Doktori tézisek. Erdélyi Péter. Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Átírás

1 Valdecoxib analógok tervezése, szintézise és biológiai vizsgálata Doktori tézisek Erdélyi Péter emmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola Témavezető: Dr. Mátyus Péter, Dc, egyetemi tanár Hivatalos bírálók: Dr. Wölfling János, Dc, egyetemi tanár Dr. Bátori ándor, PhD, kutatási osztályvezető zigorlati bizottság elnöke: zigorlati bizottság tagjai: Dr. Tekes Kornélia, Dc, egyetemi tanár Dr. ovák Lajos, Dc, egyetemi tanár Dr. Herczegh Pál, Dc, egyetemi tanár Budapest

2 Valdecoxib analógok tervezése, szintézise és biológiai vizsgálata című PhD értekezés tézisei Erdélyi Péter Richter Gedeon yrt., Gyógyszerkémiai Kutatólaboratórium IV. Témavezető: Dr. Mátyus Péter egyetemi tanár, az MTA doktora emmelweis Egyetem, zerves Vegytani Intézet Konzulens: Dr. Fischer János c. egyetemi tanár, Richter Gedeon yrt. Bevezetés A szelektív CX-2 inhibítorok kifejlesztése új terápiás lehetőséget adott a klinikusok kezébe a krónikus gyulladásos kórképek valamint a fájdalom kezelésére. A hagyományos nem szteroid gyulladásellenes készítményekkel (AID) szemben a coxiboktól a fejlesztés irányelveinek megfelelően kedvezőbb mellékhatásprofilt reméltek. A sikeres celecoxib után fejlesztett nagyobb CX-2/CX-1 szelektivitású rofecoxib és valdecoxib (VC) (1. ábra) a nem várt kardiovaszkuláris mellékhatásaik miatt visszavonásra került a piacról. Kutatásaink során megkíséreltünk új, a valdecoxibnál kevésbé szelektív CX-2 inhibítorokat fejleszteni, amelyek kedvezőbb mellékhatásprofillal rendelkezhetnek. H 2 1. ábra. Valdecoxib szerkezete 2

3 Célkitűzés Célunk volt a jelenlegi coxiboknál hatékonyabb új, szabadalmaztatható és gyógyszerré fejleszthető származék előállítása, amely jó orális biohasznosulással, kedvezőbb terápiás szélességgel és mellékhatásprofillal rendelkezik: a coxibok gyomorkárosító hatása ugyan lényegesen alacsonyabb, mint a hagyományos nem-szteroidális gyulladásgátlóké, - amit a celecoxib esetén végzett CLA-study (Celecoxib Long-term Arthritis afety tudy) egyértelműen alátámasztott -, de nem sikerült teljes mértékben kiküszöbölni. A kardiovaszkuláris mellékhatások a rofecoxib és valdecoxib esetében pedig annyira súlyosnak bizonyultak, hogy a további forgalmazásukat megakadályozták. em volt célunk ugyanakkor a celecoxibnál jóval nagyobb CX-2 szelektivitású anyag keresése a cardiovasculáris mellékhatások lehetősége miatt (ami a celecoxibnál még nem vet fel problémákat). A szintetizált vegyületek tervezésénél egyszerű farmakofór modellre, valamint az analóg bázisú gyógyszerkutatás elveire támaszkodtunk. A PhD kutatómunkám a valdecoxib (VC) analógjainak tervezésére, előállítására és farmakológiai vizsgálatára fokuszál. Módszerek Az irodalomból ismert szelektív CX-2 inhibítorok több vegyületcsoportba sorolhatóak, ezek közül az egyik legnépesebb az ún. triciklusos vegyületcsalád. Az irodalomban leírt triciklusos CX-2 specifikus ligandumok szerkezeteit figyelembe véve az alábbi farmakofór modellt állítottuk (2. ábra). 3

4 X B C A 2. ábra. Egyszerűsített farmakofór modell a triciklusos szelektív ciklooxigenáz-2 inhibítorokhoz Az általunk tervezett és szintetizált analógok az alábbi általános képlettel foglalhatóak össze (3. ábra). R 1 R2 R 3 3. ábra. Az előállított vegyületek általános szerkezeti képlete Az analógok többsége szulfonamid vagy -hidroxiszulfonamid funkciós csoporttal rendelkezik, de kisebb számban vizsgáltuk ezek különböző származékait valamint a metánszulfonil 4

5 csoportot tartalmazó vegyületeket is. Fontosnak tartottuk vizsgálni a karakterisztikus csoport szubsztitúciós helyzetének a CX-1 és CX-2 gátlására kifejtett hatását, ezért néhány esetben a farmakofór modelltől eltérő analógok is készültek. Az elkészült vegyületeket táblázatban foglaltuk össze (1-3. táblázat). zulfohidroxámsav analógok Vegyület R 1 R 2 R HH -H -CH 2 F -H -H 2 -H - 2 -HH -CH 2 F -H -H 3-2 -HH -H - -H -F 4 -H - 2 -HH - -H -H 5-2 -HH -H - -F -H 6-2 -HH -H - -H -H 7-2 -HH -H - i Pr -H -H 8-2 -HH -H -CH 2 - -H -H 9-2 -HH -H -CH 2 H -H -H 10 -H - 2 -HH -CH 2 H -H -H 1. táblázat. zulfohidroxámsav analógok 5

6 zulfonamid analógok Vegyület R 1 R 2 R H 2 -H -CH 2 F -H -H 12 -H - 2 -H 2 -CH 2 F -H -H H 2 -H - -H -F H 2 -H -CH 2 H -H -H H 2 -H - -F -H H 2 -H - i Pr -H -H H 2 -H -CH 2 - -H -H valdecoxib - 2 -H 2 -H - -H -H 2. táblázat. zulfonamid analógok 6

7 vegyület Egyéb analógok R 1 R 2 R 3 H 18 -H - -H -H 19 H H 2 -H - -H -H 20 H H -H - -H -H H 2 -H H 2 - -H - -H - -H - -H H - -H 25 -H - -H H 3 C Ca 26 -H - -H -H 27 H -H - -H -H 28 H H -H - -H -H 3. táblázat. Egyéb analógok 7

8 A tervezett analógokat az alábbi kémiai reakciókkal állítottuk elő (4. ábra). H R 3 H 2 H.HCl LDA v. nbuli -78 C HCl/THF forr. a KH/toluol forr % i. b H karbonsav anhidrid v. észter 36-53% ii. c 48-76% iii. X 1 Cl X 2 ahol X 1 és X 2 = H X 1 = H és X 2 = H R 3 R 3 X 1 = H és X 2 = H 2 R 3 v. X 1 = Me és X 2 = H X 1 = H és X 2 = X 1 H 3 Cl e-4 f-4 X 2 d DKM forr. iv. Cl R 3 vi. X 2 X 1 R 3 és R 3 = Me, Et, ipr, CH 2 H, CH 2 t Bu, CH 2 F = H, F = H, F, e-3 f-3 4. ábra. A szulfohidroxámsav és szulfonamid analógok, valamint származékaik előállítása A fenti reakciószkéma kiindulási anyagát a szubsztituált dezoxibenzoint (a) Friedel-Crafts acilezéssel vagy Umpolung kapcsolással szintetizáltuk (5. és 6. ábra). A metánszulfonil csoportot tartalmazó analógok a metilszulfanil csoport oxidációjával kerültek előállításra (7. ábra) 8

9 Cl 2 /DKM n l H forr. vii. m Cl AlCl 3 /DKM 80% vii. 5. ábra. zubsztituált dezoxibenzoin előállítása Friedel-Crafts acilezéssel a F o H TMC DKM/ZnI C 100% ix. F p TM H C Br q LDA/THF -60 C x. TM F C r ah/víz 70 % xi. F a 6. ábra. zubsztituált dezoxibenzoin előállítása umpolung kapcsolással H 3 C H 2 2 /a 2 W 4 MeH 0-5 C xii. s t 7. ábra. A metiltio-csoport oxidációja metánszulfonillá 9

10 Az elkészült valdecoxib analógok közül a farmakológiai vizsgálatokon leghatékonyabbnak talált -hidroxi-valdecoxib (6) a valdecoxib ismert első fázisú metabolitja instabil vegyületnek mutatkozott, és a tárolás során a megfelelő szulfonsavvá bomlott. A stabilitási problémát a vegyület kristályos monohidrát formájának előállításával sikerült megoldanunk (8. ábra). 8. ábra. A 6.H 2 röntgenkrisztallográfiával meghatározott szerkezete A szintetizált valdecoxib analógok biológiai hatékonyságát in vitro és in vivo farmakológiai módszerekkel, illetve modelleken vizsgáltuk. Az in vitro TMPD vizsgálatokkal kívántuk megerősíteni, hogy az adott analóg hatása valóban a megfelelő molekuláris targeten, vagyis a ciklooxigenáz enzim gátlásán alapul-e. Az in vivo mérésekkel pedig a CX-gátlók biológiai funkcióinak megfelelően a várt analgeziás és gyulladáscsökkentő hatásokat kíséreltük meg kimutatni és mennyiségileg meghatározni. Az analógok közül egyedül az -hidroxi-valdecoxib monohidrát (6.H 2 ) mutatott a valdecoxibéval egyenértékű vagy azt meghaladó in vivo farmakológiai hatékonyságot. 10

11 Farmakokinetikai mérésekkel meghatároztuk a 6.H 2 fontosabb metabolitjait és farmakokinetikai paramétereit. Eredmények Kutatómunkánk során 28 valdecoxib analógot terveztünk és állítottunk elő. Ezek közül az -hidroxi-valdecoxibot (6) farmakológiai tulajdonságai alapján fejlesztésre emeltük ki. Az előállítást követően szükségessé vált a vegyülettel kapcsolatos stabilitási problémák megoldása a kémiai szintézisbe illesztett aszkorbinsavas szabadgyök mentesítő eljárással, valamint a kristályos monohidrát (6.H 2 ), a monoizopropil-alkohol és a monodioxán szolvátok képzésével. A szintetizált valdecoxib analógok közül 11 vegyület rendelkezik jelentős (>90% 10 M-os koncentrációnál) CX-2 gátló aktivitással (6, 7, 8, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 22, 24 vegyületek). Az -hidroxi-valdecoxib monohidrát (6.H 2 ) szelektivitása és in vitro hatékonysága igen kis mértékű a valdecoxibéval összevetve (4. táblázat). Vegyület Human rekombináns CX-2 Juh CX-1 CX-1/ CX-2 szelektivitás IC 50 ±.E.M., μm valdecoxib 0,04 ± 0, H 2 1,1 ± 0, ± táblázat. A valdecoxib és a 6.H 2 a CX-2 és CX-1 enzimekre vonatkozó IC 50 értékei és a szelektivitásuk mértéke Az in vivo farmakológiai vizsgálatok szerint a szintetizált analógok közül csak az -hidroxi-valdecoxib monohidrát (6.H 2 ) mutatott figyelemre méltó hatékonyságot (5. táblázat). 11

12 In vivo farmakológiai vizsgálatok PQ indukált akut fájdalom gyulladás/fájdalomcsillapító hatás egéren CA indukált ödéma teszt gyulladásgátlás 6 óránál CA. indukált mechanikus hiperalgézia 2 óránál akut modell subkrónikus modell CA indukált termikus hiperalgézia gátlás 3 óránál CA indukált mechanikus allodínia gátlás 30 percnél CA + kaolin indukált monoarthritis gyulladás /fájdalomcsillapító hatás 2 óránál Ecetsavval indukált vaszkuláris permeábilitás gátlás egéren Dózis mg/kg p.o H 2 VC hatékonysága hatékonysága ED 50 = 3,8 mg/kg ED 50 = 15,5 mg/kg ED 50 = ED 50 = 0,59 0,37 mg/kg mg/kg 65% 51% 64% 37% 10 84% 79% 30 62% 69 % 10 77% 62% ED 50 = ED 50 = 22,1 39,9 mg/kg mg/kg 12

13 5. táblázat. A 6.H 2 és a valdecoxib biológiai hatékonyságának összehasonlítása A 6.H 2 az izolált nyúlszíven végzett vizsgálatok szerint jelentős mértékben növelte a koronáriaáramlást, amelyre kifejtett hatása dózisfüggő. A valdecoxib ugyanakkor nem volt kimutatható hatással a koronáriaáramlásra. Mind a p.o. mind az i.v. adott -hidroxi-valdecoxib monohidrát (6.H 2 ) patkányban az marc enzimek hatására képes valdecoxibbá redukálódni, amely az ismert metabolikus útvonalán részben visszaalkulhat -hidroxi-valdecoxibbá (I) (12. ábra). Az - hidroxi-valdecoxib (6) nitrogén-oxid kibocsátása utján szulfinsavvá (M1) alakul, amely tovább oxidálódik a megfelelő szulfonsav származékká (M2). Következtetések Az -hidroxi-valdecoxib monohidrát (6.H 2 ) kémiailag stabilis vegyület a nem hidratált vagy szolvatált szulfohidroxámsavval szemben, így ipari fejlesztése megoldható. Az -hidroxi-valdecoxib (6) sztöchiometrikus szilárdfázisú asszociátumokat képez különböző oldószerkkel. A vegyület ezen tulajdonsága, valamint a kémiai szintézisében alkalmazott szabadgyökmentesítő eljárás járul hozzá a kívánt kémiai stabilitás kialakulásához. Előzetes farmakokinetikai vizsgálataink alapján az - hidroxi-valdecoxib metabolizmusára az alábbi utat javasoljuk (9. ábra). 13

14 H H I. H 2 marc CYP3A4 -hidroxi-valdecoxib (6) Valdecoxib II. kibocsátás H H xidáció zulfinsav származék (M1) zulfonsav származék (M2) 9. ábra. A 6.H 2 javasolt metabolizmusa a valdecoxib és a szulfinsav (M1) irányába A javasolt metabolikus megfontolásra alapozva megállapítható, hogy az -hidroxi-valdecoxib monohidrát (6.H 2 ) a valdecoxib pro-drugja, amely in vivo az marc enzimek hatására aktiválódik. Az -hidroxi-valdecoxib monhidrát (6.H 2 ) számos in vivo farmakológiai teszten (5. táblázat) hatékonyabbnak bizonyult a 14

15 valdecoxibnál, annak ellenére, hogy csak igen gyenge CX-2 gátló képességel és CX-1/CX-2 szelektivitással (1,1 M vs. 0,04 M, illetve 88 vs. 3930) rendelkezik. Ez a tulajdonsága és az akut hiperalgézia modellen mutatott elhúzódó hatása megfelel a pro-drug elvének. aját publikációk jegyzéke Folyóiratcikkek az értekezés témájában Péter Erdélyi, Tamás Fodor, Ágnes Kis Varga, Mátyás Czugler, Anikó Gere, János Fischer, Chemical and biological investigation of -hydroxy-valdecoxib: An active metabolite of valdecoxib, Bioorg. Med. Chem., 2008, 16, IF.: 3,075 (2008) Antje Havemeyer, anja Grunewald, Bettina Wahl, Florian Bittner, Ralf Mendel, Peter Erdelyi, Janos Fischer, and Bernd Clement, Reduction of -hydroxy-sulfonamides including -hydroxyvaldecoxib (-hydroxy-4-[5-methyl-3-phenyl-4-isoxazolyl]- benzenesulfonamide) by the molybdenum-containing enzyme marc, Drug. Metab. Dispos. 2010, 38, IF.: 3,743 (2009) Egyéb folyoíratcikk György zabó, Balázs Varga, Dóra Páyer-Lengyel, Attila zemző, Péter Erdélyi, Krisztina Vukics, Judit zikra, Éva Hegyi, Mónika Vastag, Béla Kiss, Judit Laszy, István Gyertyán, and János Fischer, Chemical and Biological Investigation of Cyclopropl Containing Diaryl-pyrazole-3-carboxamides as ovel and Potent Cannabinoid Type 1 Receptor Antagonists, J. Med. Chem, 2009, 52, IF.: 4,898 (2008) 15

16 zabadalom az értekezés témájában Fischer, Janos; Fodor, Tamas; Karpati, Egon; Kis-Varga, Istvanne; Levai, andor; Erdelyi, Peter; Zajerne Balazs, Maria; Gere, Aniko, ovel-hydroxy-4-(3-phenyl-5-methyl-isoxazole-4-yl)-benzenesulfonamide solvates for dosage forms, PCT Int. Appl. W A2 27 Jan 2005, 28 pp. (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Rt., Hung.) Egyéb szabadalmak Fischer, Janos; Vukics, Krisztina; Erdelyi, Peter; Hegedues, Bela; Tihanyi, Karoly; Vastag, Monika; Levai, andor; Balint, andorne; Lanczos, Krisztina, Pharmaceutical compositions containing atorvastatin salts with amino acids, PCT Int. Appl. W A1 9 ct 2003, 30 pp (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Rt., Hung.) Vukics, Krisztina; Fischer, Janos; Levai, andor; Erdelyi, Peter Process for the synthesis of mosapride citrate dihydrate, PCT Int. Appl. W A2 24 Dec 2003, 16 pp. (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Rt., Hung.). Fischer, Janos; zemzoe, Attila; Vukics, Krisztina; Erdelyi, Peter; zoeke, Katalin; Donat, Andrea, Process for the preparation of rosuvastatin by new intermediates, PCT Int. Appl. W A2 30 ov 2006, 24pp (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Rt., Hung.) Fischer, János; zemzö, Attila; zabó, György; Erdélyi, Péter; Varga, Balázs; Gyertyán, István; zikra, Judit; Vastag, Mónika, ovel CB1 agonists and their preparation, PCT Int. Appl. W 2008/ A1 26 Jun 2008, 43 pp (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Rt., Hung.). 16