E17 Új fehérje funkció a növényi cirkadián órában: egy kis GTP-köt fehérje azonosítása és jellemzése Arabidopsis-ban Kevei Éva 1, Gyula Péter 1, Fehér Balázs 1, Kozma-Bognár László 1, Tóth Réka 1, Andrew Millar 2 és Nagy Ferenc 1 1 MTA Szegedi Biológiai Központ, Növénybiológiai Intézet, Szeged 2 Department of Biological Sciences, University of Warwick, Coventry, United Kingdom Az él világban széles körben megfigyelhet, hogy bizonyos folyamatok szabályszer ismétl déseket, ritmikus kifejez dést mutatnak. A biológiai ritmusok közül a legszembet - n bbek és leginkább kutatottak a napi ismétl dést mutató, kb. 24 órás periódusú cirkadián ritmusok, melyeket egy bels id mér mechanizmus, a cirkadián óra hoz létre. A cirkadián ritmusok küls környezeti tényez kt l függetlenül, állandó körülmények között is fennmaradnak. A cirkadián óra kialakulása az evolúció során adaptív el nnyel járt, mivel lehet vé tette az él lények számára a környezetben ritmikusan bekövetkez változások el rejelzését és a bels folyamatok megfelel napszakra történ id zítését. A cirkadián óra szerepe a növények életében kimagaslóan fontos, hiszen a fejl désükhöz szükséges fényenergia a környezetben nem érhet el folyamatosan, így a fény maximális hasznosítása érdekében szükségessé vált a fotoszintetikus folyamatok szigorú id beli szervez dése. A növényi cirkadián óra megismerése már régóta foglalkoztatja a kutatókat, a ma felvázolható modell mégis igen hiányos és számos kérdést vet fel. Munkánk céljául t ztük ki új cirkadián óra elemek azonosítását és jellemzését, melynek segítségével részleteiben ismerhetjük meg az óra m ködését. Arabidopsis thaliana mutagenezise és a mutáns növényi populáció vizsgálata eredményeként azonosítottunk egy új gént, mely egy, a kis GTP-köt fehérjék családjába tartozó fehérjét kódol. A gén (red lip: red light insensitive period) deléciója a vizsgált cirkadián ritmusok periódushosszának rövidülését okozza mind folyamatos sötétben, mind folyamatos fényben. A folyamatos fény hullámhossza (kék, vörös, távoli vörös) nem befolyásolja a fenotípus er sségét, de 39

15 magas intenzitású vörös fényben a mutáns fenotípus nem nyilvánul meg. A mutáció nem érinti az óra h mérsékletkompenzációs képességét, a red lip növények periódushossza minden vizsgált h mérsékleten kb. 2 órával rövidebb a vad típusú növényekénél. A mutáció fényfügg egyedfejl dési folyamatokat is befolyásol: a mutáns növények kevésbé érzékenyek a vörös fényre, mint a vad típusú növények. A RED LIP fehérje tehát kett s szerepet tölt be: részt vesz a cirkadián óra által irányított ritmusok periódushosszának kialakításában és a fotomorfogenezis szabályzásában. Az eddig leírt növényi órafehérjék strukturálisan és funkciójukat tekintve is igen sokfélék: MYB-domént hordozó transzkripciós faktorok, fehérje degradációban résztvev F-box fehérje, response-regulator fehérjék, fény receptor fehérjék. A RED LIP az els ként azonosított növényi GTP-köt fehérje, mely szerepet játszik a fényfügg jelátviteli folyamatokban és a cirkadián óra m ködésében. Kulcsszavak: cirkadián óra, fotomorfogenezis, mutagenezis, GTP-kötés, Arabidopsis E18 A Mediátor szerepe a génexpresszió szabályozásában Szilágyi Zsolt 1, Miklós Ida 1, Sipiczki Mátyás 1,2 1 Debreceni Egyetem, TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék, Debrecen, 2 MTA- Debreceni Egyetem Mikrobiális Fejl désgenetikai Kutatócsoport, Debrecen Az él szervezetek leny göz képessége, hogy küls illetve bels környezetükb l érkez szignálokra rendkívül érzékeny és hatékony választ képesek generálni. A szignálok fogadásának és a válaszreakciónak központi egysége a sejt, amelyben bonyolult szignál transzdukciós útvonalakon keresztül jut el a jel a génekhez. A válaszadó gének m ködésének szabályozásával, azok ki- és bekapcsolásával éri el a sejt azt, hogy a legkülönböz bb környezeti helyzetekben is a lehet legpontosabb és leghatékonyabb válasz születhessen meg. Ezért a gének m ködésének szabályozásában szerepet játszó mechanizmusok megértése a biológiai/genetikai kutatások egyik központi területe. A génexpresszió szabályozásának kutatása különösen az eukarióta sejtekben kapott nagy figyelmet, ahol az utóbbi évek kutatásai alapján kirajzolódni látszik egy rendkívül bonyolult szabályozási rendszer, amely lehet vé teszi az eukarióta szervezetre jellemz sokrét m ködési feladatok érzékeny és precíz szabályozását. Ezen eredmények alapján a génexpresszió szabályozásában központi szerepet játszik az ún. Mediátor komplex, amelynek feladata a környezeti szignálokat továbbító génspecifikus regulátoroktól érkez szabályozási szignálok továbbítása a gének transzkripcióját végz apparátus felé. A komplex strukturálisan és funkcióját tekintve is evolúciós szinten konzervált, az eddig vizsgált egyszer eukariótákban és magasabbrend állati szervezetekben is megtalálható. A Mediátor komplex funkciójáról mind a mai napig a genetikai analízisre kiválóan alkalmazható éleszt modellszervezetek (Saccharomyces cerevisiae és Schizosaccharomyces pombe) szolgáltatják a legtöbb információt. A komplex eddig ismert alegységeit kódoló 40

16 géneket ezen modellekben azonosították. Munkacsoportunk komplex defektusokat mutató mutánsok klasszikus és a gének molekuláris analízise során bukkant rá a Mediátor komplex létezésére a hasadó éleszt ben, amelyet egyéb vizsgálatok meger sítettek. Eredményeink azt mutatják, hogy a sep10, sep11 és sep15 gének a Mediátor komplex részeként számos sejtszint folyamat szabályozásában vesznek részt, funkcionális átfedésben. A sep10 és sep15 konzervatív alegységek, homológjaik minden eddig azonosított Mediátor komplexben megtalálhatóak, míg a sep11 éleszt specifikus alegység. Az el adásban áttekintésre kerülnek a Mediátor komplex felépítésér l és funkciójáról jelenleg rendelkezésre álló eredmények, különös tekintettel a hasadó éleszt Mediátor gének funkcióianalízise során kapott eredmények hozzájárulására a komplex feladatainak megértésében. Kulcsszavak: Mediátor, sejtosztódás, transzkripció, éleszt, sep E19 Az e3b1 fehérje szerepe kisméret G-fehérjék aktiválásában Jenei Veronika 1, 2, Tommy Andersson 2, Jakus Judit 1, Karim Dib 2 1 MTA, Kémiai Kutatóközpont, Biomolekuláris Kémiai Intézet, Biooxidációs csoport, Budapest 2 Division of Experimental Pathology, Lund University, University Hospital, Malmö, Svédország Az e3b1 (eps8 SH3 domén köt fehérje-1) egy körülbelül 70 kda méret, a sejtplazmában található fehérje, amely az EGF-receptoron (EGFR) keresztül aktiválódó jelátviteli lánc tagja. Komplexet alkot az eps8 (egy EGFR szubsztrát), a Sos-1 illetve a PI3K fehérjékkel, és résztvesz a Ras és a Rac aktiváció szabályozásában. Az e3b1 fehérjér l ismeretes továbbá, hogy gátolja a sejtosztódást, hatással van az aktin átrendez désére, a kontakt inhibícióra, és korábbi eredményeink szerint bizonyos ECM fehérjék esetén a sejtletapadásra is. Kísérleteinkben megvizsgáltuk ennek a fehérjének a hatását különböz G-fehérjék aktivációjára, melyeken keresztül az e3b1 hatást gyakorolhat a fenti folyamatokra. Tanulmányoztuk továbbá azokat a lehetséges mechanizmusokat, melyeken keresztül e fehérje részt vehet a G-fehérjék aktivációjának szabályozásában. Kísérleteinkhez az NIH3T3 fibroblaszt sejtvonalat használtuk, amelyben genetikai manipuláció során vagy az EGFR, vagy pedig az EGFR+e3B1 fehérje túltermel dik. Kísérleteinkben megvizsgáltuk az e3b1 fehérje túltermel désének hatását a Ras, Rac, illetve a korábban még nem vizsgált, az integrinek szabályozásában résztvev Rap1 EGFindukálta aktivációjára. Az EGFR+e3B1 fehérjét túltermelõ sejtvonalban az EGF már alacsonyabb koncentráció esetén is maximális Rac aktivációt váltott ki, míg az EGFR-t túltermelõ sejteknek ugyanehhez a hatáshoz er sebb stimulusra volt szükségük, ami meger síti egy korábbi tanulmány eredményeit. Érdekes módon hasonló eredményt kaptunk a Rap1 aktivitás mérése esetén is. Ellentétben egy korábbi modellel azonban, a mi sejtvonalainkban az e3b1 túltermel dés nem a Ras aktiváció gátlása révén szabályozza a sejtproliferációt. A továbbiakban inhibítorok segítségével megvizsgáltuk a foszfatidil- 41

17 inozitol-3-kináz, az Abl-kináz és a Src-tirozin-kinázok szerepét a Rap1 aktivációjában. Eredményeink szerint az e3b1-et túltermel sejtekben a Rap1 aktivációja Src-függ, de Abl és PI3K-független folyamat. Érdekes módon ezt a Src-függ G-fehérje aktivációt kizárólag adherens sejtekben tapasztaltuk, ami felveti az integrinek lehetséges szerepét ezekben a folyamatokban. Immunoprecipitáció segítségével vizsgáltuk, hogy az e3b1 fehérje milyen guanin-nukleotid cserél faktoron (GEF) keresztül hat a Rap aktivációra. A legismertebb Rap GEF a C3G, amelyr l korábban már kimutatták más jelátviteli utakban, hogy Src-kináz-függ módon aktiválja a Rap1-et. Mivel azonban az általunk alkalmazott Srckináz inhibítorok nem voltak hatással a C3G foszforilációjára/aktivációjára, modellünkben valószín síthet en nem ez a f Rap1 aktivátor. Összefoglalva elmondható, hogy az e3b1 fehérje egy új, eddig még nem tanulmányozott hatását irtuk le, nevezetesen, hogy nemcsak a korábban vizsgált Rac, de a Rap1 aktivációját is szabályozza. Szintén els ként írtuk le, hogy az e3b1 fehérje Src-kinázokon keresztül hat a Rap1 aktivációjára, amely azonban valószín leg független a C3G-t l. Eredményeink felvetik a lehet ségét, hogy az e3b1 fehérje nemcsak a Ras-on, de az azzal rokon Rap1-en keresztül is hathat a sejtproliferációra illetve a sejtletapadásra. Kulcsszavak: e3b1, EGF receptor, G-fehérje, Src-kinázok, sejtproliferáció E20 Merre visz a növényi szteroid hormon szintézisút? Bancos Simona 1, Szatmári Anna-Mária 1, Koncz Csaba 2, Masaharu Mizutani 3, Takao Yokota 4, Nagy Ferenc 1, Szekeres Miklós 1 1 MTA Szegedi Biológiai Központ, Növénybiológiai Intézet, Szeged, 2 Max Planck- Institut für Züchtungsforschung, Köln, Institute for Chemical Research, 3 Kyoto University, Kyoto, 4 Department of Biosciences, Teikyo University, Utsunomiya A brasszinoszteroid (BR) csoportba tartozó szteroid hormonok fontos szerepet játszanak a növények fej dési folyamatainak szabályozásában. Bár e viszonylag újonnan felismert hormoncsalád tagjainak bioszintézise és hatásmechanizmusa mára viszonylag jól ismertté vált, két bioszintetikus gén funkciójának tisztázására irányuló vizsgálataink lényegesen átalakították a brasszinoszteroid anyagcsereútról az elmúlt tíz év során kialakult képet. Eredetileg a BR szintézis reakcióútját jelölt prekurzorok átalakulásainak nyomonkövetésével tisztázták. Az Arabidopsis genetika gyors fejl dése révén az elmúlt évtizedben számos BR-deficiens mutánst sikerült izolálni, lehet vé téve egyes bioszintetikus enzimek génjeinek azonosítását. A mutánsok funkcionális jellemzése során használt intermedier menekítés és hormonanalízis gyakran ellentmondásos eredményre vezetett, amit általában e mószerek technikai nehézségeivel magyaráztak. Munkánk célja az Arabidopsis CYP90C1 és CYP90D1 génjei által kódolt citokróm P450 enzimek szerepének tisztázása volt. Bár az ismert CYP90C1-deficiens rot3 mutáns nem mutatta a jellegzetes BR-hiányos törpe fenotípust, expressziós vizsgálataink és a CYP90C1 és CYP90D1 nagyfokú homológiája arra utaltak, hogy e gének a BR szintézisút eddig ismeretlen, átfed funkciójú monooxigenázait kódolják. A cyp90c1 és cyp90d1 null mutáns 42

18 vonalakat PCR-alapú inverz genetikai módszerrel azonosítottuk a rendelkezésünkre álló T- DNS inszerciós Arabidopsis mutánsgy jteményben. A homozigóta cyp90c1 és cyp90d1 vonalak keresztezésével el állított kett s mutáns jellegzetes, hormonkezeléssel menekíthet BR-deficiens fenotípust mutatott, igazolva a CYP90C1 és CYP90D1 funkciók redundáns voltát. A cyp90c1cyp90d1 kett s mutáns intermedier menekítési és hormonanalízis eredményei nem adtak megbízható információt az érintett gének BR szintézisben betöltött szerepér l. Egyértelm adatokkal szolgáltak viszont azok az in vitro konverziós kísérletek, amelyeket Escherichia coli-ban kifejeztetett és funkcionálisan rekonstituált CYP90C1 és CYP90D1 enzimekkel végeztünk. Mivel korábban a más heterológ rendszerben expresszáltatott CYP90 fehérjék rendre enzimatikusan aktívnak bizonyultak, módszerünk segítségével lehet ség nyílt a konverziós lépések és szubsztrát preferenciák pontos meghatározására ezen enzimcsalád valamennyi tagjának esetében. Eredményeink egy olyan, a korábban elfogadottnál egyszer bb BR bioszintézis út dominanciájára utalnak, amely nincs ellentmondásban a mutánsok menekítése és hormonanalízise során kapott adatokkal. Kulcsszavak: szteroid hormon szintézis, brasszinoszteroid, inverz getetika, heterológ expresszió, Arabidopsis E21 Kemotaktikus drug-targeting. - Ciklodextrin hordozók szerepének vizsgálata szteroidok és SXWS peptidek alkalmazásával egysejt modell-rendszerben. K hidai László, Szabó Lajos, Láng Orsolya, Katona Júlia, Csaba György Semmelweis Egyetem, Genetikai, Sejt- és Immunbiológiai Intézet, Budapest A ciklodextrinek (CD) olyan ciklikus, nem-redukáló, 6-8 glukopiranozid egységb l felépül oligoszaccharidok, melyek speciális hengeres térszerkezetük és amfipatikus karakterük révén hidrofób ligandok molekuláris szint targetálását teszik lehet vé. Szteroid hormonok CD-ekhez való kötése módot ad olyan molekula-komplexek kialakítására, amelyekb l a sejtmembrán közelében felszabaduló hormon az újonnan leírt, sejtfelszíni membránban elhelyezked szteroid-receptor család egyes tagjaival léphet interakcióba, indukálhatja azokat. Jelen kísérletünkben (i) eltér kémiai szerkezet CD-ek, mint a kemotaktikus drugtargeting potenciális hordozómolekuláinak kemotaktikus képességét vizsgáltuk, valamint azt, hogy (ii) CD-szteroidokkal kemotaktikusan szelektált eukaryota csillós egysejt ek kemotaktikus válaszkészségét mennyiben befolyásolja az alkalmazott szteroid. (iii) A kemotaktikus szignalizáció szteroid- és citokin-függ voltának feltételezett keresztreakcióit a több citokin-receptor extracelluláris domainjének konzervatív alkotóelemeként is leírt, SXWS peptid felhasználásával elemeztük. Vizsgálatainkat Tetrahymena pyriformis GL sejtek logaritmikus növekedési fázisban lév tenyészeteinek sejtjein végeztük. A vizsgált 7 ciklodextrin: β-cd (CD), (2-hidroxi)propilβ-CD (HPCD), etil-β-cd (ECD), acetilatált-β-cd (ACD), karboximetil-β-cd (CMCD), 43

19 karboxietil-β-cd (CECD), szukcinil-β-cd (SCD) (CycloLab, Budapest) volt. Az alkalmazott HPCD-szteroidok: tesztoszteron, β-ösztradiol, dexamethason, progeszteron és hidrokortizon (Sigma Ltd. St.Louis); a vizsgált SXWS derivátumok SGWS, SEWS, SYWS voltak. A sejtek kemotaktikus aktivitásának meghatározására, illetve a kemotaktikus szelekcióra kapilláris kemotaxis esszét alkalmaztunk. A kísérleteket 8-8 párhuzamos mintán végeztük, a nyert eredmények statisztikai analízisére ANOVA-t használtunk. Eredményeink mutatják, hogy maguk a vizsgált CD derivátumok jelent s mértékben eltér kemotaktikus hatással bírnak. A komplexekben gyakran hordozóként használt HPCD e sejtfiziológiai hatását mind az acetilezett (ACD), mind a szukcinilezett forma (SCD) a vizsgált koncentrációk ( mg/ml) szinte mindegyikében felülmúlja, míg a vizsgált másik három derivátum elmarad attól. A szteroidokkal képzett konjugátumok kemotaktikus hatásvizsgálata jelzi, hogy ez a sejtfiziológiai paraméter a ligand szerkezeti változásait (ld. A-gy r aromás jellege, oldalláncok mérete és karaktere) érzékenyen követi. A leghatásosabb, rapid indukciós id vel (15 perc) ható kemoattraktáns ligandnak a tesztoszteron ( mg/ml), míg a legkifejezettebben kemorepellensnek a hidrokortizon ( mg/ml) bizonyult. A hatás receptor-függ voltát jelzi, hogy a fenti két liganddal végzett kemotaktikus szelekció révén kialakított szubpopulációk követéses vizsgálata mindkét esetben fokozott kemotaktikus válaszkészség szubpopulációt mutat (tesztoszteron - Chem sel = 248%; hidrokortizon- Chem sel =202%). A szelekcióval kialakított csoportok, a három eltér kemotaktikus karakter SXWS peptid iránti válaszkészségének vizsgálata jelzi, hogy: (i) a hidrokortizon szelekció a semleges SGWS és a repellens SYWS peptid esetében is fokozott válaszkészség szubpopulációkat eredményez; (ii) a tesztoszteronnal szelektált sejtek esetében is megfigyelhet a semleges SGWS preferenciája; (iii) a tesztoszteron meg rzi jobb szelektáló jellegét SYWS-sel szemben, míg az SEWS-nek a szteroiddal hasonlóan pozitív a hatása. Kulcsszavak: kemotaxis, ciklodextrin, szteroid, SXWS, Tetrahymena E22 A lassú vázizom összehúzódási és elernyedési génje külön szabályozódik Zádor Ern 1, Rácz Gábor 1, Fenyvesi Rita 1 és Frank Wuytack 2 1 SZTE ÁOK Biokémiai Intézet, Izomdifferenciálódási csoport, 2 KULeuven, Department of Physiology, Leuven, Belgium A vázizom oxidatív anyagcserét folytató, lassú m ködés formája csak a megfelel motoros beidegzés hatására képes kialakulni. Az izomfehérjék mintegy 20%-át jelent, az öszszehúzódásban lényeges szerepet játszó lassú miozin génje is idegimpulzusra indukálódik. A beidegzés és a miozin gén transzkripciójának kapcsolata két különböz jelátviteli úton is lehetséges, az egyik a Ras, a másik a kalcineurin-nfat. Kérdésünk az volt, hogy vajon a többi lassú izomra jellemz gén is hasonló módon szabályozódik-e a miozinéhoz? Kísérleteinkben az elernyedést biztosító szarkoplazmás/endolazmás retikulum Ca 2+ ATPáz 44

20 (SERCA2a) kifejez dését követtük a patkány innervált és denervált regenerálódó lassú soleus izmában mrns (RT PCR) és fehérje szinten (immunoblott, immunhisztokémia). A jelátviteli utak szerepét a SERCA2a kifejez désre domináns negatív és pozitív Ras-t valamint kalcineurin gátló fehérjét expresszáló plazmidok in vivo transzfekciójával vizsgáltuk. Eredményeink azt mutatják, hogy a beidegzés közvetlenül nem szükséges a SERCA2a transzkript és fehérje szint emelkedéséhez, csak hosszabb távon lehet módosító hatása. A Ras és a kalcineurin-nfat utak sem befolyásolják a SERCA2a-t. Ezzel bizonyítottuk, hogy az összehúzódásáért felel s miozin és az elernyedést biztosító SERCA2a gén kifejez dése eltér módon szabályozódik a lassú izomban. Ez ellentétes a két fehérje rostokban történ nagy arányú együttes kifejez désével a gyors-lassú ill. lassú-gyors izomtranszformáció során. A magyarázat az lehet, hogy az adaptáció során lejátszódó átalakulások viszonylag hosszú folyamatában a SERCA2a kifejez dés képes követni a lassú miozinét. Kulcsszavak: vázizom, SERCA2a, miozin, Ras, kalcineurin-nfat E23 Lítium és galaktóz metabolizmus Miseta Attila, Strassz András, Nagy Tamás és T kés-f zesi Margit Laboratóriumi Medicina Intézet, OEC, ÁOK, Pécsi Tudományegyetem, Pécs A lítium a mániás depressziós megbetegedések kezelésében a gyakran használt hangulatstabilizáló gyógyszer. Hatásmechanimusa részben ismeretlen. A legelterjedtebb hipotézis szerint az inozitol foszfatázok gátlása útján fejti ki hatását. Az utóbbi években el térbe került a glikogén szintáz kinázra kifejtett gátló hatása is. Hat éve fedeztük fel, hogy egy Saccharomyces cerevisiae sejtvonal, melyben az összes PGM aktiviás 90% -ért felel s PGM2 gént töröltük, 6-9szer több kalciumot akkumulál a megnövekedett plazamamembrán kalcium átereszt képességének betudhatóan galaktóz jenlétében. Változik a kalcium ionokhoz kötött jelátvitel is. Glükóz jelenlétében hasonló változást nem láttunk. A glükóz-1 foszfát (G1P) szint jelent sen emelkedett a PGM2 hiányos sejtvonalban galaktózon, de a glükóz-6-foszfát (G6P) szint lényegesen nem változott. Egy második a foszfofruktokináz m ködését akadályozó mutáció (PFK2 deléció) segítségével elértük, hogy a (G6P) szint is kompenzatórikusan emelkedett a kett s PGM:PFK mutánsban galaktózon. Ebben a mutánsban a kalcium ion homeosztázisával összefüggésbe hozható fenotípus jegyek jelent sen enyhültek. Újabb méréseink szerint hatását a PMC1 Ca2+-ATP-ázra gyakorolt közvetlen stimuláló hatás révén alakul ki a fokozott kalcium kompartmentalizáció. Mivel a lítium ismerten gátolja a PGM a m ködését, teszteltük a lítium hatását S. cerevisiae-n, szövetkultúrákban és Wistar patkányokban. Azt találtuk, hogy a lítium hatás a fent leírt, a PGM2 génhiányos fenotípusokhoz hasonlókat eredményez: azaz emelkedett G1P-t, fokozott kalcium felvételt és 4-6szor megnövekedett sejt kalcium tartalmat mértünk. Lítiummal kezelt hím Wistar patkányokban jelent sen emelkedik a PGM aktivitás az agyban, váz és szívizomban valamint a májban. Ugyancsak emelkedett PGM aktivitást mértünk izolált patkány trigeminus ganglionokban és Jurkat sejtekben. A különböz szöve- 45