Doktori (Ph.D.) értekezés Keresztury László

Átírás

1 Az MHC rendszer molekuláris genetikai vizsgálata, eredményeinek felhasználása a származás-megállapításban, a populációgenetikában és a csontvelő transzplantációban Doktori (Ph.D.) értekezés Keresztury László SEMMELWEIS EGYETEM DOKTORI ISKOLA A humán molekuláris genetika és géndiagnosztika alapjai Program Témavezető: Dr. FALUS ANDRÁS egyetemi tanár Semmelweis Egyetem Genetikai, Sejt - és Immunbiológiai Intézet és Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet Immungenetikai Osztály Budapest, 2001

2 2 Mónikának, Rebekának és Marcellnak

3 Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK...3 ÖSSZEFOGLALÁS...5 SUMMARY BEVEZETÉS CÉLKITŰZÉSEK IRODALMI HÁTTÉR A HUMÁN GENOM A humán genom szerveződése A humán genom polimorfizmusai A FŐ HISZTOKOMPATIBILITÁSI GÉNKOMPLEX (MHC) Az MHC nevezéktana Az MHC vizsgálatában alkalmazott módszerek VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS MÓDSZEREK VIZSGÁLATI MINTÁK Populációs minták Speciális csoportok vizsgálati mintái NAGY MOLEKULASÚLYÚ, GENOMIÁLIS DNS IZOLÁLÁSA ÉS KONCENTRÁCIÓ-MÉRÉSE Izolálás kisózással Lahiri-Nurnberger -módszer A DNS-oldat koncentrációjának és tisztaságának meghatározása optikai denzitásméréssel ALKALMAZOTT MÓDSZEREK VNTR-alapú restrikciós fragmenshossz polimorfizmus vizsgálata hibridizációs "assay" módszerrel HLA-A2 szubtipizálás PCR-ARMS módszerrel A HLA-C-lókusz polimorfizmus-vizsgálata PCR-SSO technikával Származás-megállapítási ügyekben alkalmazott PCR-vizsgálatok TAP1 és TAP2 polimorfizmusok kimutatása STATISZTIKAI SZÁMÍTÁSOK A VNTR-alapú RFLP vizsgálatok eredményeinek statisztikai értékelése A populációgenetikai számításokkal kapcsolatos fogalmak Az Arlequin populációgenetikai szoftver (Ver ) Származás-megállapítás, Essen-Möller értékek EREDMÉNYEK A VNTR LÓKUSZOK VIZSGÁLATÁNAK EREDMÉNYEI Populációgenetikai tesztek A két VNTR lókusz öröklődése, családvizsgálatokkal bemutatva A HLA-A2 ALLÉL TIPIZÁLÁSÁNAK EREDMÉNYEI A HLA-C TIPIZÁLÁS EREDMÉNYEI Az IHW és CTP sejtvonalak tipizálásának eredményei Populációk statisztikai vizsgálatai A csontvelőátültetés előtti donor-recipiens párok vizsgálati eredményei A SZÁRMAZÁS-MEGÁLLAPÍTÁSI VIZSGÁLATOK EREDMÉNYEI Kizárások Nem kizárásos apasági ügyek AZ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA MEGBESZÉLÉS...67

4 7. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE...75 AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ ELŐADÁSOK, POSZTEREK... Hiba! A könyvjelző nem létezik. 9. IRODALOMJEGYZÉK

5 Összefoglalás Az MHC rendszer molekuláris genetikai vizsgálata, eredményeinek felhasználása a származásmegállapításban, a populációgenetikában és a csontvelő transzplantációban Keresztury László Témavezető: Dr. FALUS ANDRÁS egyetemi tanár, igazgató Semmelweis Egyetem,Genetikai, Sejt - és Immunbiológiai Intézet, Országos Haematológiai és Immunológiai Intézet, Immungenetikai Osztály A származás-megállapítási vizsgálatokban alkalmazott HLA-tipizálást az 1990-es évek elejétől az MHC génkomplex, az örökítő anyag szintjén megnyilvánuló polimorfizmus vizsgálatai egészítik ki. Ezek az eljárások betegellátáshoz kapcsolódó molekuláris biológiai vizsgálatok szerves részét képezik, nélkülözhetetlen adatokat szolgáltatva a csontvelőbetegek és donoraik vizsgálatában. Az MHC I osztályba tartozó HLA-A lókusz HLA-A2 alléljének a szubtípus vizsgálatait végeztük el random normál populációs mintával. Elkezdtük a HLA-C lókusz polimorfizmusainak molekuláris biológiai módszerekkel végrehajtott vizsgálatait. A vizsgálatokat két földrajzi régióból származó és a hazai népességet reprezentáló mintákkal, továbbá szerológiai módszerrel HLA-ABDR egyezőnek bizonyult csontvelő donor-recipiens párokkal végeztük el. Megkezdtük a TAP fehérjék kódoló szekvenciáiban detektálható polimorfizmusok vizsgálatát. A vérminták és buffy coat minták DNS-tartalmát ún. kisózásos módszerrel izoláltuk. A HLA-A2 allél szubtípusai közül a HLA-A*0201 (96.4%) és a HLA-A*0205 (3,6%) szubtípust mutattuk ki. Az allél funkcionális jelentősége, továbbá az egyes országok és népcsoportjaik közötti szubtípusgyakorisági eltérések további, populációgenetikai felmérések szükségességét igazolják. A HLA- C lókusz molekuláris biológiai vizsgálatokkal kapott eredményeinek értékelése alapján a mintacsoportok -HLA-C allélgyakorisági értékeik alapján - belesimulnak az európai átlagba, noha a három csoport allélgyakorisági értékei között eltérések mutatkoztak. A csontvelőbetegek és donoraik szerológiai és molekuláris biológiai módszerekkel kapott eredményeiben 87%-os eltéréseket találtunk. Minden allélt kimutattunk; a heterozigótaság mértéke 90% feletti lett. Két VNTR-lókusz RFLP-módszerrel végzett vizsgálatát végeztük el random normál hazai populációs mintával. E vizsgálatok helyett az igazságügyi gyakorlatban már STR-vizsgálatokat alkalmaznak. A TAP polimorfizmusok megkezdett vizsgálatai a jövőben módosított kondíciók mellett folynak tovább. 5

6 Summary Molecular genetic examination of the MHC and application of its results in parentage, population genetic surveys and bone marrow transplantation László Keresztury Supervisor: Dr. András FALUS Professor and Chairman Department of Genetics, Cell- and Immunobiology, Semmelweis University National Institute of Haematology and Immunology HLA-typing in paternity cases has been applied and completed with examination of DNA polymorphisms of MHC at the level of DNA from the beginning of the 1990s. These methods are in close connection with molecular biology examinations related to medical attendance providing indispensable data in the examination of donor-recipient pairs in bone marrow transplantation. The examination of HLA-A2 alleles of HLA-A locus from Class I HLA was carried out with healthy unrelated Hungarians, at random. We launched the examination of the HLA-C loci polymorphisms with the molecular biology method. The identification of polymorphisms of HLA-C locus was set up with two geographically isolated Hungarian populations, and a control group. In addition to this, serologically HLA-ABDR matched bone marrow donor-recipient pairs were examined at HLA-C locus, previously. The identification of DNS sequence-polymorphisms of TAP proteins was set up. The DNA content from nucleated cells of anticoagulant blood samples and buffy coat samples was extracted with salting-out method. The HLA-A*0201 (96.4%) and HLA-A*0205 (3,6%) subtypes were identified from the extremely polymorph allele A2 of our sample group. Additional population genetic surveys should be considered the functionally important allele HLA-A2 and detectable polymorphisms in different ethnic groups are considered. On the basis of our results: the allele frequencies of above mentioned populations merge with the average European results, in spite of the fact that there were some minor alterations between the groups. The serologically HLA-ABDR matched donor-recipient pairs indicated 87% difference from with PCR-based method in HLA-C locus. There were no null (blank) alleles; the heterozigousity was above 90%. Two VNTR loci examinations were carried out and the data evaluation was accomplished. These methods have been replaced by STR-methods in the field of jurisdiction. The examintions of TAP polymorphisms which we have been started will be continued under modified conditions. 6

7 Az értekezésben előforduló rövidítések jegyzéke ARMS dntp Et-Br GvHD HLA HSP IHW MHC MKK MKP v K NBT NIH PCR P v RE RFLP SSC SSO SSP STR VNTR "amplification refractory mutation system" deoxinukleotid keverék ethidium-bromid "graft versus host" betegség humán leukocita lókusz A hősokk fehérje "International-Histocompatibility Workshop" "Major histocompatibility complex", fő hisztokompatibilitási génkomplex "Mutter-Kind-Konstellation", Anya-gyermek haplotípus-konstelláció "Mutter-Kind-Präsumptivvater-Konstellationen", Anya-gyermek-vélelmezett apa haplotípus-konstelláció "Nitroblue-tetrazolium" - só " National Institute of Health (US)" Polimerizációs láncreakciós technika (in vitro) "Präsumptivvater", vélelmezett apa Restrikciós enzim "restriction fragment length polymorphism", restrikciós fragmens hosszpolimorfizmus Standard saline citrate "sequence-specific oligonucleotide", szekvencia-specifikus oligonukleotid "sequence-specific primer", szekvencia-specifikus primer "short tandem repeats", rövid, tandem ismétlődő egységek "variable number of tandem repeats", változó számú, tandem ismétlődő egységek 7

8 1. Bevezetés A származás-megállapítási vizsgálatokban nélkülözhetetlen a megbízható, természettudományos eszközökkel kapott reprodukálható eredmények felhasználása [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7]. E vizsgálatok a hasonló tulajdonságaik alapján karakterizálható, öröklődő jellegekre irányulnak, valamint azokra, amelyek az adott populációban rendkívül változatos formában jelennek meg, azaz nagyfokú polimorfizmus jellemzi őket. A polimorfizmus-vizsgálatok az 1970-es évek közepéig a géntermékek szintjén kimutatható "genetikai sokféleséget" vizsgálták: az 1960-as években az egyes vércsoport-rendszerek [8] kb.20-, az 1970-es évek közepéig a szérum-proteinek elektroforetikus vizsgálatai mintegy 30 marker detektálását tették lehetővé. A laboratóriumi vizsgálati módszerek fejlődése révén, az 1970-es évek közepétől már az örökítő anyag, a DNS vizsgálatát is lehetővé tette: a restrikciós fragmenshosszpolimorfizmus vizsgálatokkal (RFLP) közel , az ismétlődő fragmensek kópiaszámának kimutatásával (mini- vagy mikroszatelliták) számú egyedi különbséget adó allél detektálható. Az RFLP módszert követő, majd azt egyre inkább felváltó, polimeráz láncreakción (PCR) alapuló módszerek bevezetése forradalmasította a molekuláris biológiai vizsgálatokat és azok alkalmazását. A humán genom szerkezetének feltérképezésével [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18] párhuzamosan, közvetlenül a genetikai örökítő anyag polimorfizmusának vizsgálatával, rendkívüli mértékben gyarapszik az ismert, funkcionális jelentőségü gének és allélek száma. Az emberi genom egy ezredét kitevő, rendkívül polimorf, fő hisztokompatibilitási génkomplex (MHC) szerológiai módszerekkel végzett vizsgálata [19] hazánkban 1979 óta tartozik a származás-megállapítási vizsgálatok bizonyítási eljárásai közé [20]. Ezeknek az eljárásoknak azonban határt szab a vizsgált antigének meghatározására szolgáló ellenanyagok korlátozott specificitása, az egyes típusok epitópjainak hasonlósága, valamint - pl. egyes HLA antigének esetében - korlátozott mértékű sejtfelszíni megjelenése. A meglevő eljárások molekuláris biológiai módszerekkel történő bővülésével lehetővé vált egyrészt az egységesnek tűnő szerológiai HLA típusok valós sokféleségének megismerése, a - gyenge sejtfelszíni kifejeződése miatt kevésbé feltárt - HLA-C lókusz polimorfizmusának felmérése, az újabb és újabb, a hisztokompatibilitásban szerepet játszó 8

9 terméket kódoló gének kimutatása és -vizsgálata. Másrészt - a különböző orvosi beavatkozások következményeiként - bizonyossá vált, hogy a polimorfizmusok jelentős része funkcionális jelentőséggel bír. Az MHC génkomplex polimorfizmusainak az ismerete nélkülözhetetlen az orvosi gyakorlatban: a szerv- és szövetátültetés során a recipiens számára a tőle - az adott genetikai rendszerben - legkevésbé eltérő donor kiválasztásában, az immunreaktivitás folyamatának - és bizonyos, főként autoimmun betegségek patomechanizmusának megértésében. Az egészségügyi laboratóriumi gyakorlatban alkalmazott módszerek felhasználhatók továbbá a származás-megállapítási eljárásokban, hiszen segítségükkel - a populációs adatok tükrében - megadható az apaság valószínűsége, illetve igazolható a biológiai apa személye. 9

10 2. Célkitűzések Jelen értekezésben az MHC polimorfizmusok vizsgálatában alkalmazható molekuláris genetikai módszerek bővítéséről, az I. osztályú HLA lókuszok vizsgálatára szolgáló módszerek beállításáról, valamint az eredmények populációgenetikai értékeléséről számolunk be. Ezek a vizsgálatok illeszthetők a meglevő laboratóriumi infrastruktúrához, szervesen kapcsolódnak az egészségügyi ellátás gyakorlatába, továbbá alkalmazhatók a származás-megállapítási eljárások során A leggyakoribb HLA-A allél, a HLA-A2 szubtípusainak kimutatására szolgáló módszer(ek) alkalmazásával vizsgálni kívántuk a magyarországi népesség allélmegoszlását A HLA-C lókusz alléljeinek kimutatására szolgáló molekuláris genetikai módszerek beállításával a hazai népességben detektálható HLA-Cw* allélek kimutatása volt a célunk, melynek funkcionális jelentősége a következő vizsgálandó terület lesz a hazai laboratóriumi gyakorlat számára Egyéb, az MHC régióban kódolt funkcionális molekulák (pl. LMP, TAP) polimorfizmus-vizsgálatának keretében - jelen munkában - a TAP fehérjéket kódoló DNS régió polimorfizmusainak vizsgálatát kezdtük meg További, az MHC-régión kívül eső polimorf lókuszokat vizsgáltunk, amelyek különbözőek lehetnek azonos HLA típusú személyeknél. Ennek keretében random választott, normál populációs mintán kettő, a magyarországi gyakorlatban még nem használt VNTR-lókuszt vizsgáltunk RFLP módszerrel Az újonnan beállított módszerekkel random választott, normál populációs mintán és kiemelt, homogén csoporton vizsgáltuk a detektált HLA-lókuszok és a két VNTRlókusz allélgyakoriságait. 10

11 2.6. Az említett módszerekkel bővített molekuláris biológiai vizsgálatokat beépítettük a Magyarországon alkalmazott, szerológiai módszerrel végrehajtott HLA-tipizálás származás-megállapítási gyakorlatába A beállított módszereket alkalmaztuk az optimális donor-recipiens megfeleltetéshez a csontvelő-átültetést megelőzően A populációgenetikai eredmények kiértékeléséhez megfelelő statisztikai programot állítottunk be. 11

12 3. Irodalmi háttér 3.1. A humán genom A humán genom szerveződése A genom a (haploid vagy diploid) sejtek teljes örökítőanyag-mennyisége (DNStartalom) a sejtmag és a mitokondriumok DNS-állományából áll. A gének a genom alig 10%-át alkotják. A maradék, ún. nem kódoló szekvenciák pszeudogéneket, génfragmenteket, intronokat, egyedi, kis kópiaszámú szakaszokat, valamint transzkripcionálisan inaktív, változó erősséggel ismétlődő, szakaszokat foglal magába [21, 22]. A tandem-ismétlődő elemek [23] közé sorolhatók a kromoszómák centromerikus és telomerikus régióinak megaszatellitái, szatellitái, továbbá a mini- és mikroszatellitái A humán genom polimorfizmusai Amennyiben egy genetikai jelleg vagy lókusz alléljeinek megjelenési gyakorisága valamely populációban alacsonyabb, mint 0.99, az adott jelleg vagy lókusz polimorfizmusáról beszélünk. (a) A mutáció történhet a gének exonjában, a lókusz azonos hosszúságú, de eltérő nukleotid sorrendű alléljeit létrehozva. A polimorf gének tipikusan 2-6 allélváltozattal rendelkeznek. A (neutrális) mutáció a géntermék térszerkezetében nem okoz funkcióváltozáshoz vezető módosulást (pl. izoenzimek): az allélok elektroforetikus vizsgálatokkal, izoelektromos fókuszálással különíthetők el. Különös jelentőségűek azonban azok a DNS-polimorfizmusok, amelyek az általuk kódolt géntermékek a szervezet számára kulcsfontosságú funkcionális eltéréseit határozzák meg. (b) A genomiális DNS valamely restrikciós enzimmel történő hasítása során eltérő hosszúságú fragmensekre esik szét. A polimorfizmusok ezen típusát restrikciós fragmenshossz polimorfizmusnak (restriction fragment length polymorphism; a továbbiakban: RFLP) nevezzük. Az egyedi különbségeket restrikciós enzimek (a továbbiakban: RE) felismerési hasítóhelyeiben (recognition site) kialakuló, egy-egy bázist érintő mutációk (deléció, inszerció, szubsztitúció) okozzák. Amennyiben ezek a humán genonom teljes hosszában, sorban ismétlődő (tandem repetitív) DNS szekvenciák egy-egy szegmentjében, vagy azok határoló régióiban történnek, az 12

13 adott ún. változó számú, tandem-ismétlődő lókusz (variable number of tandem repeats; a továbbiakban: VNTR) [24] eltérő hosszúságú allélváltozatait kapjuk. Ezeket a miniszatellitáknak is nevezett, a kromoszómák telomerikus régióinak nemkódoló szakaszaiba csoportosuló lókuszokat 9-64 bázispár (tovább: bp) méretű magszekvencia (ún. core-unit ) változó számú tandem ismétlődései jellemzik. A miniszatelliták mellett ismertek rövid tandem-ismétlődések (short tandem repeats; a továbbiakban: STR), vagy mikroszatelliták. A tri-, tetranukleotidok tandem ismétlődéseinek a száma néhánytól több tucatig terjedhet. Az STR-ek populációban jelentkező allélszáma (lókusztól függően) 5-20-ig terjedhet. E - fenotípusos eltérést többnyire nem okozó - hipervariábilis genetikai jellegek a polimorfizmus vizsgálatok szempontjából azonos értékűek a fehérje-polimorfizmusokkal A Fő Hisztokompatibilitási génkomplex (MHC) A 6. kromoszóma rövid karján (6p21.3) található az emberi genom (egyik) legnagyobb genetikai polimorfizmussal jellemezhető, mintegy négymillió bázis hosszúságú, erősen konzervatív nukleotid sorrendű komplexe. Az immunrendszer működésének egyéni variációi mögött három nagy gén-csoportban (MHC I, -II, -III) kódolt, eltérő funkciójú fehérjék nélkülözhetetlen, funkcionális eltérései húzódnak [25]. Az MHC I- és MHC II osztály ún. klasszikus MHC-génjei által kódolt, fő szövetösszeférhetőségi antigéneket nevezik HLA (human leukocyte locus A; továbbiakban: HLA) antigéneknek. Az MHC-fehérjék - az immunrendszer működése szempontjából - nélkülözhetetlen intracelluláris- és sejtfelszíni peptidreceptorok. Nem képesek a szervezet számára tolerálható illetve nem tolerálható (antigénnek tekintendő) peptidek közötti különbségtételre, csak azok kötésére. Alapvető szerepük az "immunológiai saját" determinálása, a T-sejt repertoár kialakítása az MHC-peptid-komplexek révén és a nem-sajátként azonosított sejtek, fehérjék T- sejtek általi felismerése. 13

14 Szerkezet és funkció: Az MHC I osztályú molekulák A szervezet magvas sejtjein és a trombocitákon megjelenő heterodimer MHC I glikoproteinek 5 doménből felépülő α- (nehéz-)láncának felszínén, az α1-és α2- domének által kialakított, zárt peptidkötő zsebek találhatók. Ide kötődnek az endogén eredetű fehérjék degradációjából származó, rövid peptidek (e folyamat fontos elemei az MHC II osztály régiójába tartozó gének által kódolt, a TAP1 és TAP2 szállítófehérjék). Az allélvariánsok a peptidkötő helyek aminósav-sorrendjének eltérő változatait hordozzák. HLA I I osztály régiója Szerkezet és funkció: Az MHC II osztályú molekulák Az MHC II molekulát két, egymással nemkovalens módon kapcsolódó, heterodimer szerkezetű polipeptidlánc alkotja. A α-láncot kódoló DA és a polimorfabb β-láncot kódoló DB gének a kromoszóma centromerje és az MHC I lókuszok között, a HLA-D régióban helyezkednek el, DPA/DPB-, DQA/DQB- és DRA/DRB-láncokat kódoló szub-régiókat alkotva. A 4-4 doménnal rendelkező, MHC II glikoproteinek exogén eredetű peptideket kötő régióit az α1-β1 doménpár alakítja ki. 1. sz. ábra : Az MHC génkomplex géntérképe HLA III osztály régiója HLA I osztály régiója HLA GÉNKOMPLEX 14

15 Az MHC nevezéktana [26] A szerológiailag meghatározható HLA I. osztály transzplantációs HLA-A, -B, -C lókuszok által kódolt antigénjeit, valamint a limfociták által felismert HLA-D régió lókuszai által determinált antigéneket nagy betűvel, alléljait arab számokkal jelöljük (pl. HLA-A19). Ha ezek némelyike a későbbiekben egyedi specificitásokra, alegységre (split) bomlik (pl. A29, A30, A31, A32 stb.), az eredeti, szélesen" reagáló (broad) antigén száma, annak utóbb meghatározott split -je utáni zárójelben szerepel: pl. "HLA-A29 /19/". A molekuláris biológiai módszerekkel meghatározott HLA I osztályú lókuszok nehézláncát kódoló gén egyik allélja: pl. HLA-A*01. Ennek szubtípusa további két számmal bővül: pl. HLA-A*0101. Az MHC II-régió alléljainak és szubtípusainak nevezéktana hasonló, pl. a DR lókusz β- könnyűláncának a génje: HLA-DRB1, míg egyik allélját kétjegyű számmal jelöljük: HLA-DRB1*13; szubtípusa további két számmal bővül: HLA-DRB1*1301. A DR géncsoport egyetlen DRA génje (egyféle típusú α- láncot kódol) és a négy átíródó DRB gén - DRB1, DRB3, DRB4, DRB5 - a következő struktúrában alkotja a heterodimereket: a DRA és DRB1 gének kódolta fehérjék a HLA-DR1 és HLA-DRw18 közötti antigéneket hordozzák. A DRA és DRB3 géntermékei a DR52 antigént, a DRA és DRB4 a DR53 antigént, a DRA és DRB5 a DR51 antigént fejezik ki. A HLA-DQA és HLA-DQB antigéneket a DQA1 és DQB1 gének határozzák meg. A HLA-DP régió szerkezete hasonló. Az azonos kromoszómán elhelyezkedő, mendeli öröklésmenet szerint, kodomináns módon, kapcsoltan öröklődő jellegeket nevezzük haplotípusnak: az utódok fenotípusa a négy szülői haplotípus kombinációja Az MHC vizsgálatában alkalmazott módszerek A HLA-antigének szerológiai módszerrel történő meghatározásának 1964-től [27] alkalmazott gyakorlata a limfocita-citotoxicitási teszt [28]. A molekuláris biológiai vizsgálatokban alkalmazott hibridizációs analízis az azonosítandó (target) DNS szakasz és az alkalmazott (jelzett) DNS próba között létrejövő 15

16 heteroduplex detektálásán alapul. Ehhez vagy darabokra hasítjuk az izolált, genomiális DNS mintát restrikciós enzimmel (RE) [29], vagy egy kitüntetett rövid szakaszának mennyiségét in vitro, polimeráz láncreakcióval (PCR) (Mullis, Cetus Corp. 1985) felszaporítva tesszük alkalmassá a vizsgálatokra [30, 31]. Az RFLP vizsgálati módszerek alkalmazásakor az izolált, genomiális DNS minta [32] RE-mel történő hasítása (ún. emésztés) után a kapott fragmensek agaróz-gélben [33, 34] történő, méretszerinti frakcionálása [33, 34] következik. A fragmensek relatív helyzetét transzferálással szilárd hordozóra (nylon membrán) rögzítjük (Southern 1975.). A keresett (target) DNS-szekvencia helye és mérete a membránra juttatott, jelzett próbával becsülhető [35, 36, 37]. A genom VNTR lókuszainak vizsgálatában még igen, de az egyes MHC gének polimorf intronjainak (pl. HLA-DRB, -DQA,-DQB) vizsgálatában már nem alkalmazzák. A PCR módszerek alkalmazásakor a denaturált DNS-mintához oligonukleotid primerpárt adva, a DNS-target eredeti mennyisége több cikluson keresztül jelentősen növelhető [38, 39, 40, 41, 42, 43]. PCR-SSO (szekvencia-specifikus oligonukleotid) - hibridizáció A PCR amplifikáció termékének SSO-technikával végzett hibridizálásával allélek és allélcsoportok különíthetők el [45]. A PCR termék egy kiemelt lokusz minden allélját (generikus amplifikáció) tartalmazza, vagy csak egy alcsoportját (csoport-specifikus amplifikáció). A HLA I. osztály esetében a hipervariábilis régiókat hordozó első és második domént kódoló 2. és 3. exont kell amplifikálni. A HLA-A, -B, -C gének analízise során a PCR termékeket jelentős számú (a HLA-A gén esetében 50, a HLA-C gén esetében 39) szekvencia-specifikus oligonukleotiddal kell hibridizálni. Lókusz-specifikus primerek alkalmazása teret nyitott -többek között- a HLA-A2 és a HLA-B27 allélek szubtípusainak gyors meghatározásához. A HLA II. osztály analízisében a polimorf első domént kódoló 2. exon amplifikálása történik. Az első (generikus) PCR-termékekkel a HLA-DR, -DP, -DQ gének alacsony 16

17 felbontású, a második csoport-specifikus amplifikálással a HLA-DRB1, -DPB1,-DQB1 gének termékeinek nagy felbontású tipizálása lehetséges. A próbák hibridizációja történhet membránra kötött PCR-termékekkel (dot-blot) és fordítottan, membránra kötött próbákhoz hibridizálva a PCR-termékeket (fordított dotblot). Az első esetben egyszerre több egyén (PCR-termékek) párhuzamos tesztelését végezhetjük el; a fordított dot-blot viszont egy személy komplett multiallél-teszt eredményét kapjuk egyetlen hibridizációval. PCR -SSP (szekvencia-specifikus primer) amplifikáció A reakció az enzimatikus primer-hosszabbodás specificitásán alapul: csak akkor következik be, ha DNS-minta tartalmazza a vizsgálandó szekvenciamotívum-párhoz tervezett primerek 3'-végével komplementer DNS-szekvenciát. Pozitív reakció esetén a PCRtermék meghatározott méretű sávként azonosítható az agaróz gélben [46, 47, 48, 48, 49]. A HLA-A, -B, -C és a HLA- DR, -DQ, -DP gének tipizálása és szubtípusainak a meghatározása lehetséges. PCR-ARMS ("amplification refractory mutation system")-módszer A HLA-A2 allél szekvencia-specifikus vizsgálatában a PCR-SSP módszer speciális változatát alkalmaztuk: az első PCR reakcióval amplifikált lókusz vagy csoportspecifikus amplifikáció terméke szolgál a következő, allélspecifikus, differenciáló PCRreakció templátjául. Az amplifikáció csak abban az esetben következik be, ha a templátként használt vizsgálandó DNS tartalmazza a primernek megfelelő célnukleotid sorrendet [49, 50]. A normál primer a mutáns templáthoz nem kötődik, PCR-termék nem képződik. A vizsgált DNS-szakaszban bekövetkezett egy bázispár változás, illetve kisebb deléciók kimutatása lehetséges. A TAP1-, TAP2 -gének polimorfizmusainak vizgálatában két, 3 végződésében eltérő, komplementer szekvenciájú, allél-specifikus primert alkalmaztunk. A normál primer 3 -terminális végének nukleotid szekvenciája a normál DNS-el komplementer, a mutáns primer 3 -terminális végének nukleotid szekvenciája a mutáns DNS-el komplementer (Newton 1989) [51, 52, 53, 54]. 17

18 A kimutatható allélek száma MHC I. osztály MHC II. osztály tipizálási módszerek A B C DRB1 DQA1 DQB1 DPA1 DPB1 szerológiai molekuláris biológiai táblázat: A HLA lókuszok szerotipizálással és molekuláris biológiai módszerekkel kimutatható alléljeinek áttekintő táblázata (forrás: Detektálás Közvetlen (ethidium-bromid) festés A DNS tartalmú fragmensek gélbeni lokalizációja közvetlenül meghatározható ethidiumbromid (Et-Br) festék alacsony koncentrációban történő használatával. A DNS-festék komplex hatékony UV-fényelnyelése miatt már rendkívül kis DNS mennyiség (kb. 2 ng) is látható. Kemilumineszcens jelzés [55] A közvetlen jelölés (Lifecodes) esetén az RFLP vizsgálatokban alkalmazott próbák NICE ) tartalmazzák az alkalikus foszfatázt. A szubsztrátot (a Lumi-Phos 480 vagy CDP-Star ) hibridizálás után kell a rendszerhez adni. A PCR vizsgálatokban a membránra kötött PCR-termékhez (dot-blot) már alkalikus foszfatázzal jelölt próbákat hibridizálunk. Ehhez kell a szubsztrátot (a Lumi-Phos 480 vagy CDP-Star ) adni. Az alkalikus foszfatáz dioxetán szubsztrátjának kémiai reakciója röntgenfilmen láthatóvá tehető fényemissziót (477 nm) okoz (Bronstein és mtsai 1990,1991). 18

19 4. Vizsgálati minták és módszerek 4.1. Vizsgálati minták A minták kiválasztása egyrészt a beállítandó vizsgálati módszereknek megfelelően történt, másrészt egyes célkitűzések alapján speciális csoportokat állítottunk Populációs minták A HLA-A2 allélgyakoriság meghatározására a 12. IHWS antropológiai szekciójában [56] magyar populációként jellemzett és vizsgált 126 random kiválasztott, egymással rokonsági kapcsolatban nem álló egészséges személy DNS mintájából olyan 55 személy mintáját használtuk, akik HLA-A2 pozitívnak bizonyultak. A HLA-C lókusz vizsgálataihoz használt minták kiválasztása és a mintagyűjtés a "The Biological History of European Populations" program keretében, dr. Tauszik Tamás vezetésével történt. A Káli-medencében 5 apró település lakosságának közel 20%-ától (70 személy) és a Duna-Tisza közében elhelyezkedő Ópusztaszer és Pusztaszer, valamint a környező kisebb települések lakosságának mintegy 15%-ától (45 személy) gyűjtöttek (10 ml heparinos, 10 ml citrátos) vérmintát. Az összes minta vércsoportszerológiai, valamint szerológiai módszerrel végzett HLAvizsgálatai után csak azokat a személyeket vizsgáltuk tovább, akiknek a családja több évszázada él az adott régióban. Az egyenesági leszármazottak esetében kizártuk a gyermeket. Testvérek, unokatestvérek esetében random választottuk az egyik személyt. Ilyen előzmények után a molekuláris biológiai vizsgálatokhoz 46 Káli-medencében élő és 32 Ópusztaszerről és környékéről származó személy vérmintáinak DNS tartalmát izoláltuk. Kontrollként 44 random kiválasztott, normál magyarországi népességhez tartozó személy vérmintáját dolgoztuk fel. A PCR-SSO technika kontrolljaként 15 jól karakterizált nemzetközi sejtpanel-mintát használtunk: az IHWC (International Histocompatibility Workshop Cell) panelből 6 típust [57], a Cell Ter Panel-ből 9 típust. 19

20 A populációgenetikai értékelés során az általunk feldolgozott minták eredményeit a Magyar Csontvelődonor Regiszter (Hungarian Bone Marrow Donor Register, HBMDR) adatbankjához (n =2090, december) hasonlítottuk. Az RFLP vizsgálatok beállításához az Országos Vérellátó Szolgálat pécsi és debreceni regionális központjaiból kapott 132 random kiválasztott mintát használtunk: 71 db vérmintát és 61 db "buffy coat" mintát Speciális csoportok vizsgálati mintái Teljesen HLA-egyező rokon donorral nem rendelkező, csontvelő transzplantációra szoruló betegek és szerológiai módszerrel vizsgálva HLA-A, -B, DR egyezőnek bizonyult donoraik kivizsgálása során a II. osztályú allélek szubtípusbeli (DRB1, DQB1, DPB1) összehasonlítása rutinszerüen megtörténik (az átültetés sikeressége és a DNS szintű egyezés mértéke közötti összefüggések elemzése). Ezt a vizsgálatkört kiegészítendő meghatároztuk minden elérhető donor-recipiens pár HLA-Cw és A2 szubtípusát. Első csoportban 61, a későbbiekben 76 donor-beteg összehasonlítást végeztünk. Az apasági ügyek molekuláris biológiai vizsgálataihoz néhány ml (Na-citrát antikoaguláns-tartalmú) vérminta szükséges. Kétséges esetekben, amennyiben a szerológiai vizsgálatok eredménye nem kielégítő, a további vizsgálatokhoz a szerológiai meghatározáshoz használt vérminták maradék limfocitáiból preparált DNS használható. Az értekezésben 12 apasági ügyet dolgoztunk fel. A TAP polimorfizmusokat 50 DNS-mintával vizsgáltunk Nagy molekulasúlyú, genomiális DNS izolálása és koncentrációmérése Izolálás kisózással [58] Az alvadásgátolt (10 ml) vérmintát 1 x ELB (vörösvérsejt-lízis) puffer hozzáadásával (30-40 ml) óvatosan keverve inkubáltuk (10 perc), centrifugáltuk (5 perc, 2000 rpm). A felülúszó eltávolítása után az eljárást megismételtük. Az üledéket 1 x PBS-ben (20-25 ml) reszuszpendáltuk, centrifugáltuk (10 perc, 2000 rpm). A felülúszó óvatos leöntése után az üledéket 1 x PBS-ben (6 ml) reszuszpendáltuk; 3 x fehérvérsejt-lízis puffert (3.3 20

21 ml), proteináz-k enzimet (35 μl) adtunk hozzá és óvatosan keverve inkubáltuk (56 C, 180 perc). A szobahőmérsékletűre hűtött mintát NaCl (3.0 ml, 4 C-os, 6N) hozzáadásával erősen összeráztuk, a kicsapódott fehérjét centrifugáltuk (10 C, 30 perc, 2000 rpm). Az üledékről óvatosan leválasztottuk a felülúszót, melynek DNS-tartalmát (10-15 ml) propanollal kicsaptuk. Eppendorf csőben a csapadékot etanollal (650 μl, 70 %) óvatosan öblítettük, centrifugáltuk (2-5 perc, rpm). Az alkoholt leöntöttük, a DNS mintát hagytuk szobahőmérsékleten megszáradni vagy Speed-Vac-ban szárítottuk, majd megfelelő mennyiségű ultratiszta vízben oldottuk. A DNS koncentrációt az optikai denzitás (OD 260nm ) értékének mérésével 1-2 μg/μl koncentrációjúra állítottuk. Szükséges oldatok: 10x ELB (vörösvérsejt-lízis) puffer(ph 7.4): 1.55 M NH 4 Cl, 0.10 M KHCO 3, 0.01 M EDTA. 3x fehérvérsejt-lízis puffer: 1,8% DTT /dithiotreitol); 6,0 % SDS; 30,0 mm Tris-HCl; 30,0 mm EDTA; 300,0 mm NaCl (tárolás: -20ºC-on) 10x PBS: 2,70 mm KCl; 137,0 mm NaCl; 1,50 mm KH 2 PO 4 ; 7,75 mm Na 2 HPO 4 Proteináz-K enzim oldat: - Proteinase K 10 mg/ml (tárolás -20 C -on) Lahiri-Nurnberger -módszer [59] Az alvadásgátolt (400 μl, 0,5 M Na 4 -EDTA 6-8ml mintához) vérmintát "TKM-1 puffer" (5 ml), Nonidet P40 (125 μl) hozzáadása és rövid keverés után centrifugáltuk (10 perc, 2000 rpm). Az enyhén opálossá váló oldatot "TKM-1"-ben (5 ml) átmostuk, centrifugáltuk (10 perc 2000 rpm). Az üledéket "TKM-2 puffer" ben (800 μl) reszuszpendáltuk, 10 %-os SDS-ben (50 μl) keveréssel inkubáltuk (10 perc 55 o C). NaCl (300 μl, 6 N, 4 C) hozzáadásával erősen összeráztuk, centrifugáltuk (10 perc, rpm). A felülúszó DNS tartalmát azonos mennyiségű propanollal kicsaptuk. Centrifugálás (4 C, 10 perc, rpm) után a csapadékot etanolban (1.0 ml, 70%-os, -20 C) mostuk, centrifugáltuk (2 perc, rpm). Az alkohol leöntése után a DNS mintát Speed-Vac-ban szárítottuk, majd megfelelő mennyiségű (kb μl) ultratiszta vízben oldottuk. Szükséges oldatok: 21

22 TKM 1 (ph 7,6): 10mM Tris HCl (ph 7,6); 10mM KCl; 10mM MgCl 2 ; 2mM Na 4 EDTA. TKM 2 (ph 7,6): 10mM Tris HCl (ph 7,6); 10mM KCl; 10mM MgCl 2,; 2mM Na 4 EDTA; 400 mm NaCl. A Laihri-Nurnberger -módszert 50 buffy coat minta DNS tartalmának izolálásában használtuk; a maradék 11-et kisózásos módszerrel dolgoztuk fel. A citráttal alvadásgátolt vérminták feldolgozása kizárólag kisózásos módszerrel történt. Az izolált DNS mintákat 4 C -on (néhány hétig) illetve -20 C -on (néhány hónapig) tároltuk. Az izolált DNS minőségének ellenőrzése Az izolált DNS oldatának kb. 5%-át hozam (yield-) gélen (0.7%-os agaróz gél) vizsgáltuk. A jó minőségű, nagy molekulasúlyú DNS a felvitel helyéhez közel marad, kissé elhúzódva a pozitív sarok felé. Homogén szerkezetében sávok nem láthatók A DNS-oldat koncentrációjának és tisztaságának meghatározása optikai denzitásméréssel A spektrofotometriás koncentrációmérés előtt a DNS-mintákat 37 C-os vízfürdőben homogenizáltuk (60 perc), és 1:20 hígításokat készítettünk (15 μl oldat 285 μl desztillált vízzel). Az OD 260 értéket a hígítási faktorral (20), valamint a 260 nm egy egységének 1 ml ében az 50 μg DNS-t jelző, mennyiségi értékével (50) szorozva (= OD 260 x 1000) az oldat koncentrációját (μg/ml) kapjuk. Megfelelő minőségű preparátum esetében a két hullámhossz (A 260 / A 280 ) mérési értékhányadosa: Ha a DNS és fehérje aránya 50-50%, a hányados értéke:1, Alkalmazott módszerek VNTR-alapú restrikciós fragmenshossz polimorfizmus vizsgálata hibridizációs "assay" módszerrel A "Lifecodes OUICK-LIGHT Paternity Identity Kit" protokoll általunk kidolgozott módosításaival. Emésztés restrikciós enzimmel 22

23 A DNS-minták emésztéséhez Providencia stuartii baktériumból izolált Pst I restrikciós enzimet alkalmaztunk, mely enzim a rá specifikus hasítóhelyen a genomiális DNS-t 4096 bp (4 6 ) méretű, ragadós végű fragmensekre vágja. Az enzim hasítóhelyének palindrom mintázata: CTGCAG. Az emésztés végrehajtására szolgáló oldatok összetételét az izolált DNS minták koncentrációját és mennyiségét figyelembevéve állítottuk össze. Emésztendő DNS-minta mennyisége Pst I enzim 10x H puffer BSA (10U/μl) 5 μg DNS emésztése 30μl térfogatban 3 μl 3 μl 0.3 μl 10 μg DNS emésztése 50μl térfogatban 5 μl 5 μl 0.5 μl 20 μg DNS emésztése 100μl térfogatban 10 μl 10 μl 1 μl 2. táblázat: A restrikciós enzimmel végrehajtott emésztés kondíciói A 37 C-os vízfűrdőben egy éjszakán át folytatott emésztést kelátképző (12.5 mm) EDTA hozzáadásával, vagy fagyasztóba (-20 C) helyezéssel állítottuk le. Az emésztettséget 1x TAE-val készült 0.7%-os agarózon ellenőriztük, amelybe dermedés (60 C) előtt μl ethidium-bromidot (Sigma, 5 mg/ml) pipettáztunk. A minták (12 μl térfogatban: 5 μl emésztett DNS, 4 μl 2x loading -puffer, 3 μl ultratiszta vízzel kiegészítve), az emésztettségi-kontroll és a PstI teszt gél standard (10-10 μl) futtatása V/cm feszültséggel, 45 percig történt. Értékelés Az enzimaktivitásra az emésztési kontroll (DNS-t tartalom: 500 ng) utalt; az emésztettség megítélését a Pst teszt-gél standard mutatta (fluoreszcens intenzitása 500 ng - 1 μg mennyiségű, emésztett DNS mennyiségének felel meg). A fragmensek méret szerinti szétválasztása: Gélkészítés: Üveglapot (16x20 cm) szalaggal (1.8 cm, 3M autoclave-type) ragasztottunk körbe, amelybe 1x TAE-val készült 0.8% agarózt (Sigma A 9539, RRO ; 36 C, vagy Sigma A-6877, type II medium EEO) öntöttünk. Dermedés (60 o C) előtt a gélbe (300 μl) 23

24 ethidium-bromidot kevertünk. [Fésűk (20 minta felviteléhez) 13x6x3 mm/fog, 12 mintához: 11x7x1mm/fog]. A minták (45μl térfogatban: 35 μl emésztett DNS, 7 μl 6x-loading -puffer, ultratiszta vízzel kiegészítve) mellé (10-10 μl) Combination -, Visual -, továbbá (20 μl) Sizing -standardot is felvittünk a gélre futtatáshoz. Az elektroforézis 1,6 V/cm feszültséggel 16 órán át történt. Oldatok: 6x loading puffer: 15 % Ficoll (Type 400), 0.25 % bromofenolkék, 0.25 % xylenecyanol FF 10 x TAE ph 8.0 (2000ml): 96.8 g Tris, 8.2g bórsav, 7.44g EDTA A DNS fragmensek szilárd hordozón rögzítése: Az emésztés során képződött és az agaróz gélelektroforézissel szétválasztott fragmenseket alkalmassá kell tenni szilárd hordozóra történő replika-készítéshez. Az első lépésben depurinálás (10 perc, 1.5 N, HCl) történt, utána a gélt desztillált vízben leöblítettük. Következett a denaturálás (30 perc 1.5 M NaCl és 0.5 M NaOH oldatban), majd ismét desztillált vízben öblítettük. Az eljárást neutralizálással (30 perc, 1.5M NaCl, 0.5 M Tris és M EDTA tartalmú oldatban, ph 7.5) fejeztük be. A kapilláris transzferálás (Southern 1975): A 20 x SSC-t (500 ml) tartalmazó tálcára üveglapot (21x29 cm) helyeztünk. Erre 2db - végeivel a tálcába lógó-, előzőleg 20 x SSC-ben megnedvesített szűrőpapír-"híd" (18 x 32cm) került. A felső oldalával lefelé fordított, 20 x SSC-vel locsolt gélre 3 x SSC-be áztatott nylon-membránt (Hybond -N+ nylon, Amersham Life Science) és 3 db szűrőpapírt (15x18 cm) simítottunk. Az egészet folpack fóliával borítottuk, amely gél feletti négy oldalán hármat bemetszve ablakocskát nyitottunk a negyedik oldalra visszahajtva. Erre kerültek a pontosan illesztett, méretre hajtogatott papírtörölköző lapok, majd egy üveglap, amelyre nehezékeket tettünk. (Végeztünk transzferálást vákuum-rendszerrel is: a nylon membránt a tálca porózus lemezére simított, 20 x SSC-ben nedvesített, Whatman szűrőpapírra borítottuk. Vékony gumimaszkkal fedtük, amelybe előzőleg az agaróz-gél méreténél kisebb ablakot vágtunk; peremfedéllel leszorítottuk. A gélre-gumimaszkra folyamatosan csorgatott 20 x 24

25 SSC a tálca alján levő szívó-csonkon jelentkező vákuumhatásra szívódik a tálcába, és magával viszi a DNS fragmenseket a membránra). A DNS fragmensek membránra kötése: a membrán hőkezelésével (szűrőpapírok között, vákuum kemencében 60 perc, 80 C kp/cm 2 ) majd UV fénnyel (kb. 10 perc, 254 nm, 15 cm-ről kb W/cm 2 ). A membránokat zárt műanyag-tasakban, 4 C -on tároltuk. Oldatok, szükséges anyagok: 20x SSC (standard saline citrate): 3 M NaCl, 0.3 M Na-citrát (ph 7.0) Szűrőpapírok : (transzferáláshoz) Whatman 3 MM (cat. No ), (szárításhoz) Macherey-Nagel (MN) 813 A hibridizálás Alkalmazott próbák: A restrikciós enzimmel emésztett genomban az SLI 1335 próbával (NICE Paternity Probe) a D1 S339 polimorf VNTR-t, az SLI 1090 próbával (NICE Paternity Probe) a D6 S132 polimorf VNTR-t lehet kimutatni (NICE -Cellmark Diagn., Abingdon, UK- Chemiluminescent Probes, Lifecodes Corp.Stamford, USA). ( D1 S339(CEB3): az 1. kromoszóma rövid karján (1p36) található, központi szekvenciája 33 bázis hosszúságú (dr. Ivan Balázs személyes közlése). D6 S132 (CEB8): a 6. kromoszóma hosszú karján (6q27) található, központi szekvenciája 33 bázis hosszúságú (dr. Ivan Balázs és dr. Gilles Vergnaud [60] személyes közlése) A K 562 sejtvonal sávtartománya, Pst I restrikciós enzimmel emésztve a D6 S132 lókuszban: kb; Hae III enzimmel a D1 S132 lókuszban: kb (mindkettőnél ± 1.8%). Detektálás A kötődött, alkalikus foszfatázzal jelzett próbák detektálása Lumi-Phos 480 (Lumigen Inc., Southfield, Michigan U.S.A.) vagy CDP Star (Tropix Inc, Bedford, USA) kemiluminescens szubsztrátokkal történt. (webmaster@lumigen.com, marketing@lumigen.com). A módszer végrehajtásának megkezdése előtt a hibridizáló-, mosó I- és II-oldatokat 55 C-on 65 percig (rázó vízfürdőben) előmelegítettük. 25

26 A hibridizáló hengerbe hajtogatott membrán mosó II oldattal való inkubálása (10 perc 20 C-on) után a gyártó által javasolt mennyiségű próba-oldatot (1 μl/ml hibridizáló oldat) pipettáztunk az előmelegített hibridizáló oldatba, és a hibridizálást 55 C-on, 20 percig végeztük hibridizáló szekrényben. Az eredeti leírást módosítva a membránt mosó I és - II oldatokkal (2x10 perc ill. 2x20 perc 55 C), majd 1 x Quick-Light pufferrel öblítettük le (6x 20 C-on). Kemilumineszcens detektálás Lumi-Phos 480 szubsztráttal, valamint CDP Star szubsztráttal végrehajtott folyamat megegyezik a HLA-C lókusz vizsgálatában leírtakkal. A membránokat (néhány hétig) zárt műanyag fóliában 4 C-on tároltuk. Rehibridizálás Hosszabb tárolás előtt a membránról eltávolítottuk az előző hibridizálás reagenseit, s vagy megszárítva 4 C -on tároltuk, vagy újabb hibridizálásnak (rehibridizálás) vetettük alá. Amennyiben az alkalmazott szubsztrát a Lumi-Phos 480 volt, az előző hibridizálás reagensei forró mosó II oldattal távolíthatók el (65 C, 30 perc), majd a már említett hibridizálással folytatható. A CDP Star szubsztrát esetén a membránt 0.1 %-os SDSben kell öblíteni (15 perc, 80 C), majd az ezt követő hibridizálásig 1 x SSC-ben kell áztatni HLA-A2 szubtipizálás PCR-ARMS módszerrel [vö. Irodalmi áttekintés] A normál primer a mutáns templáthoz nem kötődik, PCR-termék nem képződik. A HLA-A2 allél szekvencia-specifikus felszaporítása két egymást követő PCR reakciólépéssel történik. Az elsőben alkalmazott 4 primerkeverék lehetővé teszi az identifikálás első lépését: a felszaporított 813 bp méretű DNS szakasz tartalmazza az összes HLA-A2 allél 2. és 3. exonját. Tekintettel azonban arra, hogy kevés HLA-A2 allél tartalmaz különleges szekvencia-motívumokat, a következő PCR reakció során az előző reakció terméke szolgál templátként. Az egymáshoz nagyon hasonló szubtípusok azonosítása a második, ún. 26

27 "nested" PCR-reakció során alkalmazott 19 szekvencia specifikus primerkeverékkel (SSP) lehetséges. [61, 62, 63, 64, 65, 66, 67]. Kizárható a többi HLA-I osztályú allél szekvencia-motívumainak zavaró jelenléte és lehetőség nyílik az egymáshoz nagyon hasonló szubtípusok azonosítására 1) PCR reakció Az első PCR reakciókhoz 8-8 μl 33A, 34A, 35A, 36A primerkeveréket mértünk be vizsgálati mintánként a PCR csövekbe. A minták párolgását 20 μl paraffinolajjal akadályoztuk meg. Az alábbi keverékből minden csőbe 13 μl-t tettünk: 19.5 μl (dd) H 2 O, 0.75 μl (=150ng) DNS-minta, 7.5 U (1.5 μl) Taq-polimeráz enzim 39 μl TDMH (A2-PCR-mixkeverék). (Az I. reakcióhoz szükséges reakcióelegy összetétele: 494 μl 10x PCR puffer (670mM Tris, 166 mm ammóniumszulfát, 1% Tween 20), 35 μl dntp keverék (25 mm), 395 μl MgCl 2 (25 mm),, 976 μl dd H 2 O (össztérfogat: 1900 μl).) Az első négy PCR-reakció ciklusainak a paramétereit a 3. sz. táblázatban közöljük. A PCR reakciók termékeit agarózgél-elektroforézissel (1.5-2 %-os, 1x TBE pufferrel) mutattuk ki, párhuzamosan futtatva a bázispár felbontású molekulasúlymarkerral. (10μl termékhez 3μl Orange G-festék vagy "2x-loading" puffert adagoltunk). A 256 bp méretű belső kontroll (az emberi növekedési hormont kódoló génszakaszból) a PCR ciklusok hatékonyságát jelzi. Paraméterek Ciklus szám o C Perc perc mp mp Szükséges reagensek: mp Orange G festék: 0.5 % Orange G, 20 % mp Ficoll, 100 mm EDTA (futási sebessége mp eltér a PCR-termékekétől) mp 2 x loading puffer: 250 μl glicerin, 50 μl perc krezolvörös, 700 μl (dd) víz 3. táblázat: Az 1. PCR-ciklusok paraméterei 27

28 "Nested" (2.) PCR-SSP reakciók PCR-ciklusok: Paraméterek Ciklus szám o C Perc perc mp mp mp mp mp mp mp perc 72 1 perc perc Az előző sorozat 33A jelű PCR-termékeiből 10 μl-t 100-szorosra higítottunk, majd ebből a higított termékből, mint templátból a következő - második PCR reakció reakcióelegyéhez 7,5 μl-t mértünk. A további 19 reakcióhoz μl specifikus primerkeverékeket mértünk be mintánként a PCR csövekbe. A zavaró párolgás gátlása érdekében 20 μl paraffinolajjal fedtük a reakcióelegyet. Az alábbi keverékből 8 μl-t mérünk minden csőbe (49 μl (dd) H 2 O, 7.5 μl (100x) DNSminta) 2.7 μl Taq-polimeráz, 93 μl TDMH=A2-keverék). 4. táblázat: A 2. ("nested") PCR -ciklusok paraméterei A PCR termék ellenőrzése: agarózgélen (ld. az 1. PCR reakció után). A PCR-ciklusokat Perkin-Elmer 9600 thermocyclerben végeztük. A reakcióelegyekhez vékony falú 0.2 ml PCR csöveket használtunk. Értékelés: A PCR reakciók termékeit 2% agarózgélen futtattuk. Az adott specifikus pozitív reakciók mintázata alapján adható meg a vizsgált minta HLA-A2* szubtípusa. 28

29 A HLA-A*0201 szubtípus I. PCR reakciók M 11 34A 35A 36A M 01A 02A 03A 04A 05A 06A 07A 08A09A10A11A12A13A 14A 15A 16A 17A 18A 19A M II. PCR reakciók 2. sz. ábra: Az 1.és 2. PCR-reakciók termékei az A*0201 szubtípus esetében (M.: molekulasúly-marker; a további adatok az alkalmazott primereket jelölik) A HLA-C-lókusz polimorfizmus-vizsgálata PCR-SSO technikával A vizsgálatot az eredeti Quick-Type (Lifecodes Corp.) használati utasításainak általunk kidolgozott módosításaival hajtottuk végre. Amplifikáció Végrehajtása 50μl végtérfogatban történt, amely 2,5-2.5 µl C 1 és C 2 primert, ng μg/μl koncentrációjú DNS-t, valamint 2.5 unit Dupl-A-Taq Taq DNS- 29

30 polimeráz enzimet (5U/μl) és PCR-keveréket (5 μl 10xPCR puffer, 5 μl, 2,5mM a négy dntp-ből) tartalmazott. A PCR ciklusok: kezdő denaturáció 60mp, 96 o C, majd 32 ciklusban 30mp 95 o C, 60mp 65 o C anneláció, 180mp 72 C extenzió, végül 10 perces extenzió 72 o C-on. A PCR-termék ellenőrzése 2% agarózgél-elektroforézissel történt. A sikeres reakciót a 904 bp (ún. "house-keeping" génszakaszból) méretű termék jelenléte igazolja. Szilárd hordozóra rögzítés (replika-készítés) Nylon membránra (Hybond -N+) az amplifikált mintákat - 12x8 mintázatban, több sorozatban - az alábbi módon rögzítettük: A 10 x SSC-ben nedvesített, majd szobahőmérsékleten szárított membránokra (120-80mm) 96db, 2-4 μl amplifikált mintát szárítottunk. A membránokat denaturáló, membrán-öblítő oldatban, majd 2 x SSC-ben öblítettük és szárítottuk (RT). A DNS fragmentek membránra kötése vakuum kemencében történt: 60 perc, 80 C, kp/cm 2. Utána felső megvilágítású UV fénnyel (254 nm) kezeltük (10 perc, W/cm 2 ). Tárolás: nylon-tasakba zártan, 4 C-on. Hibridizálás A membránokat - a gyártó utasításainak módosításaival - 39 db, alkalikus foszfatázzal konjugált SSO-próbával (a gyártó által mellékelt oldatokkal) hibridizáltuk. Az eljárást kétféle módon végeztük: A 12x8 db mintát tartalmazó membránokat 12 db, egyenként 8 db mintát tartalmazó csíkra vágtuk, majd 2 ml 2 x SSC-ben áztattuk (RT, 5 perc). Ezt leöntve a membráncsíkokat 2 ml, 2 μl - a 39 db próba valamelyikét tartalmazó - előmelegített (45 C) hibridizáló-oldatban hibridizáltuk (30 perc, 45 C). Utána a csíkokat (2 ml) 2 x SSC-ben leöblítettük (5 perc, RT), majd (2-3 ml) előmelegített TMAC-ban (60 C, 30 perc) mostuk. Végül a csíkocskák (2 ml) 2 x SSC-ben (5perc, RT), majd 1 x QIUCK-LIGHT pufferban (4-6 x 20 ml, 1-1 perc) történő áztatása következett. A fenti eljárást a membránok csíkokra vágása nélkül, megfelelő mennyiségű oldatokban végeztük el. Kemilumineszcens detektálás (Lumi-Phos 480, illetve CDP-Star szubsztrátokkal). Az előhívó fóliára helyezett membránt applikátorral Lumi-Phos 480-al permeteztük. 30

31 A membránokat először CDP-Star -assay pufferben (RT, 10 perc), majd CDP-Star - koncentrátum 1:100 higítását tartalmazó CDP-Star -assay pufferben inkubáltuk (RT, 5perc). A membránokat ún. előhívó fóliába zártuk, majd filmkazettába helyezett röntgenfilmre (DuPont Cronex 4 (medical X-ray film) helyeztük. Az expozíció a Lumi-Phos 480 esetén perc, a CDP-Star esetén perc volt. Az értékelést táblázat segítségével végeztük. Rehibridizálás (újra-hibridizálás) Lumi-Phos 480 szubsztrát esetén: A membránokat előmelegített mosó I oldatban 45 percig 65 C -on kell öblíteni, majd az eljárás hibridizálással folytatódhat. CDP-Star szubsztrát esetén: hibridizálás előtt a membránokat 0,1 % SDS-ben mozgatva (15 perc 80 C) -, majd 1 x SSC-ben kell öblíteni. Az eljárás hibridizálással folytatódhat. Szükséges oldatok, reagensek: 1 x TBE (Tris-borát puffer) ph 8.0: 89 mm Tris- HCl, 89 mm bórsav, 2 mm EDTA (ph 8 ) Denaturáló oldat: 0.5 M NaCl, 0.5 M NaOH Membrán-mosó oldat: 0.5 M NaCl, 0.5 M Tris (ph 7,4) CDP-Star assay puffer ( ph 9,5): 10 ml / l MgCl 2 (0.1M), 10.5 ml / l Dietanolamin (98%) TMAC mosó-oldat: 3 M TMAC, 0.1 % SDS Származás-megállapítási ügyekben alkalmazott PCR-vizsgálatok A vizsgálatokhoz a beteg kivizsgáláshoz beállított és használt teljes módszerrepertoárból a legalkalmasabbat választottuk ki, az adott esetben leginformatívabb allél vizsgálatára. A HLA-Cw* allélek kimutatása PCR - SSO módszerrel, a HLA-II osztályú antigének meghatározása PCR - SSP illetve, PCR - reverz dot blot módszerrel történt [68]. Egyéb, nem MHC-polimorfizmus vizsgálat keretében három STR-lókusz detektálása történt: SE 33 (ACTBP2), FGA és vwa. 31

32 TAP1 és TAP2 polimorfizmusok kimutatása (A TAP1 és TAP2 fehérjéket kódoló régió polimorfizmusát elsőként Powis és mtsai (1992) és Colonna és mtsai (1992) vizsgálták. A bevezetésre szánt, kísérleti stádiumban levő módszer - PCR-ARMS - a 12 IHSW [69] keretében került kipróbálásra. Tipizálási módszer Az ARMS technika bármely ismert mutáció/polimorfizmus gyors genotipizálását lehetővé teszi. Alapja, hogy adott paraméterek mellett csak a 3 -vég nukleotidjaiban eltérő primerek nem eredményeznek PCR amplifikációt. Minden PCR reakcióelegyben 4 oligonukleotid - primer - van, melyek közül kettőnek ("sense" és "anti-sense") 3'-vég nukleotidja komplementer a tipizálandó allélekben található dimorf nukleotid egyikével. További 1-1 nukleotidos eltéréseket terveztek mindkét oligonukleotidba a 3'-végtől a specifitás növelésére. A két másik oligonukleotid (egy "sense" és egy "anti-sense") komplementer a dimorf nukleotid két oldalától asszimetrikus távolságra elhelyezkedő szomszédos szekvenciákkal. A PCR reakció egy konstans kontroll terméket eredményez az egy vagy két specifikus termék mellett attól függően, hogy a vizsgált személy homo- vagy heterozigóta (3.sz. ábra). A DNS mintákat (0.4-1,0 μg) 100μl térfogatban amplifikáltuk (0,25-1,0 μg mindegyik oligonukleotid primerből, 200mM dntps, 1x Taq DNS polimeráz puffer és 2U Taq DNS polimeráz enzim). A párolgás megakadályozására, a reakcióelegy felszínére paraffinolajat rétegeztünk. PCR-ciklusok: Ciklus szám Paraméterek o C Perc / / táblázat: A TAP polimorfizmusok vizsgálatai során alkalmazott PCR-ciklusok paraméterei 32

33 PCR-termék azonosítása agarózgél-elektroforézissel (1.5-2,0 %-os, 1x TBE pufferrel), párhuzamosan, bázispár felbontású (5μl) molekulasúly-markerral (φx-174 RF DNA, Hae III digest) futtatva (10μl termékhez 3μl Orange G-festéket vagy "2xloading" puffert alkalmaztunk). A TAP I/1 és I/2 valamint a TAP II/1,-2,-3 allélekkel 50 DNS-mintát vizsgáltunk. A TAP I/1 allél 533 bp méretű kontrollja és a két 351 bp és 241 bp méretű fragmensei 10 esetben, a TAP II/1 allél 427 bp méretű kontrollja és a két 328 bp és 158 bp méretű fragmensei 49 esetben detektálhatók voltak, a minták homozigóta vagy heterozigóta voltától függően. A "workshop- reagens" használatával a vizsgálat-sorozatban résztvevő laboratóriumok túlnyomó többsége nem kapott eredményeket, ezért a vizsgálati rendszer felülvizsgálata vált szükségessé. Ennek a polimorfizmusnak a vizsgálatára ismételt primerszintézis, és/vagy a szekvencia ellenőrzés szükséges. Polimorf helyek Kontroll (bp) 1. reakció 2. reakció TAP1/I (Pozíció: 333) 533 Ile (333) 241 Val (333) C TAP1/II (Pozíció: 637) 429 Asp (637) 307 Gly (637) C TAP2/I (Pozíció: 379) 58 0 C 427 Val (379) 328 Ile (379) 158 TAP2/II (Pozíció: 565) 400 Thr (565) 161 Ala (565) C TAP2/III(Pozíció:665) 58 0 C 408 Thr (665) 141 Ala (665) táblázat: A DNS-alapú vizsglatok reakciói és a vizsgálható polimorfizmusok 158 bp 328 bp 427 bp Kontrol sz. ábra: A TAP 2/1 polimorfizmusok agaróz-elektroforézis felvétele 33